包含疟原虫msp-1的c-末端片段的重组蛋白的制作方法

专利名称：包含疟原虫msp-1的c-末端片段的重组蛋白的制作方法
包含疟原虫MSP - 1的
c-末端片段的重组蛋白
本发明涉及新的来自感染哺乳动物尤其是人的疟原虫裂殖子形式
中的主要表面蛋白的疫苗活性成分， 一般称为MSP - 1 。
MSP - 1已成为许多研究的主题。它在疟原虫类寄生虫尤其是恶 生疟原虫的裂殖体阶段合成，并在疟原虫的肝阶段和细胞阶段(1 ， 2， 3， 4)以裂殖子的一种主要表面成分的形式表达。因为该蛋白的 显著特征并且在所有已知的疟原虫属的种类中保宁，因此推测它可能是 构建抗疟原虫疫苗(5、 6 )的一个候选物。
该蛋白的片段尤其是被观察到在例如寄生虫进入被感染宿主的紅 细胞的侵入期间形成的天然裂解产物也是如此。这样的裂解产物有分子 量为42kDa的C -末端片段的(7 、 8 )，其本身再次被裂解为具有 通常表观分子量为33kDa的N -末端片段和具有通常表观分子量为 19kDa的C -末端片段(9 )，后者在借助于糖基磷脂酰肌醇(GPI ) 基团进行修饰后，通常仍保持固定在寄生虫膜上(10 ， 11)。
还在红细胞内发育周期的早期阶段发现该片段(15, 16 ),从 而作出这样的观察結论,即19kDa片段可起到仍然未知，但毫无疑问 在再侵入过程中为必需的作用，这构成了迚去形成的该蛋白可构成疫苗 的尤其有效的耙标的假设基础。
应理解下面经常提及的来自疟原虫属的一些种类的p42和p19蛋 白是指相应的该疟原虫的MSP - 1蛋白的C -末端裂解产物，或广义 地说指通过基因重组，或通过使用常规技术，如使用"Applied System "合成仪的化学合成，或通迚"MerrifieW "型固相合成而获 得的包含基本上相同的氨基酸序列的产物。为了方便，所提到的"重組 p42 "和"重组p19 "指通过包含至少一个基因工程步骤的方法而获得 的"p42 "和"p19 "。面对获得大量恶性症原虫寄生虫的困难以及不可能体外培养间日 疟原虫，很清楚生产抗症原虫疫苗的唯一方法是求助于使用重組蛋白或
肽的方法。然而，由于其具有200kDa的很大的大小，生产全部MSP -1非常困难。这引导研究者研究其C -末端部分，它的(仍然未知 的)作用可能更为重要。
已制备出并在猴中测试过的涉及恶性疟原虫MSP - 1的C-末端 部分的重组蛋白(12 ， 40 ， 41 )为
大肠杆菌(40 )中产生的与谷胱甘肽-S -转移酶融合的p19 ;
大肠杆菌(12 )中产生的与谷胱甘肽-S -转移酶融合的p40 ;
*与来自破伤风类毒素^多肽融合的并带有在S艮酒酵母中产生的辅助T 细胞表位的p19 ( 12 );
在杆状病毒系统中产生的p42 ( 41 )。
包含大肠杆菌中产生的与谷胱甘肽-S -转移酶融合的p19蛋 白，并混合有明矶或脂质体的组合物在六个接种的Aotus nancymal猴 中没有一个显示出保护性效果(40 )。
包含大肠杆菌中产生的与谷胱甘肽- S -转移酶融合的p42蛋 白，并混合有弗氏完全佐剂的組合物当给予两类Aotus猴(A. nancymai和A. vociferans )时没有显示出保护性效果。腺酒酵母中产 生的p19蛋白在两个A. nancymai种类的Aotus猴中显示出保护性效果
(12 )。而在两个A.vociferans种类的Aotus猴中没有保护性效果。 一些研究者(Chang等)还报导了在兔中使用在杆状病毒系统中 产生的含有恶性疟原虫(18 )中共有的氨基酸序列的重组p42蛋白进 行的免疫试验。后边这些作者指出在兔中重组p42基本上以与完整重组 MSP - l蛋白(gpl95 )相同的方式起作用。该p42蛋白結合弗氏完 仝佐剂已成为在易被恶性疟原虫感染的非人灵长类Aotus 、狐猴
(lemurinus grisemembra )中进行的疫苗接种试验中的主题(40 )。 結果表明3个动物中的2个被完全保护，第三个虽然显示出与对照类似 的寄生虫血症，但是具有较长的潜仗期。然而推出如此诱导的抗寄生虫 本身的抗体的保护性是冒险的。应该记住目前对于间日症原虫和恶性症原虫，在灵长类中没有非常满意的实验模型。对于恶性疟原虫和间日疟原虫幵发出的松鼠猴模型，对恶性疟原虫开发的Aotus模型，是需要寄 生虫种类适应并通常需要切除动物的脾以获得显著的寄生虫血症的人 工系统。结果，来自该模型的疫苗接种对于人类仅具有有限的预测价值。无论如何，用该重组蛋白可能获得的实际接种比例为多少仍是一 个问题，记住下面报导的发现，即在来自疟原虫属相同种类的p42 ，尤 其是在相应的p33中在许多情况下存在高可变区，这使得在用来自症原 虫属种类的p42接种的个体中所诱导的抗体抗相同种类其它个体感染 的免疫保护性劝效不确定(13 )。.甚至可假设p42的N -末端部分的高多态性在通常观察到的对这 类寄生虫的免疫逃避中起着明显的作用。本发明的目的是生产可避免这些困难、其保护性效果在真正重要 的实验模型或甚至直接在人中可验证的接种用重組蛋白。更具体地说，本发明提供一种抗感染人的疟原虫型寄生虫的接种 用組合物，它包含可能被或可能未被糖基化的重组蛋白作为活性成分， 其必需的組成性多肽序列为 感染人的疟原虫型寄生虫的裂殖子形式表面蛋白1的19千道尔顿的 C 一末端部分(pl9)的序列，其中所述C -末端片段在感染周期的进入 人紅细胞的穿透阶段末期通常仍然被锚定在寄生虫表面；疫应答的所述片段之部分的序列；.或与所述p19片段或该片段的所述部分免疫学等价的多肽的序列；和所述重组蛋白进一步包括在还原性介质中不稳定并优选組成被抗相应 疟原虫所形成的人抗血清所识别的大部分表位的构象表位。该构象表位的存在可在疫苗活性成分的保护性劝效中起重要的作 用。当它们在杆状病素系统中产生时，特别可在显示上面定义的其它特 性的活性成分中发现它们。如果需要，下面将提到的"杆状病毒载体系 统"是指由杆状病毒型载体本身和细胞系组成的整体，尤其是可被将要转化到这些细胞系的序列修饰的杆状病毒转化,并导致该转化序列表达的昆虫细胞系。在Longacre等(19 )的文章中已描述了杆状病毒系统 中这两种成分的优选实例。在下面的实施例中使用相同的系统。当然， 不言而喻，杆状病毒和可被杆状病毒感染的细胞的变体可用来代替选择 的那些。尤其是，当它为非还原状态或为非不可逆还原的状态时,该重组 蛋白被抗相应的疟原虫或抗类似的疟原虫所形成的人抗血清所识别，但 当它被不可逆地还原时，则不被或仅在很小程度上被这些相同的抗血清 所识别。在还原介质，尤其是在存在p -巯基乙醇时，这些构象表位的不 稳定特性可通过下面在实施例中描述的试验来证实。类似地，下面的实 施例描述了可适用于用来获得本发明蛋白质的不可逆还原的实验条 件。从这点上来看，由Longacre等(14 )生产的重组蛋白可用于该组 合物。