专利名称：从植物源食用油中提取用于转基因成分检测的dna的方法
技术领域：
本发明属于核酸提取领域的技术，尤其涉及植物源食用油转基因成分检测 用的核酸提取方法。
背景技术：
自20世纪70年代转基因生物和转基因产品被开发以来，转基因产品一直 以迅猛的速度发展。据国际权威机构统计，全球由转基因作物加工生产的转基 因食品和食品成份达近万种。其中作为食用油加工原料的大豆，油菜等占有较 大比例，如大豆占全球转基因作物总种植面积的63%,油菜占5%。由于这些 转基因油料作物出油率高，制油成本低，各发展中国家纷纷进口转基因大豆和 油菜作为制油原料。
目前，尚缺乏科学依据证明转基因食用油对人类健康和环境的安全性，但 市场调查显示了消费者对这一问题的关注。为保证消费者的健康权，知情权和 选择权，各国政府明确规定了食用油必须进行市场标识。对转基因食品的检测， 目前多采用PCR方法检测食品中是否含有插入的特定的外源基因。因此，食品 中的DNA提取非常关键。由于食用油生产加工过程中经过高温和高压等处理过 程，产品中的DNA遭到严重破坏，降解为长度较短，大小不一的片段，而且受 物理，化学和生物等因素的影响，DNA的质量也大大降低，因此，食用油的DNA 提取仍是国内外的难题之一。
食用油试剂盒目前在市场上做的不是很多，主要的原因是国内外没有一个 比较稳定的DNA提取方法或试剂盒。我们的发明则能克服上述提取不稳定的缺陷。
发明内容
本发明采用了特殊的技术，旨在建立成熟稳定的、从植物来源原料加工而 成的食用油中提取模板DNA的方法，用于转基因成分的PCR检测。
食用油加工工艺复杂，大都经过一系列的粉碎、高温等过程，DNA破坏极为 严重，其DNA含量较低，DNA片段较小等等，都给食用油DNA提取带来非常大 的困难，食用油DNA提取目前为国内外难题之一。本发明的目的就是解决现有 食用油DNA提取技术的难题，提供一套独特的缓冲液系统，使适合于从植物源 食用油中提取DNA，用于转基因成分的定性检测，以确保检测的稳定性和可靠性。 本方法针对植物源食用油经过高温高压的严酷条件加工后，其中水溶性的 DNA分子含量极低、降解严重的特点，在进行DNA提取时，必须先将含量极低的 水溶性成分从脂溶性油脂中充分分离出来，这是从油脂中提取DNA的一个关键； 然后采用独特的提取缓冲液(提取缓冲液lOOmM Tris. HC1, PH8. 0; 20mM EDTA; 500mM NaCl; 1. 5% SDS (W/V) ; 4% PVP (W/V))和乙酸钠缓冲液(乙酸钠缓冲液 3M乙酸钠；11.5%冰乙酸(V/V))，在carrier RNA辅助下，经异丙醇沉淀，和 用于富集DNA的第二次沉淀，经大离心管转移至小离心管，是进一步浓縮DNA 分子的另一个关键。本方法有别于传统的CTAB裂解，酚/氯仿抽提，相较于传 统方法一次操作需要几天的时间，该操作快速、便捷、安全，效率高、稳定性 好，适合用于植物源食用油的转基因成分的定性检测。
本发明的技术路线概述如下
(1) 样品预处理取食用油30ml，加入等体积乳化剂，于磁力搅拌器上搅 拌2-3小时；
(2) 取经预处理后的溶液10 ml于大离心管中，加5 ml提取缓冲液，涡 旋振荡l分钟后，室温静置10分钟；
(3) 加入2 ml乙酸钠缓冲液，充分混匀，涡旋振荡1分钟后，室温静置 IO分钟；
(4) 10,000 rpm离心10分钟，将下层水相转移至新的大离心管中；
(5) 向水相溶液中加入10 ti 1 Carrier RNA和0. 7倍体积的异丙醇，充 分混匀。(例如5 ml的水相溶液加3. 5 ml异丙醇)，10， 000 rpm离心10分钟， 弃上清，保留沉淀；
(6) 向大离心管中加入700 ul超纯水，涡旋振荡15秒，加入700 "1 异丙醇，涡旋振荡15秒，简短离心，将溶液转移到新的小离心管中；
(7) 12,000 rpm( 13,400Xg )离心5分钟，弃上清；
(8) 加入700 iU 70%乙醇，涡旋振荡5秒，12,000 rpm( 13， 400Xg ) 离心5分钟，弃上清；
(9) 开盖倒置，室温放置10 min，彻底晾干残余的乙醇；
(10) 加入40 u 1洗脱缓冲液TE，旋涡振荡1分钟，最终得到食用油DNA溶液。
