专利名称：通过adr-1基因增加转基因植物对大豆锈菌抗性的方法
通过ADR-1基因增加转基因植物对大豆锈菌抗性的方法本发明涉及在转基因植物和/或植物细胞中增加对大豆锈菌抗性的方法。与不包括重组ADR-1基因的野生型植物相比，所述转基因植物中ADR-1蛋白的含量和/或活性增加。此外，本发明涉及具有增加的对大豆锈菌抗性的转基因植物和/或植物细胞，以及包含与编码功能性ADR-1基因的序列或其片段相同或同源的序列的重组表达载体。农作物的耕种主要用于生产人和动物的食品。特别是当今惯例的单种作物栽培对疾病的流行性传播高度易感。结果是明显减少的产量。到目前为止，主要通过用杀虫剂控制病原生物。目前，直接修饰植物或病原体的遗传倾向的可能性也对人类开放。抗性一般表示植物防止，或至少减少有害病原体的侵扰和建群的能力。在植物用于防止植物病原性生物的建群的天然存在的抗性中可以识别出不同的机制。这类病原体和宿主之间的特异相互作用确定了感染的过程(Schopfer和Brennicke (1999)Pflanzenphysiologie, Spri nger Verlag,柏林-海德堡，德国)。关于宗族特异性抗性，又称为宿主抗性，在相容和不相容相互作用之间有差异。在相容相互作用中，在病毒性病原体和易感植物之间发生相互作用。病原体存活，并可建立繁殖结构，而宿主大部分先后死去。另一方面，当病原体感染植物但在症状的弱发展之前或之后其生长被抑制时，发生不相容相互作用。在后一种情况下，植物对相应的病原体具有抗性(Schopfer和Brennick,见上)。然而,此类抗性是对于某些株或病原体特异性的。在相容和不相容相互作用中，都发生宿主对病原体的防御性和特异性反应。然而，事实上由于病原体的新病毒性宗族的快速进化发展，此抗性通常被克服(Neu等人，(2003)American Cytopathol. Society, MPMI 16No. 7 :626-633)。大部分病原体是植物物种特异性的。这表示病原体可在某些植物物种中诱导疾病，但不在其他植物物种中诱导疾病(Heath(2002)Can. J. Plant Pathol. 24 :259-264)。某些植物物种中对病原体的抗性称为非宿主抗性。非宿主抗性提供对植物病原体的强力、广泛和永久的防护。提供非宿主抗性的基因在非宿主植物中提供对某些疾病的强力、广泛和永久的防护的机会。特别地，此类抗性对病原体的不同株系起作用。真菌分布于全世界。到目前为止，已知约100000种不同的真菌种类。锈菌非常重要。它们可具有复杂的发育周期，具有多达5个不同孢子阶段(不动精子、锈孢子、夏孢子、冬孢子和担孢子)。在病原真菌感染植物的过程中，通常观察到不同的阶段。在植物病原性真菌和其潜在宿主植物之间的相互作用的第一阶段对于真菌的植物建群是决定性的。在感染的第一阶段，孢子附着于植物表面，发芽，真菌穿透植物。真菌可通过已有的入口例如气孔、皮孔、排水器和伤口穿透植物，或者它们由于机械力的作用以及在细胞壁消化酶的帮助下，直接穿透植物表皮。为了穿透植物，发育了特异性的感染结构。大豆锈菌豆薯层锈菌(Phakopsora pachyrhizi)直接穿透植物表皮。在穿过表皮细胞后,真菌到达叶肉的细胞内空间，在此真菌开始在叶中扩散。为获得营养物，真菌穿透叶肉细胞并在叶肉细胞内发育出吸器。在穿透过程中，被穿透的叶肉细胞的质膜保持完整。因此大豆锈菌与大豆建立活体营养型相互作用。活体营养性植物病原性真菌，例如许多锈菌，其营养依赖于植物活细胞的新陈代谢。坏死营养型植物病原性真菌的营养依赖于植物的死细胞。大豆锈菌占据了中间位置，因为它直接穿透表皮，而被穿透的细胞变得坏死。在穿透后，真菌改为专性活体营养生活方式。为本发明的目的，基本遵循此种感染策略的活体营养型真菌病原体的亚群将被称为“半坏死营养型的”。大豆锈病最近已变得日益重要。此疾病可由致病性锈菌豆薯层锈菌(Phakopsorapachyrhizi (Sydow))和山马幢层镑菌(Phakopsora meibomiae (Arthur)导致。它们属于担子菌纲，锈菌目，层锈菌科。两种锈菌都感染多种豆类宿主植物。豆薯层锈菌也称为亚洲锈菌，是对大豆(Glycine max)更具有侵略性的病原体，因此，至少目前，它对农业很重要。豆薯层锈菌可见于世界上几乎全部热带和亚热带大豆种植区域。豆薯层锈菌能在自然条件下感染来自17个科的31种豆类植物，还能在受控制的条件下在另外60种上生长(Sinclair 等人(编)，Proceedings of the rust workshop (1995), NationalSoyaResearch Laboratory, Publication No.1 (1996) ；Rytter J. L.等人，Plant Dis. 87,818(1984))。山马蝗层锈菌(P. meibomiae)已见于加勒比海盆地区和波多黎各，尚未造成实质性破坏。豆薯层锈菌目前只能用杀真菌剂的方法在田地中控制。没有对隔离群的全部谱有抗性的大豆植物。在寻找抗性植物时，发现了 4个介导大豆对豆薯层锈菌抗性的显性基因Rppl-4。抗性迅速丢失，因为豆薯层锈菌发展出新的病毒性宗族。最近几年中，真菌病例如大豆锈病作为病害在农业生产中的重要性增加了。因此现有技术中存在开发控制真菌和提供真菌抗性植物的方法的需求。对感染植物表皮层的白粉菌和霜霉菌进行了大量研究。然而，对付感染叶肉的大豆锈菌的问题仍未解决。