应该记住S. Longacre等成劝地在含有编码间日疟原虫的p19的 核苷酸序列的杆状病毒载体系统中，生产出来自间日疟原虫的MSP -l的重组pl9，尤其是通过在多角体蛋白启动子的控制下，用包含编码 下面定义的肽序列的序列的杆状病毒载体转染昆虫细胞〔草地夜蛾 (sf9 )细胞系〕的培养物，其中在所用的杆状病毒载体中序列以下面 的顺序排列 多角体蛋白信号肽的35个碱基对的5'末端片段，其中用于启动该蛋 白表达的甲疏氨酸密码子已突变(为ATT );，编码对应于MSP - 1N -末端部分的32个氨基酸肽的5'-末端核苷 酸片段，包括MSP - 1信号肽； 编码p19的核普酸序列，或编码间日疟原虫的MSP - 1蛋白的p42 的序列，根据情况，以带有(被"锚定"形式)或失去(可溶形式)这 些核苷酸序列的3'末端区的形式来提供这些序列，其最终C -末端表 达产物被认为在将最终pl9蛋白锚定在寄生虫膜上起着实质性作用； 2TAA终止密码子。对于p42 ，来自MSP - 1的C -末端区的序列从氨基酸Asp 1325延至氦基酸Leu 1726 (铺定形式)或至氦基酸1705 (可溶形式)，对 于pl9，序列从氛基酸lie 1602延至氨基酸Leu 1726 (锚定形式)或 至氛基酸Ser 1705 (可溶形式)，应理解其起始和终止氛基酸已在上 面描述的p42和p19的全部氦基酸序列是^f艮据已测序的间日疟原虫的 Belem分离物的基因(20)得来的。使相同的载体系统中，使用编码猴疟原虫的p42和p19的核苷酸 序列获得类似結果。对于猴疟原虫的兴趣是双重性的，它是感染恒河猴 的与间日疟原虫极其接近的寄生种类。它还可感染人。而且，猴疟虫的 天然宿主恒河猴和高帽猴(toque macaque)的可接近性也使得可检测来 自猴疟原虫的MSP _ 1在天然系统中的保护劝效。对于在人类中的反 应，恒河猴被认为是最具代表性的一个种类。尤其是，在使用高帽猴和两种重组多肽可溶性的p42和尤其是中该两种重组多l分别在杆状病毒系统中^生并在具有识别天然MSP - 1蛋白的相应区域的单克隆抗体的亲和柱上純化。进行下面观察在 攻击感染后，仅用p19 (三只猴子)及用pl9和p42—起(三只猴子) 免疫的六只猴子事实上均显示出几乎无效的免疫性。在用p42免疫的三 只猴子中获得的結果是不显著的。它们中的两个如上所述，但是由于第 三个显示出比在存在弗氏佐剂时用PBS緩沖浪免疫的对照(3只猴 子)或未免疫(3只猴子)时低的寄生虫血症，因此不甚清楚。第二次攻击感染表明仅获得p19的猴子被保护了至少六个月。在 该系统中(高帽猴，猴疟原虫)用pl9及明矶进行的第二次接种试验显 示出对于3只猴子中的2只猴子的明显保护。这是首次证实在存在明矶 时MSP - 1或其它重組抗原的保护性效果(42 )。使用恒河猴，用在杆状病毒系统、采用来自猴疟原虫的重组pl9 产生的重组多肽进行的特别有效的试验结果表明，各自包含来自其它症 原虫的重组p19的重组多肽必定以相同方式起作用。对于在人类中的痴 原虫，它们比来自在"人工宿主"中用间日疟原虫或恶性疟原虫进行的 试验的結果更有意义。SEQIDN0:79是卵巢癌多核苷酸8h (图7B )。SEQIDN0:80是卵巢癌多核苷酸12e (图8)。SEQIDN0:81是卵巢癌多核苷酸12h (图9)。SEQIDN0:82-310是

图15A_ 15EEE所示的卵巢癌抗原多核苷酸。SEQIDN0:311是卵巢癌多核苷酸0772P的全长序列。SEQIDN0:312是0772P氨基酸序列。SEQIDN0:313- 384是卵巢癌抗原多核苷酸。SEQIDNO:385代表克隆0772P —种形式的cDNA序列，命名为21013。SEQIDNO:386代表克隆0772P —种形式的cDNA序列，命名为21003。SEQIDNO:387代表克隆0772P —种形式的cDNA序列，命名为21008。SEQIDN0:388是与SEQ ID NO:385对应的氨基酸序列 SEQIDNO:389是与SEQ ID NO :386对应的氨基酸序列。SEQ IDNO:390是与SEQ ID N0:387对应的氨基酸序列。SEQ ID N0:391是卵巢癌多核苷酸08E的全长序列。SEQIDN0:392 - 393是08E编码的蛋白质序列。SEQIDNO: 394 - 415是与0E8抗体表位对应的肽序列。SEQIDN0:416-435是用0E8全长开放阅读框架预测的可能的HLA-A2 lOmer结合欣。SEQ ID N0:436- 455是用0E8全长开放阅读框架预测的可能的歸-A2 9mer结合欣。SEQ ID NO:456是显示与0772P有同源性的全长Genbank序列的 截短核苷酸序列。SEQ ID N0:457是显示与0772P有显著同源性的全长Genbank序列。SEQ ID N0:458是编码显示与0772P有同源性的全长Genbank序 列的截短形式的蛋白质。同B于间,从编码p19的序列获得所述插入片段；可接着检测来自由相应 修饰的载体转化的相应真核细胞，尤其是昆虫细胞中的这些插入物的表 达产物产生保护性效果的能力，尤其是在下面实施例中描述的实验条件 下。特别地，这些插入物的表达产物必须能抑制体内由相应的完整的寄 生虫所引导的寄生虫血症。因此，本发明包括所有接种用组合物，其中活性成分的必需纽成 性多肽序列由可诱导与由p19或上面定义的片段产生的等价细胞和/或 体液免疫应答的肽构成，前提是在序列中加入、缺失一些氦基酸或被其大的改变-下文称为"免疫等价肽"。p19片段自然也可以在N -末端側或C -末端側或借助于肽键与 具有接种潜力的其它胞质蛋白片段相连.(如来自间日疟原虫(29 )的 Duffy結合蛋白或来自恶性疟原虫的EBA — 175 ( 30 )和(31 ), 它的一个区特异性地富含半胱氨酸)，前提是它抑制体内通常由相应寄 生虫所诱导的寄生虫血症的能力不发生变化，除非被增大。在pl9的N -末端最后的上游，编码pl9或其部分的片段还可包 杏例如所采用的信号肽的C -末端片段的不同肽序列，如MSP - l蛋 白的信号肽片段。该序列优选包含少于50个氛基酸，例如10 - 40个 氛基酸。这些评述类似地适合于来自其他疟原虫尤其是恶性症原虫的 p19，恶性症原虫是寄生虫中主要的种类，引起一种最严重疟疾形式。然而，如果要获得能进行免疫保护性试验的可观数量，非常难于 将上面总結的在杆状病毒系统中产生间日疟原虫或猴疟原虫的重组 p19的方法不加改变地更换到的产生恶性疟原虫的重组p19中，而产生 令人满意的产率。本发明还提供在很大程度上克服这个问题的方法。这样在杆状病 毒系统的表达载体中还可以使用替代天然核普酸序列的编码恶性症原 虫p19的合成核苷酸序列来获得更高产率的恶性症原虫p19和面临类 似困难的其它疟原虫的pl9 ，其中该合成核苷酸序列编码相同的p19 ，但其特征在于具有比天然核苷酸序列更高的G和C核苷酸比例。换句话说，本发明是依据下面发现而得出的，即在杆状病毒系统 中编码p19的核苷酸序列的表达明显与待表达核普酸序列中的连续密 码子与可被杆状病毒转化的宿主细胞的"细胞机器"的提高的相容性相 关，这在通常包含在这些杆状病毒中并在被感染宿主细胞中表达的天然核苷酸序列中可观察到；因此天然恶性疟原虫核苷酸序列的表达不好或甚至完全没有表达；因此也可能解释了由Longacre等(14 )观察到的 在杆状病毒系统中间日疟原虫的p19的更为有效的表达，以及发明人已 证明的来自相应的天然p 19核苷酸序列的猴疟原虫的序列，因为它们比 编码恶性疟原虫p19的天然核苷酸序列具有相对更大量的G和C核苷 酸。