一种用于鉴别人体疟原虫种类的试剂盒及其方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物工程领域，涉及人体疟原虫，具体来说是一种用于鉴别人体疟原 虫种类的试剂盒及其方法。
【背景技术】
[0002] 随着社会和经济的发展，以及全球疟疾消除工作的不断推进，许多国家的疟疾发 病率持续下降，并逐步转变为以输入性疟疾病例为主。在中国，自21世纪以来，本地疟疾 病例逐年减少，分布范围逐渐从24个省市减少为2014年的仅云南和西藏2省，但输入性 疟疾病例却在逐年增加，同时报告输入病例的省市也逐渐扩展到全国各地。由于疟疾不再 是我国居民的常见传染性疾病，因此，许多医务工作者对该病及其病原体的辨识水平逐步 下降，从事该方面的专业人员亦逐年呈下降趋势，特别是在疟原虫种类的鉴定方面，仅仅依 靠疟疾诊断的金标准一镜检，往往不能满足实践的需求。因此，国家疟疾诊断参比实验室 依据形势的变化和《中国消除疟疾行动计划（2010-2020年）》关于疟疾病例的实验室确诊 率100%的要求，不断寻求在现场更切实可行且能够准确鉴定疟原虫的检测方法。在疟原 虫的3种检测方法中，以PCR为基础的基因检测方法，在准确确定疟原虫虫种和检测多种 疟原虫混合感染病例方面能够弥补RDT和镜检方法的不足，已在低疟区、无专业疟疾镜检 人员的机构及疟疾病例的复核确认工作中被广泛推荐和应用。当前最为常用的PCR检测 体系为Snounou设计的以核糖体RNA小亚基（SSU rRNA或18S rRNA)基因为分子标记的巢 式PCR检测体系（NP-1993体系），及其随后修改完成的NP-2002体系。二者在第一轮反应 和第二轮反应中分别有1条属特异引物和种特异引物的序列不同。但这2种体系在检测疟 原虫方面均存在各自的缺陷。一方面，二者第二轮扩增体系扩增的间日疟原虫目标片段长 度（120bp)和三日疟原虫的（141bp)仅有21bp的差异，在凝胶电泳图上不宜于区分，因此 第二轮反应不易于采用多重PCR反应体系开展疟疾病原体检测，只能采用单一种特异引物 对，分4次分别扩增检测；另一方面，NP-1993体系不能检测卵形疟中的wallikeri亚种，而 NP-2002体系虽能检测，但除三日疟和间日疟外，第二轮PCR扩增获得的卵形疟原虫目标片 段长度（226bp)与恶性疟原虫的（205bp)也仅有21bp的差异。因此，本实验室借鉴蔡贤铮 等（2001)的双重PCR检测方法中的上游引物，重新设计了 4种疟原虫的种特异下游引物， 并对改进的新体系进行了特异性和敏感性的应用评价，以解决当前疟疾诊断实践中存在的 问题。
【发明内容】
[0003] 本发明的目的在于提供一种用于鉴别人体疟原虫种类的试剂盒及其方法，所述的 这种用于鉴别人体疟原虫种类的试剂盒及其方法解决了现有技术中检测疟原虫的方法过 于繁琐，不宜采用多重PCR-次反应进行检测以及不能鉴别卵形疟wallikeri亚种的技术 问题。
[0004] 本发明一种用于鉴别人体疟原虫种类的试剂盒，其包含五条特异性的引物，其碱 基序列分别如 SEQ ID N0:1、SEQ ID N0:2、SEQ ID N0:3、SEQ ID N0:4、SEQ ID N0:5 所示。
[0005] 特异的引物序列为：
[0006] P1:5，-CGACGGTATCTGATCGTCTTC-3，；
[0007] P2 :5' -TCATGATTGAGTTCATTGTGTTTG-3' ；
[0008] P3 :5' -TGCTTTGTATATTTATAACAAAGTTG-3' ；
[0009] P4:5 ' -CAATACAACGTATCTGTTCTTTGC-3 ' ；
[0010] P5:5，-TTTTAAGGACTTTCTTTGCTTCGG-3，。
[0011] 进一步的，还含有聚合酶链式反应试剂、阳性对照和阴性对照，反应试剂含有l〇 倍聚合酶链式反应缓沖液、灭菌的去离子水、四种脱氧核苷酸（每种脱氧核苷酸浓度为 10mM)和Taq DNA聚合酶和属特异引物。