根据本发明所阐述的方法，所用乳化剂为正己垸。
根据本发明所阐述的方法，所用提取缓冲液组成为lOOmM Tris. HCl，pH8. 0;20mM EDTA;500mM NaCl; 1. 5% SDS(W/V);4% PVP(W/V)。
根据本发明所阐述的方法，所用乙酸钠缓冲液组成为3M乙酸钠；11. 5%冰
乙酸(V/V)。
根据本发明所阐述的方法，第二次异丙醇沉淀后溶液转移到新的1. 5ml离 心管中。
本发明的有益效果是提供了一种稳定的、从食用油中提取微量DNA的有 效方法，用于食用油中转基因成分的定性检测，该方法快速、便捷、安全，效 率高、稳定性好，适合植物来源食用油的转基因成分定性检测。
图1 一级大豆油DNA的内源基因Lectin的PCR扩增结果 (1. DNA Marker; 2.福临门一级大豆油；3.金龙鱼一级大豆油；4.大豆种 子对照；5.清水对照)
图2 —级大豆油DNA的外源基因CaMV35S的PCR扩增结果 (l.DNA Marker; 2.福临门一级大豆油；3.金龙鱼一级大豆油；4.大豆种 子对照；5.清水对照)
图3菜籽油DNA的内源基因PE3—PEPcase的PCR扩增结果 (1. DNA Marker; 2.绿宝菜籽油;3.油菜种子对照;4.清水对照) 图4.玉米油DNA的内源基因Zein的PCR扩增结果 (1. DNA Marker; 2.福临门玉米胚芽油;3.玉米种子对照;4.清水对照)
具体实施例方式
1.材料和试剂
1) 提取试剂
提取缓冲液50mM Tris.HC1, 10mM EDTA，lOOmM NaCl, 1% SDS(W/V)， 2% PVP訓，高压灭菌；
乙酸钠缓冲液3M乙酸钠，11.5X乙酸(V/V),高压灭菌； TE缓冲液:10mM Tris.HCl， ImM NaEDTA， pH8.0，高压灭菌； 正己烷，carrier RNA, 70X乙醇(V/V)，异丙醇，超纯水。 2. DNA提取流程
(1) 样品预处理取食用油30ml，加入等体积正己烷，于磁力搅拌器上搅 拌2-3小时。
(2) 取经预处理后的溶液10 ml,加5 ml提取缓冲液，涡旋振荡1分钟后，
室温静置10分钟。
(3) 加入2 ml乙酸钠缓冲液，充分混匀，涡旋振荡1分钟后，室温静置
IO分钟。
(4) 10,000 rpm离心10分钟，将下层水相转移至新的离心管中。
(5) 向水相溶液中加入10 u 1 Carrier RNA和0. 7倍体积的异丙醇，充 分混匀。(例如5 ml的水相溶液加3. 5 ml异丙醇)，10， 000 rpm离心10分钟， 弃上清，保留沉淀。
(6) 向离心管中加入700 y 1超纯水，涡旋振荡15秒，加入700 u 1异 丙醇，涡旋振荡15秒，简短离心，将溶液转移到新的1.5ml离心管中。
(7) 12,000 rpm( 13'400Xg )离心5分钟，弃上清。
(8) 加入700 iil 70%乙醇，涡旋振荡5秒，12,000 rpm( 13， 400Xg ) 离心5分钟，弃上清。
(9) 开盖倒置，室温放置10 min，彻底晾干残余的乙醇。
(10) 加入40 u 1洗脱缓冲液TE，旋涡振荡1分钟，最终得到食用油DNA溶液。
采用基因特异引物，对模板DNA进行定性PCR检测。实验方法如下 1)基因特异引物序列(见表l) 表l基因特异引物的PCR序列
特异基 因引物序列扩增 片段长度原料作 物
LectinF: 5， GCCCTCTACTCCACCCCCATCC3， R: 5， GCCCATCTGCAAGCCTTTTTGTG 3，118bp大豆
C藩35SF :5' GCTCCTACAAATGCCATCATTGC 3'; R5， GATAGTGGGATTGTGCGTCATCCC3，195bp大豆
PE3 — PEPcsseF: 5， CCAGTTCTTGGAGCCGCTTGA 3， R: 5' AAGGGCCAGTCCAAATGCAGA 3'121bp油菜
ZeinF: 5" TGAACCCATGCATGCAGT 3' R: 5， GGCAAGACCATTGGTGA 3，173bp玉米
2)特异基因的PCR反应体系组成(见表2)