因此本发明更一般地提供一种重组杆状病毒类型的修饰载体，在 包含于所述载体中并被所述载体转化的细胞识别的启动子的控制下，其 包含编码可被杆状病毒系统利用的信号肽的第一核苷酸序列，其特征在 于第二核苷酸序列位于第一核苷酸序列下游，也受所述启动子的控制并编码脱序列*感染人类的非间日疟原虫的疟原虫类寄生虫的裂殖子形式的表面蛋白 1 ( MSP - l蛋白)的19千道尔顿(p19 )的C 一末端片段的序列，在感染周期中，该C -末端片段在进入红细胞的穿透阶段的末期通常仍然被锚定在寄生虫表面； 或该肽片段的 一 部分，前提是来自杆状病毒系统中的第二序列的表达 产物仍能诱导可抑制体内由于相应寄生虫导致的寄生虫血症的免疫应 答； 或通迚氦基酸的加入、缺失或取代但不导致其诱导类似于由所述p19 肽片段或所述片段的所述部分产生的细胞和/或体液免疫应答能力发生 大的改变的所述C -末端肽片段(p19 )或所述肽片段部分的免疫等 价肽；和如果需要，所述核苷酸序列具有构成它的全部核苷酸的40 % - 60 %范 围的G和C核苷酸含量，优选至少50 % 。可通过构建合成基因获得该序列，其中天然密码子已被变化为不改变它们翻译(保持肽序列)的富含G/C的密码子。由合成DNA.提供的核普酸序列相对于天然基因序列或cDNA ，可 能具有至少10 °/。改变的密码子，但仍保留了天然翻译序列的特征，即 保持氛基酸序列。不能排除G和C核苷酸含量可进一步增加，前提是由此导致产生 的重组肽，或免疫等价肽的氨基酸序列的改变尤其是在下面将描述的试 验中不导致形成的重组蛋白的免疫性质或保护性性质的丧失。这些评述自然适用于感染人类的其它疟原虫，尤其是其中编码相 应p19的天然核苷酸序列具有与杆状病毒系统中的有效表达相容不好 的T和A核普酸含量的那些。的那些。如果可被识别作为杆状病毒系统中的信号时，则它还可来源于 其它疟原虫，如间日疟原虫或猴疟原虫或其它生物。在一种情况下，所述载体中的编码p19或其片段的序列失去将天 然蛋白锚定在为其来源寄生虫上的序列，在这种情况下，表达蛋白通常 被分泌至培养基中(可溶形式)。在这方面也很明显，即在本发明的条 件下，产生的重组蛋白的可溶和锚定形式，尤其是当它们来自恶性痞原 虫或猴疟虫或间日疟原虫时，趋于形成寡聚体，这个性质可能作为所形 成重组蛋白的增加的免疫原性的原因。本发明还涉及这样的载体，其中编码序列包含编码通常参与诱导 将天然蛋白锚定在表达它的宿主的细胞膜上的p19的疏水性C'-末端 的最后序列的最后的3'-末端序列。该3'-末端的最后序列对于编码可 溶性p 19部分的序列也可以是异源的，例如当它编码将产生的整个重组 蛋白锚定在所采用的杆状病毒系统的宿主的细胞膜上的序列时，相当于 来自间日疟原虫或来自其它生物的3'-末端序列。该锚定序列的一个实 例为可在草地夜蛾(32 )类型的昆虫细胞中表达的CD59抗原的GPI 或CD 14人蛋白(33 )的GPI 。本发明自然还涉及重组蛋白，这些蛋白包括被抗相应的症原虫所形成的人血清所识别的构象表位。通常，本发明还涉及上述类型的任何重组蛋白，前提是它包含例 如在杆状病毒系统中产生的那些构象表位，尤其是在还原介质中不稳定 的那些。本发明自然还涉及所述重组蛋白，不论它们为可溶形式或被具有 锚定区，尤其是锚定至杆状病毒系统所采用的细胞宿主上的形式。本发明还包括在所采用的杆状病毒系统中自发产生的或使用常规 蛋白质寡聚体化方法随后产生的寡聚体。最常用的方法包括戊二醛法。 然而，可使用任何用于桥接蛋白中各个胺与羧基官能团的常规系统。作为实例，可使用描述在欧洲专利申请EP - A - 0602 079中的任何方法o术语"寡聚体"指包含2 - 50个单体单元的分子，每个单体单元 包含如上所定义的能形成聚集物的p19或其片段。本发明还包括如上定 义的p19或p19片段与用于生产疫苗的载体分子，如聚赖氨酸- 丙氨 酸，借助于共价或非共价键形成的任何結合产物。利用它们的接种用组 合物也形成了本发明的一部分。本发明还进一步涉及采用这些寡聚或結合重組蛋白，包括来自间 日疟原虫的蛋白的疫苗组合物，其中这些评述也延伸至这些重组蛋白寡 聚体。本发明还包括这样的组合物，其中上面定义的重组蛋白与佐剂如 明矶結合。包含允许它们锚定至产生它们的细胞的膜上的C -端末端 区的重组蛋白可有利地与可形成适于生产疫苗的脂质体的脂质一起結 合使用。非限制性地，可使用描述在J. Delattre等，INSERM， 1993的 题目为 "Les liposomes aspects technologique biologique et pharmacologlque "〔脂质体工艺学、生物学和药理学状况〕的出版 物中脂质。无论对于适当的接种部分为同源或异源的铺定区，重组蛋白中的 锚定区的存在促进亲细胞抗体的产生，尤其是在鼠中可具有特别高的保 护性活性的IgG2a和IgG2b类型，这样可省去将这样构建的疫苗活性成分与用来产生脂质体形式的非脂质佐剂結合。这相当于一个很大的优 点，因为在使其能被贮存和运输的条件下，脂质体可被冷冻干燥，而不 需要一 系列的冷贮存措施。本发明的其它特征从下面对本发明重纽蛋白及可产生它们的条件 的实施例的描述中将变得很清楚。这些实施例不限制本发明的范围。PfMSPlpl9S (可溶)(来自恶性疟原虫的可溶性p19 )的构建的描述重組构建物pfMSPlpl9S包含对应于8个碱基对的前导序列和来自 间日疟原虫MSP — 1的头32个氨基酸即从Me^ -Asp32 (Belem分离 物;Del Portillo等，1991， P. N.A. S" 88， 4030 )，接着是GluPhe (由 于连接两个片段的EcoRl位点)的DNA 。这后面是图l描述的编码恶 性疟原虫MSPlpl9从Asn^3-Serno5的合成基因(Uganda醫Palo Alto 分离物；Chang等，1988，实验寄生虫学，67， 1)。构建物由两 个TAA终止密码子终止。该构建物产生的重組蛋白从昆虫细胞中分泌 在培养物上清中。为了比较，用相同方法在类似于用来产生上面p19的条件下产生 重组构建物，但是使用由Chang等，实验寄生虫学67， 1; 1989描 述的恶性疟原虫株(FUP )的相应DNA的直接拷贝构成的编码序列。 天然的基因拷贝(从天冬酰胺1613 -丝氨酸1705 )通过PCR从天然 基因形成。图1A表明合成基因(Bacl9 )和"天然基因"(pF19 )的序列。 可以看出编码来自恶性能疟原虫的p 19的天然序列的93个密码子 中的57个密码子发生了改变(它们中的55个的第三个核苷酸和其它2 个密码子中的第一和第三个核苷酸)。在上述条件下，将新的密码子加 入到5'末端以导入肽信号并导入用于克隆的EcoRI位点，类似地加入 在恶性疟原虫p19中不存在的两个终止密码子以获得表达终止信号。位 于连续密码子上面的各个字母对应于各个连续的氨基酸。星号("表示 终止密码子。垂直线表明在两个序列中相同的核苷酸。PfMSPlpwA构建(错定的GPI )(恶性症原虫的锚定p19 )的描述PfMSPlp^A构建物具有上面的特征，只是合成序列(图1B )编 码恶性疟原虫的MSPlpl9(Uganda-palo alto分离物)从Asn1613到 Ile1226 ，接着是两个TAA终止密码子。