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出乎意料地,发明人发现过表达来自拟南芥的ADR-1基因增加对大豆锈菌的抗性。本发明的目的是提供在转基因植物和/或转基因植物细胞中增加对大豆锈菌抗性的方法。另一个目的是提供抗大豆锈菌的转基因植物、生产此类植物的方法以及用于上述方法的载体构建体。此目的由主要权利要求的主体对象实现。本发明的优选的实施方式由从属权利要求的特征限定。参考以下的本发明的优选实施方式的详细说明以及其中包括的实例，可更方便地理解本发明。除非另有注明，本文使用的术语应根据相关领域普通技术人员的惯常使用理解。除了本文提供的术语的限定，分子生物学中的常用术语的定义也可参见Rieger 等人，1991Glossary of genetics !classical and molecular,第 5 版，Berlin Springer-VerlagjPCurrent Protocols in Molecular Biology, F. M. Ausubel 等人编，Current Protocols,a joint venture between Greene Publishing Associates,Inc. andJohn Wiley & Sons, Inc. , (1998Supplement)。应当理解,如说明书和权利要求书所用，单数形式“a”或“an”可表示一个或多个，取决于其使用的上下文。因此，例如，“细胞”可表示至少一个细胞可被利用。应当理解，本文所用的术语只用于说明具体实施方式
的目的，并不旨在进行限制。
在本申请中参考了多个出版物。这些出版物和其中引用的参考文献的公开内容在此以整体并入本申请，以更完整地说明本发明所属的现有技术。用于克隆、DNA分离、扩增和纯化的、用于涉及DNA连接酶、DNA聚合酶、限制内切酶等的酶促反应的标准技术以及多种分离技术是本领域技术人员熟知并常用的。在Sambrook等人，1989Molecular Cloning,第2 版，Cold Spring Harbor Laboratory, Plainview, N. Y. ；Maniatis 等人，1982MolecularCloning, Cold Spring Harbor Laboratory, Plainview, N. Y. ；ffu (编)1993Meth.Enzymo1. 218,Part I ;Wu(编)1979Meth Enzymo1. 68 ;Wu等人，(编)1983Meth. Enzymo1. 100和 101 ；Grossman 和 Moldave(编)1980Meth. Enzymol. 65 ；Miller 编)1972Experimentsin Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor,N. Y. ；01d and Primrose,1981Principles of Gene Manipulation, University ofCalifornia Press,Berkeley ;Schleif和Wensink, 1982Practical Methods in MolecularBiology ；Glover(编)1985DNA Cloning Vol.1 and II, IRL Press, Oxford, UK ；Hames和 Higgins (编)1985Nucleic Acid Hybridization, IRLPress, Oxford, UK;和 Setlow和 Hollaenderl979Genetic Engineering Principles and Methods,第 1-4 卷，PlenumPress,New York中说明了多种标准技术。在使用时，缩写和命名法被视为本领域标准并广泛用于专业杂志例如本文引用的那些中。
