加工食品中核桃植物源性成分鉴别用hda引物及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及基因工程技术领域，尤其涉及一种用于加工食品中核桃植物源性成分 鉴别的HDA引物及其应用。
【背景技术】
[0002] 当前核桃加工食品及饮品增长迅速，受到广大消费者的欢迎。随之而来的问题是， 在核桃制产品的制备过程中存在大量的不规范操作，使得所得终产品中核桃源成分的有无 及其含量无法确定，导致核桃食品/饮品的质量无法保障。
[0003] 与此同时，随着核酸扩增技术的发展和应用，以核酸等温扩增技术为基础的检测 技术近年来得到了迅猛的发展。多种机制的等温技术不仅诞生，而且有些技术已经相当成 熟，完成了从实验室到实际应用的过渡，正逐步在分子生物学、医学、法学等领域得到广泛 的运用。特别是在现场快速检测技术方面，核酸等温扩增技术显示了其突出的优越性。更 为重要的是，核酸等温扩增技术由于不需要温度变化的时间过程且摆脱了对精良仪器设备 的依赖，使病原体的检测实现了快速、简便和高通量。在实际操作和仪器要求方面，这些等 温技术都比PCR技术更为简单和廉价，从而更容易被开发成现场检测的应用产品。因此，等 温扩增技术是核酸扩增技术的发展方向，具有广阔的应用前景。
[0004] 依赖解旋酶 DNA 等温扩增技术（Helicase-Dependent isothermal DNA Amplification，简称HDA)是由美国NEB公司研宄人员Vincent等于2004年发明一种新型 核酸等温扩增技术。该技术模拟体内DAN在恒温下复制的自然过程，在恒温条件下利用生 物复制系统的关键组分实现DNA的体外扩增。主要是利用解旋酶在恒温下解开DNA双链， 同时DNA单链结合蛋白（SSB)稳定解开的单链为引物提供结合模板，然后由DNA聚合酶催 化合成互补链。新合成的双链在解旋酶的作用下又形成单链，并作为下一轮合成的模板进 入循环扩增反应，最终实现靶序列的指数增长。
[0005] HDA技术的优点在于：等温扩增，在一个恒定温度就能完成扩增反应，不需要像 PCR那样循环的温度变化；原理简单，HDA技术模拟自然界DNA的合成方式，原理清晰易懂； 操作简便，HDA对引物的设计与PCR相似，不需要复杂的引物设计。对于其他组分也不需要 做任何特殊处理，只需要一个恒温装置即可进行反应；设备简单，HDA不需要复杂的设备， 只需要一个简单的恒温器，如果选用室温可以进行反应的酶，甚至不需要恒温器就可进行 反应。因此，HDA技术具有广阔的应用前景。
[0006] 目前尚未见利用HDA法检测核桃植物源成分含量的报道。
【发明内容】
[0007] 本发明要解决的技术问题是提供一种加工食品中核桃植物源性成分鉴别用HDA 引物及其应用，利用该引物进行相关检测，无论检测准度、精度或专一度都十分理想。
[0008] 为解决上述技术问题，本发明所采取的技术方案是：
[0009] 加工食品中核桃植物源性成分鉴别用HDA引物，所述HDA引物为：上游引物：如 SEQ ID NO :1所示；下游引物：如SEQ ID NO :2所示。
[0010] 利用上述HDA引物鉴别加工食品中核桃植物源性成分的方法，该方法包括如下步 骤：
[0011] A、食品中DNA的提取：取待测食品样品，采用试剂盒提取其中的DNA，保存备用；
[0012] B、引物设计：引物对于检测结果的准度、精度、专一度起决定作用，直接采用上述 两条引物；
[0013] C、HDA反应体系的建立：HDA反应体系包括：5yL10X缓冲液，0. 04ymol dNTPs， 0. 16 umol ATP，10U Bst ploymerase，0.10-0. 30 ug UvrD helicase，1.0-5. Oug T4gp32 或1. 0-6. 0 y g RecA蛋白，25 y M海藻糖，2 y L模板食品DNA，上游引物和下游引物各 20pmol，用 ddH20 补至 50 y L ;
[0014] D、恒温扩增：将反应体系放入60-70°C恒温金属浴中恒温扩增l_3h ;