该构建物产生通过糖基磷脂酰 肌醇(GPI )类型的结构锚定在感染细胞的质膜上的重组蛋白。图1C代表在切除信号序列之前的PfMSPlpl9S重组蛋白序列。 图ID代表在切除信号序列之后的PfMSPlpi9S重组蛋白序列。 图1C和1D中下划线的氛基酸来自于用来连接来源于间日疟原虫 的MSP - 1的N -末端部分的核普酸序列(具信号肽)和恶性疟原虫 的MSP - lpl9的EcoRI位点。图2通过免疫印迹，在存在(还原)或不存在(非还原)p -巯 基乙醇时，使用SDS - PAGE分析通过免疫亲和纯化的可溶性重组 PfMSPlpw抗原。在2 % SDS存在下，加热至95。C后，将样品上样至 凝胶中。在这些条件下，仅有共价键(二硫挢)可以抵抗解聚作用。左 手边的印迹用与天然p19的线性表位反应的单克隆抗体来显示。右手边 的印迹用来自由于恶性疟原虫而具有对疟原虫的获得性免疫的个体的 13份人抗血清的混合物来显示。这些結果表明重組杆状病毒分子可重 现其大部分被人抗血清识别的聚合物形式的构象表位。图2B :在非还原(NR )，仅在带电介质中还原(R )和被不可 逆还原(IR )条件下，用来自间日症原虫和猴症原虫的纯化的重组 MSP - lpl9的人抗血清进行的免疫印迹分析本项工作是基于这样一种想法，即杆状病毒表达系统大量正确重 现在体内存在于MSP - 1的C -末端部分的构象表位。测定这种性质 的最好方法(在不存在相当于p19的天然纯化的蛋白时，它可能是唯一 可能的方法)是研究重组蛋白与暴露于疟原虫的个体抗血清的反应性， 这反映出如人免疫系统"看见"的天然蛋白。因此，在存在(还原的)或不存在(非还原的)DTT时，使用 SDS - PAGE ( 15 % )，通过免疫印迹分析免疫亲和纯化的可溶性重组PvMSP-l p19和PcMSP-l p19抗原。在2 % SDS存在下，加热至 95 。C后，将样品上样至凝胶中。如下进行不可逆的还原将蛋白重新 悬浮于0.2M Tris-HCl， pH8.4， lOOmM DTT， 1.0%SDS中，并在70 °C加热30分钟。在用水稀释后，加入丙烯酰胺至最终浓度为2M， 37 °C 下，在氮气氛中在黑暗中将';昆合物保温1小时。用来自由于间日疟原虫 而具有对疟原虫的获得性免疫的个体的2 5份人抗血清的混合物来显示 免疫印迹。V和C分别指来自间日疟原虫和猴疟原虫的MSP - l的蛋 白。应该注意到不可逆还原的重组蛋白未显示出与人抗血清的反应性， 而非不可逆还原的蛋白或未还原的蛋白显示出良好的反应性。(由于在 其糖基化状态时与硝酸纤維素紙結合不好，所以未还原的Pv MSP -lpl9有些弱)。这些結果表明人抗血清对杆状病毒MSP - lpl9分子 的识别大部分取决于(如果不是完全)对还原作用敏感的在该系统中被 重制的构象表位。图3 - 37T下，在存在来自恶性疟原虫裂殖子并用等电聚集分离 的蛋白级分时，将可溶性PvMSPlp42重组抗原(Longacre等，1994， 同上)保温5小时。接着在存在(还原的)或不存在(未还原的)p -巯基乙醇时，通过免疫印迹分析样品。将等电聚焦级分5 - 12和在存 在(Tex )或不存在(T )去污剂时制备的两个全裂殖子提取物进行 分析。用对间日疟原虫的MSP1 p42和MSPlpw特异性的单克隆抗体显 示免疫印迹，結果表明在可用去污剂提取的恶性疟原虫裂殖子中具有蛋 白水解活性。在一些级分中的对p42的消化看来导致消化产物(p19 ) 的聚合作用；这种聚合作用可能与二疏桥的形成相关，因为在存在(3 -巯基乙醇时，高分子量形式消失而有利于分子量为约19kDa的分子 (Tex-R )。因此在这些实验中观察到的p19的聚合作用可以是该分 子在体内的固有性质。图3B : p42和pl9抗原对间日疟原虫抗-MSP - 1人应答的不 同分布使用如下的ELISA抑制方法，比较对间日疟原虫具有获得性免疫 的个体的抗血清对间日疟原虫MSP - 1 p42和pl9抗原的识另'J。将来自由于间日疟原虫而具有对疟原虫的获得性免疫的个体的25份人抗清 血的混合物稀释至1 : 5000 ，室温下，单独地或在存在lmM纯化的 间日疟原虫重组p42或p19时保温4小时。将混合物转移至已在4。C下 用500ng/ml纯化的吸附重组p42或p19包被18小时的微量滴定孔中， 并在室温下保温30分钟。在用含0.1% Tween 20的PBS洗涤后，加入 与过氨化物酶偶联的山羊抗小鼠IgG ， 37。C下，将混合物保温1小时。 通过在492nm下读取光密度来获得酶活性。根据不存在竟争性抗原时 对微量滴定平板上覆盖抗原的100 %抗血清活性的值来计算抑制百分 数。使用Statview程序来计算统计数据。每一个柱代表根据4 - 12次 测定的竟争/吸附抗原对的平均抑制百分数；竖线相当于95 %置信区 间。星号(*)指在存在衣霉素时产生的抗原，因此没有N-糖基化。这些 测定的重要参数为对抗血清在ELISA曲线敏感区域内的1 : 5000稀 释，以及包括低亲和性表位竟争的lmM竟争性抗原浓度。因此这些数 插反映出两个被比较抗原之间的最大相似性。結果表明大多数(如果不 是所有)被人抗血清识别的p42表位存在于p19中，因为在存在后者 时，人抗血清抗p42的反应性的抑抑制与被p42抗原本身的抑制一样 多。然而，相反，由于人抗血清抗p19的反应性被p42的抑制比被pl9 本身的抑制小得多，因此约20 %由人抗血清识别的p19表位不存在于 p42或在p42上不可接近。仅在将p42裂解为p19和p33后者才形成或 释放该p19的特异性表位。这些結果不受糖基化作用的影响表明这种作 用确实是由于p19和p42的肽成分之间的差异而不是由于糖基化作用 的差异。这些結果预示这样一个事实，即pl9具有与p42截然不同的免 疫性质。PcMSPlpl9S (可溶性)构建物(猴疟虫的可溶性p19 )的描述从猴疟原虫抹(P. cynomolgi ceylonesis ) ( 22 - 23 )的克隆获 得用于上面构建物的DNA 。该虫抹通过其天然宿主(Macacasinica )连续传代和借助于蚊子的循环传播(27 )而得以保持。处于成熟裂殖体阶段的血浪寄生虫从当寄生虫血症达到5 %水平 时的被感染的猴子中获得。接着使用在(25 )中描述的方法对它们进行纯化。按在(26 )中所描述的提取DNA。使用图4中划线的来自间日疟原虫的寡核苷酸，借助于PCR反应 产生1200个碱基对的片段。5'寡核苷酸包含EcoRI限制性位点，3' 寡核苷酸包含两个合成TAA终止密码子，其后是BgIII位点。借助于 这些EcoRI和BgIII位点以及连接反应将该片^:导入已包含间日疟原 虫MSP - 1蛋白信号序列的pVLSV2oo质粒(19 )中。该新质粒(pVLSV200C42 )被用来分析DNA序列。比较猴疟原虫和相应的间日疟原虫的序列。黑色箭头表示推测的 第一和第二个裂解位点。通过从恶性症原虫的已知位点类推来确定它们(27 ， 28 )。，线和水平箭头定位所研究约4个区域的界限。区域4 相当于编码猴疸原虫p 19的序列、糖基化位点加框，保宁的半胱氨酸下 划线。