[0026] 下面结合附图和【具体实施方式】对本发明作进一步详细的说明。本发明各实施例中 所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。并且各实施例中所用的材料及试剂等，如 无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0027] 本发明各实施例中部分材料为：DNA Marker，ATP，dNTPs，均购自大连宝生物工程 公司；海藻糖购自Sigma公司；大肠杆菌UvrD解旋酶购自上海富众生物科学有限公司；Bst polymerase、MutLprotein、T4gp 32均购自New England公司；引物（正向引物、反向引物） 由大连宝生物工程公司合成；Ezup柱式植物基因组DNA抽提试剂盒购自生物工程（上海） 有限公司。
[0028] 本发明各实施例中部分仪器为：金属浴为上海东升仪器有限公司生产的6400 型恒温金属浴，电泳仪为北京市六一厂生产DXY-33A型电泳仪，凝胶成像系统为UVP GelDoc-IT凝胶成像系统，超净工作台为苏州净化集团产品、高速离心机为Thermo公司生 产、高压灭菌锅为上海博迅公司生产、恒温培养箱为上海博迅公司生产、紫外分光光度计、 SK-1型快速混匀器、电热恒温、水浴锅、电子分析天平、显微镜、pH计、移液枪及其它辅助设 备均为国内生产厂家生产。
[0029] 实施例1 :食品中DNA的提取。
[0030] 食品中DNA提取的具体操作方法为：如果操作对象为固体样品，则经液氮研磨成 粉末后取0. lg，如果操作对象是液体样品，则经冷冻干燥后取粉末0. lg ;所得样品粉末加 入1. 5mL离心管中，加入600 y 1 65°C预热的BufferPCB和12 y 1 0 -巯基乙醇，震荡混匀， 置于65°C水浴25min，间或混勾，加入等体积的氯仿，充分混勾，12, OOOrpm离心5min，吸取 上层水相至一个干净的1. 5ml的离心管中，加入等体积BufferBD，颠倒混勾3-5次，再加等 体积的无水乙醇，充分混匀后用移液器将其全部加入到Ezup柱式植物基因组DNA抽提试剂 盒的吸附柱中，室温静置2min，10, OOOrpm离心lmin，倒掉收集管中废液，将吸附柱放回收 集管中，加入500 y lPWSolution，10, OOOrpm离心lmin，倒掉收集管中废液，将吸附柱放回 收集管中，加入500 y 1 WashSolution，10, OOOrpm，离心lmin，倒掉收集管中废液，将吸附柱 放回收集管中，12, OOOrpm离心2min，取出吸附柱，放入一个新的1. 5ml离心管中，在吸附膜 中央加入50 y ITEBuffer，静置3min，12, OOOrpm离心2min，得到的DNA溶液置于-20°C保存 或直接用于后续步骤。
[0031] 实施例2:引物设计。
[0032] 引物的设计对于检测结果的准度、精度、专一度起决定作用。首先筛选出几十条核 桃基因组中保守性极强的特异性基因片段，以其作为引物设计靶标序列，通过反复的设计、 比对、分析、验证和修改，最终最终确定了最优的检测引物序列，如下表所不：
[0033]
【主权项】
1. 加工食品中核桃植物源性成分鉴别用HDA引物，其特征在于：所述HDA引物为： 上游引物：如SEQ ID NO :1所示； 下游引物：如SEQ ID NO :2所示。
2. 利用权利要求1所述的HDA引物鉴别加工食品中核桃植物源性成分的方法，其特征 在于：该方法包括如下步骤： A、 食品中DNA的提取：取待测食品样品，米用试剂盒提取其中的DNA，保存备用； B、 引物设计：引物对于检测结果的准度、精度、专一度起决定作用，直接采用权利要求 1记载的引物； C、 HDA反应体系的建立：HDA反应体系包括：5yL 10X缓冲液，0. 04ymol dNTPs， 0. 16 u mol ATP?10U Bst ploymerase? 0. l〇-〇.30 u g UvrD helicase?1.〇-5. 0 U g T4 gp32或1. 0-6. 0 y g RecA蛋白，25 y M海藻糖，2 y L模板食品DNA，上游引物和下游引物各 20pmol，用 ddH20 补至 50 y L ; D、 恒温扩增：将反应体系放入60-70°C恒温金属浴中恒温扩增l_3h ; E、 结果检测：琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物，利用凝胶成像系统成像分析结果。
