专利名称：具有抗人体内病原菌感染的被动免疫力的新抗体的制作方法
大体上讲，本发明涉及针对选定的病原体例如，疟原虫，上的抗原决定基的单克隆和重组抗体。含有这些抗体的组合物及制备和使用这些组合物的方法。
疟疾是一种严重的，广泛传播性疾病，它是由原生动物寄生虫疟原虫属的各个种引起的，包括感染人类的四个种。例如，恶性疟原虫，间日疟原虫，卵形疟原虫以及三日疟原虫，卵形疟原虫以及三日疟原虫[参见，例如，V.Enea et al.，Science，225628-630(1984)]。由于没有控制传病媒介群体以及新的抗药株的有效疫苗和计划，因而疟疾是今天仍存在于世界上的最广泛和致使疾病之一。大体上讲，疟疾的治疗主要依靠预防性药物，如4-氨基喹啉。但是，对于大多数病例，恶性疟原虫引起的抗药性以及产生某些不希望有的副作用已经损害了这些药物治疗剂的效果。
在疟疾病预防领域内更多的研究计划集中于疟原虫寄生虫的子孢子形式，特别是环子孢子(CS)蛋白质[Clyde et al.，Am.J.Trop.Med.Hyg.，24397(1975);Rieckman et al.，Bull.WHO，57(1)261(1979);and U.S.Patent4，957，869]。已有人报道了疟原虫属内许多种的CS蛋白质基因或其片段的克隆化及特征及其在大肠杆菌或酵母宿主细胞中的重组表达。CS蛋白质的中央重复区是免疫显性的，即，如果技术人员将子孢子注入动物中，该动物产生抗重复区的抗体。在人体进行试验的第一种抗子孢子候选疫苗是以在恶性疟原虫CS蛋白质上存在的重复抗原决定基为依据的，该抗原决定基是由(AsnAlaAsnPro)37(AsnValAspPro)4组成的，在迄今为止所检查的许多菌株中该抗原决定基始终没有变异。利用称为R3 2 tet3 2的一种候选疫苗进行临床试验，在志愿的人中产生抗子孢子激发的保护性应答，其中疫苗由NH2-Met-Asp-Pro-[(Asn-Ala-Asn-Pro)15(Asn-Val-Asp-Pro)1]2-Leu-Arg-Arg-Thr-His-Arg-Gly-Arg-His-His-Arg-Arg-His-Arg-Cys-Gly-Cys-Trp-Arg-Leu-Tyr-Arg-Arg-His-His-Arg-Trp-Gly-Arg-Ser-Gly-Ser-COOH，组成[参见，Ballou et al.，The Lancet，June 6，1987，pp.1277-1281;and European Patent Publication No.0192626，1986年8月27日出版，该文献引入本文作为参考]。
已经鉴别了许多针对来源于疟原虫生命周期各个阶段的蛋白质的许多单克隆抗体(mAbs)并且在鼠和猴中进行的被动转移试验中证明其是有效的[Y.Charoenvit et al.，J.Immunol.，146(3)1020-1025(1990)]。尽管如此，使用抗体治疗或预防疟疾仍有缺点。由于人体针对外源抗体产生的不利免疫应答，例如，快速清除和毒副作用，限制了将鼠或其他动物的抗体施用于人体。已经证明在人体内的上述免疫应答是针对鼠抗体的免疫球蛋白不变区和可变区的。
在现有技术中已经描述了几种技术，建议改变鼠(和其他种类)的抗体以降低在所期望的物种，例如人类中出现针对亲本抗体的免疫应答[参见，例如，PCT专利申请No.PCT/WO86/01533，1986年3月13日出版;英国专利申请No.GB2188638A，1987年10月7日出版;Amit等人，Science，233747-753(1986);Queen等人，Proc，Natl.Acad.Sci.USA，8610029-10033(1989);PCT专利申请No.PCT/WO90/07861，1990年7月26日出版;以及Riechmann et al.，Nature，332323-327(1988)]。尽管现有技术建议了可能的实验技术，但没有指出怎样提供对于有效抑制恶性疟原虫的体内生长所需的结合特征。