[0012] 10倍聚合酶链式反应缓沖液包括如下成份：
[0013] Tris-HCl 100mM ；
[0014] MgCl225mM。
[0015] 属特异引物序列如下：
[0016] P6 ：5, -CCTGTTGTTGCCTTAAACTTC-3(SEQ ID NO:6)；
[0017] P7 :5, -TTAAAATTGTTGCAGTTAAAACG-3' （SEQ ID N0:7)。
[0018] 本发明还提供了采用上述的试剂盒鉴别疟原虫种类的方法，包括如下步骤：
[0019] 1)收集待检测的血液样品，提取总DNA，用灭菌的去离子水将样品的DNA浓度稀释 到 0? 1 ii g/ml-〇. 4 u g/ml ;
[0020] 2)采用特异性的引物扩增DNA片段，所述的特异性的引物的碱基序列分别如SEQ ID N0:1、SEQ ID N0:2、SEQ ID N0:3、SEQ ID N0:4、SEQ ID N0:5 所示；
[0021] 3)将扩增的DNA片段进行琼脂糖凝胶电泳，比较PCR扩增产物结果，如果DNA片 段的大小为268bp，则表示该DNA片段代表的血液样品中含有恶性疟虫，如果DNA片段的大 小为446bp，则表不该DNA片段代表的血液样品中含有三日痕虫，如果DNA片段的大小为 394bp，则表示该DNA片段代表的血液样品中含有卵形疟虫，如果DNA片段的大小为323bp， 则表示该DNA片段代表的血液样品中含有间日疟原虫，如果DNA片段不产生条带或者不能 清晰的产生条带，说明该血液样品中不含有疟原虫。
[0022] 进一步的，当提取的DNA浓度较低时，先用SEQ ID N0:6、SEQ ID N0:7所述的引物 进行首轮扩增后，再以其PCR扩增产物为模板DNA，应用SEQ ID N0:1、SEQ ID N0:2、SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO: 5所示特异引物进行扩增。
[0023] 进一步的，取8 ill或适量PCR产物进行电泳，使用50bp DNA ladder检测PCR片 段大小。
[0024] 应用DNAman软件对恶性疟、三日疟、卵形疟和间日疟原虫18S rDNA基因序列（登 录号M19172、AF488000、L48987和X13926)进行了比较分析，应用01igo6. 0引物设计软件， 于其保守区间的变异区设计引物序列，并初步评价和分析5条引物间可能产生的引物二聚 体、发夹结构及Tm值等情况，从中选择出条件较好的引物序列备用和测试，依据所测试的 引物及其扩增体系PCR扩增后获得的不同种类疟原虫的目标条带间差异是否明显和彼此 易于区分，不同虫种的PCR产物条带是否单一、明晰、鲜亮，扩增体系和扩增条件是否较为 稳定等，筛选出最好的引物序列（SEQ ID N0:1、SEQ ID N0:2、SEQ ID N0:3、SEQ ID N0:4、 SEQ ID NO:5)和扩增体系。
[0025] 本发明可解决以往判断疟疾患者和疟原虫种类时，不同种类疟原虫的PCR扩 增条带大小相差太少（21bp)不宜应用多重PCR扩增区分的难题，以及不能鉴别卵形疟 wallikeri亚种的缺陷。不同的血液样品通过总DNA的提取，对于疟疾和疟原虫种类用本方 法均可以检测和鉴别出来，本方法既可以直接准确地鉴定原虫血症在600个/yl以上的疟 疾患者体内痕原虫虫种（含卵形痕wallieri亚种）或者102_103copy/ii 1，甚至低至14个/ yl或者18copy/yl的疟疾患者也能被准确检测。也可以作为第二轮反应体系，与NP-1993 的第一轮体系搭配组成新的巢式PCR反应体系（M-Nest)，并可将多重PCR检测体系的检测 敏感性再提高10-100倍（表1-2)。应用实践表明，M-Nest检测体系与NP-1993具有相同 的敏感性（表3)。
[0026] 本发明和现有技术相比，其效果是积极和明显的。本发明能够简便、快速的鉴别疟 原虫的种类，对于在实验室进行各种疟原虫的分类研究、疟疾的快速鉴定和控制具有十分 重要的意义。