图4的下面部分表明间日疟原虫和猴疟原虫的两个分离物之间的 相同的百分数。重组构建物PcMSPlpwS包含相当于如下的DNA :前导序列的8 个碱基对和间日疟原虫的MSP - 1的从Me^至Asp32头32个氛基酸 (Belem分离物；DelPortillo等，1991，P. N.A,S.，88，4030 )，其后为 连接这两个片段的GluPhe (由于EcoRI位点)，这后面是编码猴疟原 虫MSP1 pi9的从Lys 276至Ser 380(Ceylon抹)的序列。该构建物由两 个终止密码子终止，该构建物产生分泌在被感染细胞的培养物上清中的 重组蛋白。通迚使用特异性识别恶性疸原虫p19的单克隆抗体的免疫亲和层析纯 化重组PfMSPl pl9蛋白通过使用详细描述在Pharmacia采用的方法中的标准方法，将 70mg单克隆抗体(从G 17.12杂交瘤获得，该杂交瘤于1997年2月14 日保藏在CNCM 〔国家徵生物培养物保藏中心〕(法国巴黎)，其保 藏登记号为I - 1846 ;该G17.12杂交瘤从产生识别恶性疟原虫p19 的IgG 2a/k的X63Ag8 653骨髓瘤构建)結合至3g活化的CNBr -Sepharose 4B ( Pharmacia )来制备层析树脂。4。C下，将包含可溶性PfMSPl p19的培养上清与层析树脂分批保温16小时。将柱用20体 积的含0.05 % NP40， 0.5M NaCl的PBS洗涤一次；用5体积的PBS 洗涤一次并用2体积lOmM磷酸钠(pH6.8 )洗涤一次。用30ml 0.2M 甘氨酸(pH2.2 )进行洗脱。洗脱液用1M磷酸钠(pH 7.7 )中和，接着通过超滤和对PBS透析将其浓缩。为了純化被锚定的 PfMSPlp19 ，所有洗涤和洗脱溶浪均包含0.1 %的3 - (二甲基-十 二烷基铵基)丙烷磺酸盐(Fluka )。在松鼠《乾Saimiri sciureus中的重组间日疟原虫(p42和p19 ) MSPl接种试验。该接种试验在雄性J卑未被切除的2-3岁的松鼠猴(Saimiri sciureus boliviensis )中进行。用约50 - lOOpg经免疫亲和纯化的每 种重组可溶性PvMSPl p42和pi9 ( 19 )以3周的间隔对3只猴肌肉内注射3次。如下使用完全和不完全弗氏佐剂第1次注射1 : 1 FCA/FIA;第2次注射1:4 FCA / FIA ;第3次注射FIA 。将这些佐剂组合物与抗原的PBS溶液以1:1混合。使用相同方法使五只对照 猴子接受在大肠杆菌中产生的谷胱甘肽- S -转移酶(GST )抗原。 在最后感染2.5周后，通过注射2 X 108被适应的间日症原虫种类 (Belem )感染的紅血细胞来进行攻击感染。通过检查被Giemsa染色 的涂片来每天确定所有动物中的寄生虫血症来评价保护作用。图5中的曲线表明以作为感染后时间(天)的函数的每微升血中 的被寄生的红血细胞数目(纵坐标，对数比例)测定的寄生虫血症中的 差异。曲线A相当于在三只接种猴子中观察到的平均值；曲线B相当 于在五只对照猴子中的平均值。对图的研究表明接种的效果是极大地降低了寄生虫血症。在高帽猴Macacasinica中的重组猴皮疟原虫(p42和p19 ) MSPl接种试验如下使用15只捕获的猴子(1 ) 3只动物被注射lOOpg可溶性PcMSPlp42; (2) 3只动物被注射35jig (第一次注射)或50fig (第 二次和第三次注射)可溶性PcMSPl p42 ; ( 3 )三只动物被注射 PcMSPlp42和pw的混合物；(4 )三只动物被注射佐剂加PBS ; ( 5 ) 三只动物未被注射。在上述方案中使用了弗氏完全和不完全佐剂。以4 周的间隔进行肌肉内注射。在最后注射4周后，通过注射2 X 105被猴 疟原虫感染的红血细胞来近行攻击感染。通过用Giemsa检测寄生虫血 症来每天确定所有动物中的寄生虫血症来评价保护作用。仅在计数400 个涂片范围后才将寄生虫血症划分为阴性。寄生虫血症以被寄生的红血 细胞的百分数来表示。图6A - 6G表明所获得的结果，其中每一个均显示作为感染后的 时间函数(沿横坐标，天数)的在攻击动物中观察到的寄生虫血症(沿 纵坐标，以对数比例的被寄生细血细胞的百分数表示〉。 結果涉及，在图6A中；未接种的对照动物； 图6B涉及接受了包含弗氏佐剂的盐溶浪的动物； 图6C是为了突出从对动物施用弗氏佐剂产生的相对結果(变化显然 是不明显的)，将图6A和6B进行叠加； 图6D提供在用p42接种結束时所获得的結果； 图6E涉及仅用pl9接种的动物； 最后，图6F涉及用pl9和p42的混合物接种的动物。p42当然诱导一定水平的保护。然而，如图6E和6F所示，由本 发明的重组p19产生的保护相对更好。可提出这样的假设，即提高的保护作用来自p42的笫二次裂解, 伴随裂解的是释放游离的半胱氨酸，結果形成分子内桥而导致在三种试 验的重组蛋白中极具特征的p19多聚体。用来产生图(6A — 6F )的数据在图6G中给出。猴疟原虫的高帽恒河猴接种试验，仅用pl9接种的猴的第二次攻 击感染和对照(图8 )6个月后，未进行其它接种，接受了 pl9MSP - 1及FCA / FIA的3只猴(图6E )和接受了包含弗氏佐剂的盐溶浪的3只恒河猴(图 6B )和2只新的未受影响的未被接种的猴子通过注射1 X 106个感染 猴疟原虫的紅血细胞接受新的攻击感染。通过检查Giemsa染色每天确 定所有动物中的寄生虫血症来评价保护作用。仅在计数400个染色范围 后才将寄生虫血症划分为阴性。寄生虫血症以被寄生的红血细胞的百分 数表示(在图8D中提供了用来得出图8A - C的数据)。各组中除开 1只动物有1天显示0.008 %寄生虫血症外，早在6个月前经历了攻击 感染的6只免疫动物没有可检测的寄生虫血症(图8A和8B )。两个 未受影响的对照显示具有最大为0.8 °/。并持续21天的通常的寄生虫血 症(图8C )。因此，尽管在第一次攻击感染后不存在寄生虫血症或非 常轻微，接种了 MSP - 1 pl9的3只动物比在第一次攻击感染后显示 出全部通常感染的3只对照晚6个月还受保护。这些結果提示p19的保 护期为至少6个月。在猴疟原虫高帽恒河猴系统中用pl9和明矶进行的接种试验(图9 )使用完全(FCA )或不完全(FIA )弗氏佐剂获得前面的阳性保 护結果。然而，目前唯一在人中被允许的佐剂为明矶。出于这个原因， 我们在存在明矶作为佐剂时，在高帽恒河猴中用猴疟原虫MSP - lpl9 进行接种试验。如下使用6只捕获的恒河猴(1 ) 3只动物被注射4 个剂量的50mg重組猴疟原虫MSP - 1 p19和20mg明矶；(2)3 只动物被4次注射生理盐水和10mg明矶。以4周的间隔进行肌肉注 射。在最后注射4周后，通过注射2 X 105个被猴疟原虫感染的红血细 胞进行攻击感染。通过检查Giemsa染色涂片每天确定所有动物中的寄 生虫血症来评价保护作用。仅在计数400个涂片范围之后才将寄生虫血 症划分为阴性。以被寄生的红血细胞的百分数来表示寄生虫血症。该实 验結果如下。用重组p 19和明矶免疫的3只恒河猴中的2只攻击感染后 在感染期总寄生虫血症(图9A和9B )比用生理盐水和明矶(图9D ) 免疫的3只对照恒河猴少约30倍。