在本领域内仍需要另一种提供抗选定病原体如疟疾寄生虫感染的免疫性的方法，尤其是需要能提供有效短期保护的预防剂。
一方面，本发明提供了来自于针对一种病原体上的选定抗原决定基的单克隆抗体的互补决定区(CDR)肽，以及这些肽的片段及类似物。优选的是，该抗体能结合疟原虫的一个抗原决定基，特别是CS重复区抗原决定基或其片段，例如鼠抗恶性疟原虫mAb NFS2。这些CDRs保留了从其来源得到的mAb的抗原结合特异性。
另一方面，本发明提供了一种离体的，天然存在或合成的，人性化的免疫球蛋白轻或重链可变区的氨基酸序列，该序列包括一种或多种源于一种选定抗体的轻或重链的CDR序列。
还有一个方面，本发明提供了一种含有源于一种抗疟原虫抗体，一种抗疟原虫CDR，它的一种功能片段或类似物的可变轻链和/或重链的第一氨基酸序列的一种融合蛋白。将该选定的氨基酸序列通过操作后连接或融合到第二个选定的氨基酸序列上。这些融合蛋白具有mAb的抗原结合特异性，上述的第一选定氨基酸序列来源于该mAb。
本发明的再一方面提供了一种对选定的疟原虫抗原决定簇，例如，恶性疟原虫重复区域具有特异性的基因工程抗体。
在另一方面，本发明提供了一种由筛选杂交瘤产品产生的恶性疟原虫抗体或其片段，该杂交瘤产品来源于具有mAb NFS2抗原决定簇的任何种类免疫球蛋白全部组分，或人或鼠抗体组合文库。
又一方面，本发明提供上面描述的经过加工的抗体或抗-疟原虫mAbs的Fab片段。
作为又一附加方面，本发明提供了编码本文描述的蛋白质，肽，抗体和片段的核酸序列，以及含有一种或多种该核酸序列的质粒，用其转化的宿主，以及在宿主细胞，例如哺乳动物细胞中生产这些核苷酸序列表达产物的方法。
本发明提供的其他方面包括可给有可能接触疟疾寄生虫的人体提供被动免疫力的一种药物组合物和一种预防方法，该组合物含有一种有效量的至少一种本文描述的蛋白质，抗体，肽或片段以及一种药物学上可接受的载体或稀释剂。
本发明的其他方面和优点进一步在下面详细描述的优选实施例中描述。
图1描述mAb NFS2的天然存在的轻链可变区的氨基酸和核苷酸序列。
图2描述含有抗-疟原虫CDRs的合成的人性化轻链可变区pfhzlcl-1的氨基酸和核苷酸序列。底下划线的部分为CDRs。
图3描述了合成的人性化轻链可变区pfhzlcl-2的氨基酸和核苷酸序列。
图4描述了天然存在的mAb NFS2的重链可变区的氨基酸和核苷酸序列。
图5描述了一种合成的人性化重链可变区pfhzhc2-4的氨基酸和核苷酸序列。
图6描述了合成的人性化重链可变区pfhzhc2-3的氨基酸和核苷酸序列。
图7图解表示在哺乳动物细胞中用于表达合成的抗疟原虫重链的pfhzhc2-3-Pcd质粒。该质粒含有一种β-内酰胺酶(β-lac)基因，一种SV40复制源(SV40)，一种巨细胞病毒启动子序列(CMV)，合成的重链pfhzhc2-3，来源于牛生长激素(BGH)的多聚A信号，一种β球蛋白启动子(β glopro)，一种脱氢叶酸还原酶基因(DHFR)，以及来自背景pUC19的另一种BGH序列多聚A信号。
图8是图解表示用于在哺乳动物细胞中表达合成轻链的pfhzlcl-1-Pcn质粒图。该质粒图不同于图7中的质粒，其不同点是本质粒含有合成的人性化轻链pfhzlcl-1，而不是其重链，并且以一个新霉素基因(Neo)代替DHFR。
图9描述了合成的人性化重链可变区pfhzhc2-6的核苷酸和氨基酸序列。
本发明提供了能够使被接种的人具有抗由选定的病原体感染人的一个短持续时间，保护性免疫状态的预防剂，例如，用于控制传染以及用于有可能接触了该病原体的患者。重组或经过加工的抗体，优选的是嵌合、人性化或人单克隆抗体，能够用作为这样的被动保护性蛋白。在预防组合物中的这些蛋白质可以在与病原体接触前供药，并且不要求每天服用连续剂量以介导短期保护。