蛋白质的“同源物”涵盖这样的肽、寡肽、多肽、蛋白质和/或酶，所述肽、寡肽、多肽、蛋白质和/或酶相对于未修饰的目标蛋白质具有氨基酸替换、缺失和/或插入，并与其来源的未修饰的蛋白质具有相似的功能活性。核酸的“同源物”涵盖这样的核苷酸和/或多核苷酸，所述核苷酸和/或多核苷酸相对于未修饰的目标核酸具有核酸替换、缺失和/或插入，其中由此类核酸编码的蛋白质与由未修饰的核酸编码的未修饰的蛋白质相比具有类似或更高的功能活性，其中此类核酸源自所述未修饰的核酸。特别地，核酸的同源物涵盖基于简并氨基酸编码的替换。“缺失”指从蛋白质除去一个或多个氨基酸，或从DNA、ssRNA和/或dsRNA除去一个或多个核酸。“插入”指一个或多个氨基酸残基或核酸残基被引入蛋白质或核酸中预定的位点。“替换”指用具有相似性质(例如相似的疏水性、亲水性、抗原性、形成或破坏α-螺旋结构或β-片层结构的倾向)的其他氨基酸取代蛋白质的氨基酸。在核酸水平，替换指用其他核酸取代核酸，其中由修饰的核酸编码的蛋白质具有相似的功能。特别地，核酸的同源物涵盖基于简并氨基酸编码的替换。氨基酸替换通常是单个残基的替换，但取决于对蛋白质的功能性约束可为聚集的残基，并可在I至10个氨基酸范围内变化；插入或缺失通常是约I至10个氨基酸残基的数量级。氨基酸替换优选地是保守氨基酸替换。本领域熟知保守替换表(参见例如Creighton (1984) Proteins, ff. H. Freeman and Company(编)和下表 I)。表1:保守氨基酸替换的实例
权利要求
1.增加植物和/或植物细胞中大豆锈菌抗性的方法，其中与野生型植物和/或野生型植物细胞相比，至少一种ADR-ι蛋白的含量和/或活性增加。
2.根据权利要求1的方法，其中ADR-1蛋白质由以下编码 (i)与SEQ ID No.1、其功能片段和/或能与其此类核酸杂交的重组核酸具有至少60 %，至少70 %，至少80 %，至少90 %，至少95 %，至少98 %或100 %同一性的重组核酸，和/或由 ( )与SEQ ID No. 2、其功能片段、其直系同源物和/或旁系同源物具有至少60%，至少70%，至少80%，至少90%，至少95%，至少98%同一性或100%同一性的蛋白质。
3.根据权利要求1或2中任一项的方法，所述方法包括 (a)用表达盒稳定地转化植物细胞，表达盒包含与启动子功能性连接的 (i)与SEQID No.1和/或其功能片段和/或能与此类核酸杂交的重组核酸具有至少60 %，至少70 %，至少80 %，至少90 %，至少95 %，至少98 %或100 %同一性的重组核酸，和/或 ( )编码与SEQ ID No. 2、其功能片段、其直系同源物和/或旁系同源物具有至少60%，至少70%，至少80%，至少90%，至少95%，至少98%同一性或100%同一性的蛋白质的重组核酸； (b)从植物细胞再生植物；和 (c)以足以生成或增加所述植物中大豆锈菌抗性的量和时间表达编码ADR-1蛋白的所述重组核酸。
4.重组载体构建体，包含 (a)(i)与SEQ ID No.1、其功能片段和/或能与此类核酸杂交的核酸具有至少60%，至少70%，至少80%，至少90%，至少95%，至少98%同一性或100%同一性的重组核酸，和/或 (ii)编码与SEQID No.2、其功能片段，其直系同源物和/或旁系同源物具有至少60%，至少70%，至少80%，至少90%，至少95%，至少98%同一性或100%同一性的蛋白质的重组核酸 有效连接于 (b)启动子和 (c)转录终止序列。
5.根据权利要求3的方法或根据权利要求4的载体构建体，其中启动子是组成型、病原体诱导型启动子和/或叶肉特异性启动子。
6.用根据权利要求4或5的载体构建体转化的转基因大豆植物、转基因植物部分或转基因植物细胞。
7.生产对大豆锈菌具有增加的抗性的转基因植物的方法，所述方法包括 (a)将根据权利要求4或5的载体构建体引入植物和/或植物细胞， (b)从植物细胞再生植物，和 (C)表达蛋白质,所述蛋白质 (i)与SEQ ID No. 2、其功能片段、其直系同源物和/或旁系同源物具有至少60%，至少70%，至少80%，至少90%，至少95%，至少98%同一性或100%同一性和/或( )由与SEQ ID No.1、其功能片段和/或能与此类核酸杂交的核酸具有至少60%，至少70 %，至少80 %，至少90 %，至少95 %，至少98 %同一性或100 %同一性的核酸编码。
8.根据权利要求6的植物的可收获部分，其中可收获部分优选地是种子。
9.源自根据权利要求6的植物的产品、可根据权利要求7的方法生产的植物的产品和/或来自根据权利要求8的植物的可收获部分的产品，其中产品优选地是大豆粉和/或大豆油。
10.生产产品的方法，所述方法包括 a)种植权利要求6的植物或可通过权利要求7的方法获得的植物，和 b)从本发明的植物和/或这些植物的部分例如种子,或由本发明的植物和/或这些植物的部分例如种子，生产所述产品。
11.权利要求1至3、5、7的方法或根据权利要求6的植物，其中大豆锈菌是豆薯层锈菌(Phakopsora pachyrhizi)和 / 或山马虫皇层镑菌(Phakopsora meibomiae)。
12.权利要求1至3、5、7或11的方法或根据权利要求6或11的植物，其中植物是大豆。
全文摘要
本发明涉及增加转基因植物和/或植物细胞中对大豆锈菌抗性的方法。与不包括重组ADR-1基因的野生型植物相比，这些植物中ADR-1蛋白的含量和/或活性增加。
文档编号C12N5/14GK103068991SQ201180040127
公开日2013年4月24日 申请日期2011年8月16日 优先权日2010年8月19日
发明者H·舒尔塞斯 申请人:巴斯夫植物科学有限公司