用p19免疫的第三只恒河歉图9C )SEQIDN0:79是卵巢癌多核苷酸8h (图7B )。SEQIDN0:80是卵巢癌多核苷酸12e (图8)。SEQIDN0:81是卵巢癌多核苷酸12h (图9)。SEQIDN0:82-310是图15A_ 15EEE所示的卵巢癌抗原多核苷酸。SEQIDN0:311是卵巢癌多核苷酸0772P的全长序列。SEQIDN0:312是0772P氨基酸序列。SEQIDN0:313- 384是卵巢癌抗原多核苷酸。SEQIDNO:385代表克隆0772P —种形式的cDNA序列，命名为21013。SEQIDNO:386代表克隆0772P —种形式的cDNA序列，命名为21003。SEQIDNO:387代表克隆0772P —种形式的cDNA序列，命名为21008。SEQIDN0:388是与SEQ ID NO:385对应的氨基酸序列 SEQIDNO:389是与SEQ ID NO :386对应的氨基酸序列。SEQ IDNO:390是与SEQ ID N0:387对应的氨基酸序列。SEQ ID N0:391是卵巢癌多核苷酸08E的全长序列。SEQIDN0:392 - 393是08E编码的蛋白质序列。SEQIDNO: 394 - 415是与0E8抗体表位对应的肽序列。SEQIDN0:416-435是用0E8全长开放阅读框架预测的可能的HLA-A2 lOmer结合欣。SEQ ID N0:436- 455是用0E8全长开放阅读框架预测的可能的歸-A2 9mer结合欣。SEQ ID NO:456是显示与0772P有同源性的全长Genbank序列的 截短核苷酸序列。SEQ ID N0:457是显示与0772P有显著同源性的全长Genbank序列。SEQ ID N0:458是编码显示与0772P有同源性的全长Genbank序 列的截短形式的蛋白质。在这两组中抗原的施用不规(弗氏佐剂的不良乳化，被冻凝的脂质体)未能使这些結果的重要性被完全评价。在明矶组中，2只动物在感染期 间显示的全部寄生虫血症比对照少约4倍，1只动物比对照少约3倍， l只动物类似于对照。由于对照的可变性，可能由于用于攻击感染的寄 生虫抹未很好地适应仅仅最近在Cayenme开发的非脾切除的松鼠猴模 型，解释该实验有些困难。然而，虽然不太完美，但使用明矶的实际效 果却是令人鼓舞的，因为我们的抗原看来是目前与明肌結合已显出一定 效果的唯一的重组恶性疟原虫MSP _ l形式。在松鼠猴中用重組恶性疟原虫p19进、行的接种试验(如图10的相同试 验)如下以4周的间隔将囚禁饲养的猴子经肌肉内注射两次lmL接种 物(1 )在存在如下弗氏佐剂时，4只动物被注射5(Hig可溶性PfMSPl p19 :第一次注射1:1FCA/FIA;第2次注射1:4FCA/FIA;接着 以1:1与抗原的PBS溶液混合；(2 )在存在10mg明矶时，4只动物 被注射50ng可溶性P歴SPlp19 ; (3) 4只动物被注射约50吗GPI 锚定的重构在由1:1摩尔胆固醇和磷脂酰胆碱组成的脂质体中的 PfMSPlp19。在第二次注射后，将动物饲养17天。将来自由于恶性疟原虫(成熟形式占大多数)导致带有30 °/。寄生 虫血疟的松鼠猴的红细胞用PBS洗涤，在存在2 % SDS和2 %二硫苏 糖醇时，将残留物稀释8倍，在上样至7.5°/。(分离胶)和4% (浓缩 胶)聚丙烯酰胺凝胶之前加热至95°。在转移至硝酸纤维素上之后，如 下使用抗血清进行免疫印迹分析(1 )将用弗氏佐剂中可溶性PfMSPl p19接种的4只猴子的抗血清收集物稀释20倍；(2 )将用明矶佐剂 中可溶性PfMSPl p19接种的4只猴子的抗血清收集物稀释20倍； '(3 )将用脂质体中的锚定PfMSPlpl9接种的4只猴子的抗血清收集 物稀释20倍；(4) 50mg/ml与P歴SPlpl9的线性表位反应的单克 隆抗体；(5 )将来自约20只重复感染恶性疸原虫并变得可不受任何 后继恶性疟原虫感染的猴子SH190抗血清收集物稀释500倍；(6 )将未受影响的猴子(从未暴露在恶性疸原虫中)的抗血清收集物稀释20倍。結果表明用PfMSPl p19接种的猴子的3份抗血清收集物强烈及 特异性地与非常高分子量的复合物(扩散在浓缩胶中)反应，这些复合 物存在于含更多成熟形式的寄生虫提取物中。这些結果支持了这样的假 设，即在体内存在PfMSPl p19的特异性聚集物，尤其是其寡聚体形 式，其包含被重现于在杆状病毒系统中合成的重纽pfMSPl p19分子中 的表位。图7也说明这些結果。它显示在凝胶上产生的免疫印迹。头三个 凝胶泳道说明猴子对注射p19的体内应答((1 )与弗氏佐剂，(2 ) 与明矶，(3 )以脂质体形式〕，尤其是高分子量复合物的存在支持了 在体内成熟阶段(当p42被裂解为p19和p33 )特有的寡聚体形式的 pl9聚集的假设。该接种试验还包括与前面注射相同的第三次注射。使用弗氏佐剂 的注射仅包含FIA 。对于每组有两只动物对照，即注射了 PBS和弗氏佐剂的2只对 照动物注射PBS和明矶的2只对照动物；注射了脂质体而没有蛋白 的2只对照动物；和注射了 PBS而没有佐剂的2只对照动物。如上面 描述的来评价保护作用。图7B :该图的数据来自松鼠猴/恶性疟原虫接种试验(下面的图 10 )。数目相当于图10中提到的各只猴子。用于该图中的技术和方法 与图7中的一样，只是在三次注射后攻击感染那天检测各只猴子的每份 抗血清，并将SHI抗血清以1:250稀释。結果表明用pl9和明矶接种 的4只猴子的抗血清强烈并特异性地与非常高分子量的复合物反应，而 用p19和弗氏佐剂或脂质体接种的冉它组的猴子仅显示出与这些复合 物很小的反应性。由于用pl9和明肌接种的猴子也是被保护得最好的， 因此与高分子量复合物的反应性看来指示了保护性效果，尽管该组中一 只猴子相对于对照组没有被保护且另一只仪被部分保护。当然本发明还涉及其它应用，如在下面根据一 些实例描述的那 些，虽然这些本质上是非限制性的。治疗用途该重组分子PfMSPl p19可被用来产生特异性抗体，该抗体可通 过被动转移用作由于恶性疟原虫导致的具有死亡危险的严重症疾的治 疗剂。诊断用途来自杆状病毒的重组分子PvMSPl p42 、 PvMSPl p19和PfMSPl p19可以并且已被用来产生特异性的鼠单克隆抗体，这些抗体 与来自其它种的如兔或山羊的多克隆抗-MSP1 pl9抗血清結合可形 成疟疾的半定量诊断试验的基础，用于区别可致死的由恶性症原虫导致 的疟疾和通常为非致命的由间日疟原虫导致的疟疾。该试验的原理是捕 获和定量血液中包含pl9部分的任何MSP - l分子。此处，MSP1 pl9分子的优点如下 (i )它在相同种中极其保宁，而在不同种之间具有足够的不同，使得 易于产生种类特异的反应物。在来自PfMSPl p19和PvMSPl p19的抗 体之间未观察到交叉反应；(ii )虽然不准确地知道，但MSPlpl9的作用看来是足够地重要，因 为该分子不会显著变化或被删除而对寄生虫无致死效果。(Hi )它是在所有裂殖子中发现的主要抗原，因此原则上它必定在甚 至是低的寄生虫血症时可被检测并与寄生虫血症成比例。(iv )由于来自杆状病毒的重组MSPlpl9分子看来重现了 MSPlpl9 天然結构的大部分，因此针对该蛋白产生的抗体将很好地适应于诊断用 途。