本发明提取的模板DNA采用Tiangen公司的2*Taq PCR MasterMix (目录号:KT201)进行检测，每个反应系设置两个平行管，大豆油、玉米油、菜籽油皆然c 表2 PCR检测反应体系(20W)
试剂名称加入PCR反应体系的量
2XTaq PCR MasterMix脂
正向引物(10)400.糾
反向引物(io幽)0眉
*模板DNA9》1
总计20W
*阳性对照体系采用模板，清水补足。 3)特异基因的PCR扩增条件(见表3) 表3特异基因的PCR扩增条件
变性
扩增
循环数
最后延 伸
Lectin
94 °C, 3min
95°C， 20s 60。C， 20s 72°C， 20s
40
72°C， 3min
CaMV35S
94°C， 3min
95°C， 20s 54°C， 20s 72°C， 20s
40
72°C， 3min
Zein
94。C， 3min
95°C， 20s 64°C， 20s 72°C， 20s
40
72°C， 3min
PE3-PEPcase 94°C， 3min
95°C， 20s 54°C， 20s 72°C, 20s
40
72°C， 3min
4)电泳条件
用0.5XTBE电泳缓冲液配制3% (W/V)的琼脂糖凝胶，凝胶融化后加入含 量为0. 5/ml的溴化乙啶。按比例将的PCR反应产物与上样缓冲液均匀混合， 然后加入到凝胶孔中，以5V/cm的电压进行电泳，电泳时间为40-60分钟。电
泳结束后将凝胶置于凝胶成像仪上观察并照相。
下面结合具体实施例对本发明作进一步说明。 实施例1:
以市售金龙鱼转基因大豆油、福临门转基因大豆油为材料，采用下述方法 提取DNA，
(1) 取大豆油30ml，加入等体积正己垸，于磁力搅拌器上搅拌2-3小时。
(2) 取经预处理后的溶液10 ml,加5 ml提取缓冲液，涡旋振荡1分钟。 室温静置IO分钟。
(3) 加入2 ml乙酸钠缓冲液，充分混匀，涡旋振荡1分钟。室温静置10分钟。
(4) 10,000 rpra离心10分钟，将下层水相转移至新的离心管中。(5) 向水相溶液中加入10 w 1 Carrier RNA和0. 7倍体积的异丙醇，充 分混匀。(例如5 ml的水相溶液加3. 5 ml异丙醇)，10， 000 rpm离心10分钟， 弃上清，保留沉淀。
(6) 向离心管中加入700 u 1超纯水，涡旋振荡15秒，加入700 ii 1异 丙醇，涡旋振荡15秒，简短离心，将溶液转移到新的1.5ml离心管中。
(7) 12,000 rpm( 13,400Xg )离心5分钟，弃上清。
(8) 加入700 lil 70%乙醇，涡旋振荡5秒，12,000 rpm( 13, 400X g ) 离心5分钟，弃上清。
(9) 开盖倒置，室温放置IO min,彻底晾干残余的乙醇。
(10) 加入40 y 1洗脱缓冲液TE，旋涡振荡1分钟，最终得到食用油DNA溶液。
用Tiangen公司产品DP321试剂盒提取的大豆种子DNA作为对照。用大豆 内源基因Lectin的特异性引物，以本方法提取的DNA为模板，通过PCR扩增检 测所提取的DNA是否满足转基因成分检测的要求，结果见图1。
由图1可见，从金龙鱼转基因大豆油和福临门转基因大豆油中提取的DNA， 在利用Lectin基因特异引物进行PCR扩增以后，得到的扩增片段与对照大豆种 子的扩增片段大小一致，而清水对照并无扩增，所以用本方法提取的DNA完全 能够满足转基因成分检测的要求。
实施例2:
材料、步骤同实施例1。
用Tiangen公司产品DP321试剂盒提取的大豆种子DNA作为对照。用转基 因大豆启动子CaMV35S的特异性引物，以本方法提取的DNA为模板，通过PCR 扩增检测所提取的DNA是否满足转基因成分检测的要求，结果见图1。
由图2可见，从金龙鱼转基因大豆油和福临门转基因大豆油中提取的DNA， 在利用CaMV35S启动子特异引物进行PCR扩增以后，得到的扩增片段与对照大 豆种子的扩增片段大小一致，而清水对照并无扩增，所以用本方法提取的DNA 完全能够满足转基因成分检测的要求。
实施例3
以市售绿宝菜籽油为材料，采用下述方法提取DNA，
(1)取菜籽油30ml，加入等体积正己垸，于磁力搅拌器上搅拌2-3小时。 其余步骤同实施例1。