[0015] E、结果检测：琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物，利用凝胶成像系统成像分析结果。
[0016] 作为上述检测方法的一种优选技术方案，步骤A中，食品中DNA提取的具体操 作方法为：如果操作对象为固体样品，则经液氮研磨成粉末后取0. lg，如果操作对象是液 体样品，则经冷冻干燥后取粉末0. lg ;所得样品粉末加入1. 5mL离心管中，加入600 y 1 65 °C预热的Buf f erPCB和12 y 1 0 -巯基乙醇，震荡混匀，置于65 °C水浴25min，间或混 勾，加入等体积的氯仿，充分混勾，12, OOOrpm离心5min，吸取上层水相至一个干净的 1. 5ml的离心管中，加入等体积BufferBD，颠倒混勾3-5次，再加等体积的无水乙醇，充 分混匀后用移液器将其全部加入到Ezup柱式植物基因组DNA抽提试剂盒的吸附柱中， 室温静置2min，10, OOOrpm离心lmin，倒掉收集管中废液，将吸附柱放回收集管中，加入 500 y lPWSolution，10, OOOrpm离心lmin，倒掉收集管中废液，将吸附柱放回收集管中，加 入500 y 1 WashSolution，10, OOOrpm，离心lmin，倒掉收集管中废液，将吸附柱放回收集管 中，12, OOOrpm离心2min，取出吸附柱，放入一个新的1. 5ml离心管中，在吸附膜中央加入 50 y ITEBuffer，静置3min，12, OOOrpm离心2min，得到的DNA溶液置于-20°C保存或直接用 于后续步骤。
[0017] 作为上述检测方法的一种优选技术方案，步骤C中，所述10X缓冲液包括lOOmM 二硫苏糖醇、350mM Tris-HAc、100mM MgS04和 lmg/mL BSA。
[0018] 作为上述检测方法的一种优选技术方案，步骤C中，所述反应体系中还包括10U的 Phi29嗜温聚合酶。
[0019] 作为上述检测方法的一种优选技术方案，:步骤C中，所述UvrDhelicase的含量为 0. 15 u g〇
[0020] 作为上述检测方法的一种优选技术方案，步骤C中，所述T4gp32的含量为4. 5 y g， 或者RecA蛋白的含量为3. 0 y g。
[0021] 作为上述检测方法的一种优选技术方案，步骤D中，将反应体系放入65°C恒温金 属浴中恒温扩增2h。
[0022] 作为上述检测方法的一种优选技术方案，步骤E中，吸取5 y L扩增产物进行1-2% 琼脂糖凝胶电泳，电泳条件为80-120V，80-100mA，电泳时间40-50min，置市售凝胶成像系 统进行结果分析，检测产物。
[0023] 采用上述技术方案所产生的有益效果在于：本发明是一种简便、快速的检测方法， 操作简单，覆盖面广，能应用在检验的一线，能够准确、快速检测出待测食品是否含有核桃 植物源成分，具有准度高、精度好、专一性强的特点，具体试验数据见实施例6-7。本发明的 方法可节约大量的人力物力，具有重大的实际应用价值。
【附图说明】
[0024] 图1为实施例6所得电泳图谱，其中，泳道1 :100bp ladder marker，泳道2 : 0. 00001 %样品，泳道3 :0. 0001 %样品，泳道4 :0. 001 %样品，泳道5 :0. 01 %样品，泳道 6 :0. 1 %样品，泳道7 :1 %样品，泳道8 :10%样品；可见，本发明所设计引物的检出精度为 0. 0001 %，即每百克样品中含有0. 0001 g核桃即可检出。
[0025] 图2为实施例7所得电泳图谱，其中，泳道1 :100bp ladder marker，泳道2 :核桃， 泳道3 :苜蓿样品，泳道4 :木薯，泳道5 :红薯，泳道6 :马铃薯。可见，核桃样品被有效的扩 增出210bp左右长度的目的片段，电泳条带清晰，无非特异性扩增，而其他4组样品均未产 生电泳条带，说明没有基因扩增；可见本发明所设计引物的检出专一度优良。
【具体实施方式】