1996年2月1日根据布达佩斯条约Rule6.1条，下面指出的微生 物已以下面的登记号被保藏指称代号 登记号PvMSPl pl9A 1-1659 PvMSPl pl9S 1-1660PfMSPl pl9A 1-1661 P麵P1 pl9S 1-1662 PcMSPl pl9S 1-1663本发明还涉及这些抗体尤其是固定在固体载体上(例如用于亲和层析)的抗体用于纯化起初包含在';昆合物中的pi9类肽的用途。纯化指将该混合物与抗体接触，解离抗原-抗体复合物并回收纯化的pl9类型的肽。本发明还涉及疫苗组合物，其也包括蛋白或片段的混合物，尤其是这类混合物 恶性疟原虫p19和间日疟原虫p19 ;'恶性疟原虫pl9和恶性疟原虫p42 ，如果需要，后者失去其最可变的区域；.间日疟原虫pl9和间日疟原虫p42 ，如果需要，后者失去其最可变的 区域；*恶性疟原虫pl9和恶性疟原虫p42 ，如果需要，后者失去其最可变的 区域，^间日疟原虫pl9和间日疟原虫p42 ，如果需要，后者失去其最 可变的区域。在这种情况中，最可变的区域被定义为区域I丛区域II及区域III 的全部或一部分，优逸除去的区域III的部分是与区域II并列的部^(保 宁部份位于p33C -末端这一側，与pl9靠近)。区域II和III示于图 4中。本发明不局限于生产人疫苗。它还可适用于使用来自感染哺轧动 物的寄生虫的相应蛋白或抗原及在相同条件下的产物生产兽医疫苗组 合物。已知相同类型的感染巴贝虫病还出现在牛、猪和马中。巴贝虫属 种类的一种抗原与MSP - 1的蛋白部分有高度的构象一致性(尤其是 在两个EFG样和富含半胱氨酸区)和劝能一致性〔(36 ) ， ( 37 ) 和(38 )〕。已描述了使用抗这些寄生虫的可溶性抗原的兽医疫苗(39 )。 不言而喻用于这些混合物中的p19在分别考虑时也可如*面所述地进行修饰。参考文献(1) Holder, J. 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Miller等(1987)，"幵发疟原虫血液阶段疫苗需要分析 预测保护作用"。今日寄生虫学，12巻，2号；46 - 47 。本发明还涉及分泌逸择性识别感染人的非间日疟原虫的症原虫属 类寄生虫的裂殖子形式中的MSP - 1蛋白的p19而不识别间日疟原虫 的特异性抗体的杂交瘤。尤其是，这些杂交瘤分泌不识别间日疟原虫pl9并特异性识别恶 性疟原虫p19的单克隆抗体。本发明还涉及一种杂交瘤，其特征在于它产生特异性识别间日疟 原虫的p19和猴疟原虫的p19的特异性抗体。F10 - 3杂交瘤从产生 识别间日疟原虫p42糖蛋白的IgG2b/k的X63 Ag8 653骨髓瘤构建。
权利要求
1. 一种重组蛋白，其必要组成性多肽序列为·感染哺乳动物尤其是人的非间日疟原虫的疟原虫属类寄生虫的裂殖子形式的表面蛋白1(MSP-1蛋白)的19kDa(p19)C-末端片段的序列，该C-末端片段通常在感染周期中其进入人红细胞的穿透阶段末期仍然锚定在寄生虫表面；·或仍能诱导可在体内抑制由于相应的寄生虫导致的寄生虫血症的免疫应答的该片段的一部分的序列；·或能诱导与由所述p19片段或该片段的所述部分产生的等价的细胞和/或体液免疫应答的肽的序列；和所述重组蛋白可能进一步包含在还原介质中不稳定的并组成对抗相应疟原虫而形成的人抗血清所识别的大部分表位的构象表位。
2. 根据权利要求1的重纽蛋白，其特征在于当它为非还原状态或非抗血清识别，但当它为不可逆还原状态时，它不能被这些相同的抗血清 识别或仅在很小程度上被识别。
3. 根据权利要求1或2的蛋白，其特征在于它抑制人抗血清与在相 同条件下产生的相应的p42以及p42本身的免疫反应性，而p42仅可 部分抑制所述人抗血清对p19的反应性。
4. 根据权利要求1 - 3任一项的重組蛋白，其特征在于它基本上失 去了正常位于p33 ( 33kDa N -末端片段)的C -末端多肽序列上游 的任何多肽序列，在p42天然裂解之前在相应p42中p33该側与p19 相连，所述p33的最后C -末端多肽序列当存在时包含少于50个氨基 酸残基。
5. 根据权利要求1 — 3任一项的重组蛋白，其特征在于它基本上失 去了正常位于p33 ( 33kDa N -末端片段)的C -末端多肽序列上游 的任何多肽序列，在p42天然裂解之前在相应p42中p33该側与p19 相连，所述p33的最后C -末端多肽序列当存在时包含少于IO个氨基酸残基。
6. 根据权利要求1 - 3任一项权利要求的重组蛋白，其特征在于它 基本上失去了正常位于p33 ( 33kDa N -末端片段)的C -末端多肽 序列上游的任何多肽序列，在p42天然裂解之前在相应p42中p33该 側与p19相连，所述p33的最后C -末端多肽序列当存在时限于保留 感染人的疟原虫如恶性疟原虫或间日症原虫中的相当程度的保守性的序列。
7. 根据权利要求1 - 6任一项的重组蛋白，其特征在于p19片段 的所述部分包含通常包含在该p19中的两个EGF区域中的至少一个。
8. 根据权利要求1-7任一项的重组蛋白，其特征在于所述p19 片段或p19片段的所述部分的分子量为10 - 25kDa，尤其是10-15kDa c
9. 根据权利要求1 - 8任一项的重组蛋白，其特征在于它还包含使 p19片段能锚定在表达所述重组蛋白的宿主细胞上的糖基磷脂酰肌醇(GPI )基团，其中宿主细胞尤其是真核细胞，优选可被杆状病毒感 染的昆虫细胞。 '
10. 根据权利要求1 - 8任一项的重組蛋白，其特征在于它失去了 极其^ 危水的C -末端部分，该C -末端部分参与诱导将所述重組蛋白 锚定至表达它的宿主的细胞膜上，其中宿主细胞尤其是真核细胞，优选 为可被杆状病毒感染的毘虫细胞。
11. 根据权利要求10的重組蛋白，其特征在于它为水溶性的。
12. 根据权利要求1 - ll任一项的重组蛋白，其特征在于它包含恶 性疟原虫的MSP - l蛋白的p19序列或相应片^t的所述部分。
13. 根据权利要求1 - 12任一项的重组蛋白，其特征在于它包含猴 疟原虫的MSP - l蛋白的pl9序列或相应片段的所述部分。
14. 根掂权利要求1 - 13任一项的重组蛋白的寡聚体。
15. 根据权利要求14的寡聚体，其特征在于它包含如权利要求1 - 13任一项中定义的重组蛋白的所述多肽序列的2 - 50个单体单位。
16. 根据权利要求1 - 14任一项的重组蛋白，其特征在于它与用于生产疫苗的载体分子結合。
17. —种抗感染人的疟原虫类寄生虫的接种组合物，它包含作为活 性成分的重组蛋白，该重纽蛋白的必要组成性多肽序列为 感染人的疟原虫类寄生虫的裂殖子形式的表面蛋白1 ( MSP - 1蛋 白)的19kDa ( p19 )的C -末端片段的序列，其中在感染周期中的 进入人红细胞的穿透阶段的末期，所述C -末端片段通常仍铺定在寄生虫表面；应答的该片段的一部分的序列； 或能诱导与由所述p19片段或该片段所述部分产生的等价的细胞和/ 或体液免疫应答的肽的序列；和所述重组蛋白进一步包含在还原介质中不稳定，并组成由抗相应 疟原虫而形成的人抗血清所识别的大部分表位的构象表位。