用Tiangen公司产品DP321试剂盒提取的油菜籽DNA作为对照。用油菜内 源基因PE3PEPcase的特异性引物，以本方法提取的DNA为模板，通过PCR扩增 检测所提取的DNA是否满足转基因成分检测的要求，结果见图1。
由图2可见，从菜籽油中提取的DNA，在利用PE3PEPcase基因的特异引物 进行PCR扩增以后，得到的扩增片段与对照油菜籽的扩增片段大小一致，而清 水对照并无扩增，所以用本方法提取的DNA完全能够满足转基因成分检测的要求。
实施例4
以市售福临门玉米胚芽油为材料，采用下述方法提取DNA， (1)取玉米油30ml，加入等体积正己烷，于磁力搅拌器上搅拌2-3小时。
其余步骤同实施例1。
用Tiangen公司产品DP321试剂盒提取的玉米粒DNA作为对照。用玉米内 源基因Zein的特异性引物，以本方法提取的DNA为模板，通过PCR扩增检测所 提取的DNA是否满足转基因成分检测的要求，结果见图1。
由图2可见，从玉米油中提取的DNA,在利用Zein基因的特异引物进行PCR 扩增以后，得到的扩增片段与对照玉米粒的扩增片段大小一致，而清水对照并 无扩增，所以用本方法提取的DNA完全能够满足转基因成分检测的要求。
权利要求
1.从以植物为原料的食用油中提取用以转基因成分检测的DNA的方法，由下述步骤组成(1)样品预处理取食用油30ml，加入等体积乳化剂，于磁力搅拌器上搅拌2-3小时；(2)取经预处理后的溶液10ml于大离心管，加5ml提取缓冲液，涡旋振荡1分钟后，室温静置10分钟；(3)加入2ml乙酸钠缓冲液，充分混匀，涡旋振荡1分钟后，室温静置10分钟；(4)10,000rpm离心10分钟，将下层水相转移至新的大离心管中；(5)向水相溶液中加入10μl Carrier RNA和0.7倍体积的异丙醇，充分混匀，10,000rpm离心10分钟，弃上清，保留沉淀；(6)向大离心管中加入700μl超纯水，涡旋振荡15秒，加入700μl异丙醇，涡旋振荡15秒，简短离心，将溶液转移到新的小离心管中；(7)12,000rpm离心5分钟，弃上清；(8)加入700μl 70％乙醇，涡旋振荡5秒，12,000rpm离心5分钟，弃上清；(9)开盖倒置，室温放置10min，彻底晾干残余的乙醇；(10)加入40μl洗脱缓冲液TE，旋涡振荡1分钟，最终得到食用油DNA溶液。
2. 根据权利要求1所述的从以植物为原料的食用油中提取用以转基因成分检 测的DNA的方法，其特征在于所述步骤(1)乳化剂为正己烷。
3. 根据权利要求1所述的从以植物为原料的食用油中提取用以转基因成分检 测的DNA的方法，其特征在于所述步骤(2)提取缓冲液组成为pH8. 0的lOOmM Tris. HC1、 20mM EDTA、 500raM NaCl、 1. 5。/o SDS和4% PVP。
4. 根据权利要求1所述的从以植物为原料的食用油中提取用以转基因成分检 测的DNA的方法，其特征在于所述步骤(3)乙酸钠缓冲液组成为3M乙酸钠 和11. 5%冰乙酸。
5. 根据权利要求1所述的从以植物为原料的食用油中提取用以转基因成分检 测的DNA的方法，其特征在于所述步骤(6)将溶液从50ml大离心管转移到 1. 5ml小离心管中。
全文摘要
本发明的内容是从植物来源的食用油中提取DNA，用于转基因成分的检测。本方法的特点是在DNA提取之前先采用有机的乳化剂进行较长时间的乳化，把含量极低的DNA从脂溶性油脂中充分游离出来，完成成功提取的第一步，再利用自主研发的独特缓冲体系(提取缓冲液100mM Tris.HCl，pH8.0；20mMEDTA；500mM NaCl；1.5％SDS；4％PVP)使DNA充分释放和聚集，有别于传统的CTAB裂解，酚/氯仿抽提，然后在carrier RNA共沉剂下经异丙醇沉淀，再经第二次异丙醇沉淀，从大离心管转移至小离心管，最大限度的获得食用油中含量极低的DNA，溶于40μl溶解缓冲液中，取9μl作为模板用于20μl的PCR反应体系。本方法快速、便捷、安全，效率高、稳定性好，适用于以植物来源为原料的食用油的转基因成分检测。
文档编号C12Q1/68GK101358189SQ20081016754
公开日2009年2月4日 申请日期2008年10月10日 优先权日2008年10月10日
发明者柯海燕 申请人:天根生化科技(北京)有限公司