虽然下面的描述特定地指能够提供对病原体-恶性疟原虫(人类疟疾的一种致病因素)的子孢子形式的被动性预防作用的抗体，但本文中描述的发明并不只限于任何特定状态的病原体，也不是只限于一种单独的病原体。按照本发明的教导，本领域内熟练技术人员能够构建针对选定的病原体，例如，其他种类疟原虫，包括血期，肝期，或配子母细胞期的其他重组抗体。根据本发明还可以构建针对其他人感染性寄生虫，例如，三日疟原虫，间日疟原虫以及卵形疟原虫的环子孢子CS基因的本发明的抗体，以提供用于抗这些寄生虫感染的被动转移蛋白质。同样，根据本发明提供的被动治疗剂可以涉及其他感染剂，病毒，细菌等等。另外，也可以将这样的抗体用作治疗急性感染期的治疗剂。
1.定义“第一融合配对体”是指编码氨基酸序列的一个核酸序列，该氨基酸序列可以是整个或部分的免疫球蛋白重链，一个轻链，及其含有来自一条或两条链的可变区以及其CDRs的功能片段或一种类似物。它们具有选定的高效价抗体，优选的是鼠抗体，NFS2的抗原结合特异性。
“第二融合配对体”是指编码一种蛋白质或肽的核苷酸序列，第一融合配对体与该核苷酸序列进行框架融合，或者供助一种任选的常规接头序列而融合。较好的情况是该第二融合配对体与第一融合配对体是异源的。第二融合配对体可以包含编码第二个有意义抗体区，例如，整个或部分的合适人可变区或骨架区的核苷酸序列。
“融合分子”是指第一融合配对体通过操作后连接到第二融合配对体上的产物。融合配对体的“可操作连接”的定义为能使来自供体抗体的抗原特异性的抗恶性疟原虫序列(第一融合配对体)以及具有所需特征的第二融合配对体表达的一种结合。例如，可以使用或不使用一种编码氨基酸接头的核苷酸序列，或者通过框架融合连接至第二融合配对体上。
“融合蛋白”是指由融合分子编码的蛋白质，通过使融合分子在选定的宿主细胞中表达可以获得这种蛋白质。这种融合蛋白是经过加工过的抗体，例如，嵌合或人性抗体，或在本发明识别的融合至免疫球蛋白或非免疫球蛋白上的任何抗体片段等等。
“供体抗体”是指将其天然存在或经修改的可变轻和/或重链，其可变区，其CDRs或其他功能片段作为第一融合配对体以便提供具有供体抗体抗原特异性的融合分子和融合蛋白的抗体(多克隆，单克隆或重组)。适用于在本发明中使用的供体抗体是鼠mAb NFS2以及在下文中描述的其他抗体。
“受体抗体”是指一种与供体抗体异源，但与要治疗的患者(人或其他哺乳动物)同源的抗体(多克隆，单克隆或重组)，该抗体将其可变重和/或轻链骨架区和/或其重和/或轻链不变区的整个或任何部分的序列用作为第二融合配对体。优选的情况是将人抗体作为受体抗体。
“CDRs”的定义是抗体的互补决定区氨基酸序列，它是重和轻链的高度可变区。CDRs提供用于将抗体与抗原或抗原决定簇结合的主要接触残基。本发明有意义的CDRs来源于供体抗体可变重和轻链序列，并且包含天然存在的CDRs的功能片段和类似物，它共有或保留了相同于其来源的供体抗体的抗原结合特异性。
“共有抗原结合特异性”是指，例如，虽然mAb NFS2具有一定水平的抗原亲和性特征，并且在合适的结构环境中由NFS2的核酸序列编码的CDR可能有较低的亲和性，但期望在上述环境中NFS2的CDRs将识别相同于NFS2的抗原决定簇。
“功能片段”是保留了相同于源生该片段的抗体抗原结合特异性的部分CDR序列或部分重或轻链可变序列。
“类似物”是指通过取代至少一种氨基酸，改变或化学取代一种氨基酸而经修饰的氨基酸或肽序列，这种修饰使氨基酸序列保留了未修饰序列的生物学特征，例如，抗原特异性。
“等位变异或修饰”是在编码本发明氨基酸或肽序列的核酸序列中进行的变化。上述变异或修饰是由于遗传密码简并引起的，或者是经过专门的加工后提供所需的特征。这些变异或修饰导致或不导致所编码的氨基酸序列的变化。