3. 根据权利要求2所述的鉴别加工食品中核桃植物源性成分的方法，其特征在于：步 骤A中，食品中DNA提取的具体操作方法为：如果操作对象为固体样品，则经液氮研磨成粉 末后取0. lg，如果操作对象是液体样品，则经冷冻干燥后取粉末0. lg ;所得样品粉末加入 1. 5mL离心管中，加入600 y 1 65°C预热的BufferPCB和12 y 1 0 -巯基乙醇，震荡混勾，置 于65°C水浴25min，间或混勾，加入等体积的氯仿，充分混勾，12, OOOrpm离心5min，吸取上 层水相至一个干净的1. 5ml的离心管中，加入等体积BufferBD，颠倒混勾3-5次，再加等体 积的无水乙醇，充分混匀后用移液器将其全部加入到Ezup柱式植物基因组DNA抽提试剂盒 的吸附柱中，室温静置2min，10, OOOrpm离心lmin，倒掉收集管中废液，将吸附柱放回收集 管中，加入500 y lPWSolution，10, OOOrpm离心lmin，倒掉收集管中废液，将吸附柱放回收 集管中，加入500 y 1 WashSolution，10, OOOrpm，离心lmin，倒掉收集管中废液，将吸附柱放 回收集管中，12, OOOrpm离心2min，取出吸附柱，放入一个新的1. 5ml离心管中，在吸附膜中 央加入50 y lTEBuffer，静置3min，12, OOOrpm离心2min，得到的DNA溶液置于-20°C保存或 直接用于后续步骤。
4. 根据权利要求2所述的鉴别加工食品中核桃植物源性成分的方法，其特征在于：步 骤 C 中，所述 10X 缓冲液包括 100mM 二硫苏糖醇、350mM Tris-HAc、100mM MgSOdP lmg/mL BSA〇
5. 根据权利要求2所述的鉴别加工食品中核桃植物源性成分的方法，其特征在于：步 骤C中，所述反应体系中还包括10U的Phi29嗜温聚合酶。
6. 根据权利要求2所述的鉴别加工食品中核桃植物源性成分的方法，其特征在于：步 骤C中，所述UvrD helicase的含量为0? 15 y g。
7. 根据权利要求2所述的鉴别加工食品中核桃植物源性成分的方法，其特征在于：步 骤C中，所述T4gp32的含量为4. 5 y g，或者RecA蛋白的含量为3. 0 y g。
8. 根据权利要求2所述的鉴别加工食品中核桃植物源性成分的方法，其特征在于：步 骤D中，将反应体系放入65°C恒温金属浴中恒温扩增2h。
9. 根据权利要求2所述的鉴别加工食品中核桃植物源性成分的方法，其特征在于：步 骤E中，吸取5 y L扩增产物进行1-2%琼脂糖凝胶电泳，电泳条件为80-120V，80-100mA，电 泳时间40-50min，置市售凝胶成像系统进行结果分析，检测产物。
【专利摘要】本发明公开了一种加工食品中核桃植物源性成分鉴别用HDA引物，其序列如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示。利用上述HDA引物鉴别加工食品中核桃植物源性成分的方法，包括如下步骤：A、食品中DNA的提取；B、引物设计，直接采用上述两条引物；C、HDA反应体系的建立；D、恒温扩增；E、结果检测：琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物，利用凝胶成像系统成像分析结果。利用本发明的引物进行相关检测，无论检测准度、精度或专一度都十分理想。
【IPC分类】C12Q1-68, C12N15-11
【公开号】CN104673920
【申请号】CN201510093621
【发明人】周巍, 张翠侠, 李永波, 马超峰, 李月华, 刘涛, 杨岚, 刘红冉, 王赞, 王爽, 章晶晶, 张薇, 张岩, 刘 东
【申请人】河北省食品检验研究院
【公开日】2015年6月3日
【申请日】2015年3月3日