18. 根据权利要求17的接种组合物，其特征在于其活性成分由根掂 权利要求2- 13任一项或16的重组蛋白，或根据权利要求14或权利 要求15的寡聚体組成。
19. 一种抗感染人的症原虫类寄生虫的接种组合物，其包含作为活 性成分的根据权利要求17或权利要求18的重組蛋白的寡聚体。
20. —种抗体，其特异性识别感染人的非间日症原虫的症原虫类寄 生虫的裂殖子形式的MSP - 1蛋白的p19 ,并且它不识别间日疟原虫。
21. 根据权利要求20的抗体，其特征在于它为单克隆的。
22. 根据权利要求20的抗体，其特征在于它为单克隆抗体，并且在 于它特异性识别恶性疟原虫的p19 。
23. 根据权利要求20的单克隆抗体，其特征在于它特异性识别间日 疟原虫的p19 。
24. —种区分由间日疟原虫导致的寄生虫感染和由其它症原虫导致 的寄生虫感染的区别诊断方法，其特征在于将被痦原虫感染的生物样品 与4艮据权利要求23的抗体和与根据权利要求21或权利要求22的抗体 接触，并依情况检测免疫反应的产生或未产生。
25. —种重组杆状病毒类型的修饰载体，其在包含于所述载体中并 被所述载体转化的细胞识别的启动子的控制下，包含编码可与杆状病毒 系统中的表达相容的信号肽的第一核苷酸序列，其特征在于第二核苷酸序列位于第一核苷酸序列下游，-也受所述启动子的控制并编码肽序列 感染人类的疟原虫类寄生虫的裂殖子形式的表面蛋白1 ( MSP - 1 蛋白)的19千這尔顿(p19 )的C -末端片段的序列，在感染周期中， 该C -末端片段在近入红细胞的穿逸阶段的末期通常仍然被锚定在寄生虫表面； 或该肽片段的 一部分，前提是第二序列在杆状病毒系统中的表达产物.或能诱导等价于由所述pl9肽片段或所述肽片段部分产生的应答的細 胞和/或体液免疫应答的肽；和所述核苷酸序列具有构成它的全部核苷酸的40 °/。 - 60 %范围的G和C 含量，优选至少50 % 。
26. 根据权利要求25的修饰载体，其特征在于所述第二个多肽序列 与在权利要求2 - 13任一项中定义的一致。
27. 根据权利要求25的修饰载体，其特征在于第二个核苷酸序列为 合成序列。
28. 根据权利要求25 - 27任一项的修饰载体，其特征在于第一核 苷酸序列编码来自间日疟原虫并通常与疟原虫MSP - 1蛋白相连的信 号肽。
29. 根据权利要求25 一 28任一项的修饰载体，其特征在于第二核 苷酸在3'末端失去疏水性的C -末端的最后序列，该序列参与诱导将 所述重组蛋白锚定至表达它的宿主的细胞膜上，尤其是可被杆状病毒感 染的昆虫细胞。
30. 根据权利要求25 - 29任一项的修饰载体，其特征在于它由修 饰的杆状病毒组成。
31. —种生物体，尤其是Sf9型昆虫细胞，其可被并且已被根据权 利要求25 - 29任一项的修饰载体转染。
32. 含有第一核苷酸序列的合成DNA ，其中第一核苷酸序列的至 少一部分编码下列肽序列 恶性疟原虫的裂殖子形式的表面蛋白1 ( MSP - 1 )的19kDa(pl9)的C -末端片段的序列，其中在感染周期中的其进入人红细胞的穿透 阶段的末期，所述C -末端片段通常锚定在寄生虫表面； 或该肽片段的一部分的序列，前提是所述DNA在杆状病毒系统中的 表达产物仍能诱导在体内可抑制由于相应寄生虫而导致的寄生虫血症 的免疫反应；'或能诱导与由所述pl9肽片段或该片段的所述部分产生的等价的细胞 和/或体液类型的免疫应答的肽的序列；和所述核普酸序列还具有占组成所述合成DNA的核苷酸总量的40 - 60 % ，优选至少50 %的G和C核苷酸含量。
33. 根据权利要求32的合成DNA序列，其特征在于其第一核苷酸 序列在其3'末端失去了编码疏水C -末端最后区域的序列，该疏水性C -末端最后的区域通常参与诱导将p19蛋白铺定至表达它的宿主的细 胞膜上，尤其是可被杆状病毒转化的毘虫细胞。
34. 根据权利要求32或权利要求33的合成DNA序列，其特征在 于第一核苷酸序列之前是编码通常与疟原虫MSP - 1蛋白相连的信号 肽的信号核苷酸序列，其与主要序列同源或异源。
35. 根据权利要求34的合成DNA序列，其特征在于信号序列耒自 间日疟原虫。
36. 拫据权利要求32 - 35任一项的合成DNA ，其特征在于所述 第一核苷酸序列包括编码多肽细胞膜锚定区的3'-末端序列，所述锚定 区将表达的重組蛋白固定至用含所述合成DNA的载体转化的宿主细胞 的膜表面，其中所述3'-序列与主要核苷酸序列同源，或是异源的，尤 其是来自间日疟原虫的序列。
37. 根据权利要求36的合成DNA ，其特征在于3'-末端序列来自 间日疟原虫。
38. 根据权利要求32 - 36任一项的合成DNA序列，其特征在于它失去了所述3'-末端序列。
39. 根据权利要求25的杆状病毒类型的载体，其特征在于它选自 以登记号I - 1659保藏在CNCM 〔全国微生物培养物保藏中心〕的 病毒； 以登记号I- 1660保藏在CNCM的病毒； 以登记号I - 1661保藏在CNCM的病毒； 以登记号I- 1662保藏在CNCM的病毒； 以登记号I - 1663保藏在CNCM的病毒。
40. 分泌具有权利要求21 - 23任一项的抗体的特征的单克隆抗体 的杂交瘤。
41. 一种从肽混合物中分离具有指定特异性的pl9肽的方法，其特 征在于通过将所述肽混合物与根据权利要求20 - 23任一项的相应抗体 接触，优选为已固定在不可溶载体上的抗体，接着解离所形成的抗原-抗体复合物，并回收纯化的pl9肽。
42. 根据权利要求1 - 13任一项的蛋白质或根据权利要求15或16 的寡聚体在制备可诱导抗疟原虫感染的免疫应答的免疫原组合物中的 用途。
43. —种疫苗組合物，包含作为活性成分的根据权利要求1 - 13 任一项的蛋白与需要时至少除去了保宁性较差部分的相应的p42 ,或来 自与产生所述蛋白同源的寄生虫的另一重组p19或p42类蛋白的混合 物。
44. 根据权利要求23的疫苗组合物，其特征在于活性成分的混合物 选自下面的混合物 恶性疟原虫p19和间日疟原虫p19 ; 恶性疟原虫p19和恶性疟原虫p42 ; 间日疟原虫pl9和间日症原虫p42 ，如果需要，去除了其最可变区； 恶性疾原虫pl9和恶性疟原虫p42 ，如果需要，去除了其最可变区， ^间日疟原虫pl9和间日疟原虫p42 ，如果需要去除了其最可变区。
45. 根据权利要求40的杂交瘤，其特征在于它已于1997年2月14日保藏在CNCM (巴黎，法国)，登记号为I - 1846 。
全文摘要
本发明涉及一种在杆状病毒系统中制备的重组蛋白，其必要组成性多肽序列为感染人的疟原虫属类寄生虫尤其是恶性疟原虫的裂殖子形式的表面蛋白1(MSP-1蛋白)的19kDa(p19)C-末端片段的序列，该C-末端片段通常在感染周期中其进入人红细胞的穿透阶段末期仍然锚定在寄生虫表面。所述重组蛋白可用于生产抗疟疾的疫苗。
文档编号C12R1/01GK101230104SQ20061010909
公开日2008年7月30日 申请日期1997年2月14日 优先权日1996年2月14日
发明者C·罗斯, F·纳托, J·W·巴恩维尔, K·曼迪斯, S·朗加克里-安德里 申请人:巴斯德研究所;纽约大学