“工程抗体”是一种融合蛋白类型，即一种合成抗体(例如，一种嵌合或人性化抗体)，其中由来自于具有针对所选定的抗原决定簇的特异性的一种或多种供体抗体的CDRs类似部分替代了一种选定的受体抗体上的轻和/或重链可变区的一部分。这些工程抗体也具有改变编码受体抗体轻和/或重链可变区骨架区域的核酸序列以保留供体抗体结合特异性的特征。这些抗体可以包括来自于受体抗体的免疫球蛋白不变区和可变骨架区，以及来自于本文描述的疟原虫供体抗体的一种或多种CDRs。本发明中优选的工程抗体是采用重组DNA技术制备的。
“嵌合抗体”是指工程抗体的一种类型，它含有来源于非人供体mAb的天然存在的可变区轻链和重链(CDR和骨架区)与来源于一种人(或其他异源动物)受体mAb的轻和重链不变区的结合物。
“人性化抗体”是指一种工程抗体，它具有来源于非人供体免疫球蛋白的轻和/或重链可变域骨架区的CDRs和/或其他部分，并且其余部分为源于一种或多种人免疫球蛋白的部分分子。这样的抗体还包括其特征为与一种供体或受体的未修饰轻链或一种嵌合轻链相结合的人性化重链或相反情况的工程抗体。
“效应剂”是指非蛋白质载体分子，采用常规方法在该分子上结合了融合蛋白，和/或该供体抗体的天然或合成轻或重链或该供体抗体的其他片段。这样的非蛋白质载体可以包括在诊断领域内使用的常规载体，例如，聚乙烯或其他塑料珠，或在医学领域内使用的并且能安全地给人和动物给药的其他非蛋白质物质。其他效应剂还包括用于螯合一种重金属原子，或如蓖麻蛋白类的毒素的大环分子。这样的效应剂可用于增加抗疟原虫衍生的氨基酸序列的半衰期或用于增加其特性。
Ⅱ.抗疟原虫抗体为了构建本发明的与引起疟疾的病原体相关的重组抗体，可以使用非人种类在源于能感染人体的疟原虫菌株抗原存在下以产生令人满意的供体抗体。采用常规的杂交瘤技术以制备能分泌抗所选定抗原的非人mAb的杂交瘤细胞系。作为一个实施例，已经识别出鼠mAb，NFS2为所需要的抗体，该抗体可用于制备本发明的嵌合或人性化抗体。
鼠IgG mAb NFS2h具有针对恶性疟原虫CS蛋白重复区的抗原结合特异性。在体外检测中，它能阻碍子孢子侵入人肝细胞或肝癌细胞。在鼠模型动物中类似抗体已使鼠具有抗疟疾的被动性保护作用。在下文的实施例1中详细地描述了mAb NFS2的制备过程。
本发明不限于举例的NFS2mAb以及其高度可变序列的使用。在下面的描述中，将供体mAb记作NFS2，设计这样的方案的目的仅是为了使描述简单化。可以用其他抗疟原虫抗体替代。合适的抗体包括，例如抗CS重复蛋白的鼠mAb2A10，或在R.A.Wirtz et al.，Bull WHO，6539-45(1987)中描述的其他mAbs。
在本发明中同样可以使用通过用所选定的疟原虫种类的子孢子或保护性抗原决定簇免疫接种而受到保护的其他动物产生的抗体作为保护性抗-疟原虫序列的来源。
例如，可以用恶性疟原虫CS蛋白质重复区蛋白质R32tet32NH2-Met-Asp-Pro－[(Asn-Ala-Asn-Pro)15(Asn-Val-Asp-Pro)1]2-Leu-Arg-Arg-Thr-His-Arg-Gly-Arg-His-His-Arg-Arg-His-Arg-Cys-Gly-Cys-Trp-Arg-Leu-Tyr-Arg-Arg-His-His-Arg-Trp-Gly-Arg-Ser-Gly-Ser-COOH诱导出具有结合特异性的人和鼠mAbs。该重复区蛋白是用于筛选能在抗疟疾感染的预防剂中使用的中和性抗体的合适靶。
同样，可以将NFS2能应答的抗原决定簇以及其类似物用于筛选和制备其他的抗疟原虫抗体，以用于制备能在短期内保护人抵抗疟疾的预防组合物。令人注目的其他抗原决定簇包括疟原虫种的非重复性侧区抗原决定簇，其他重复域或各种肝，和血和有性期的抗原决定簇。对这些抗原决定簇的了解能使本领域内任一技术人员合成的和识别天然存在的适合于提供抗恶性疟原虫或其他疟原虫种的被动或主动免疫肽。这些知识还使生产的mAbs能用于预防疟疾感染人类。
例如，利用在本文中描述的鼠mAb抗原决定簇通过筛选杂交瘤或其他联合文库，或抗体噬菌体陈列库[W.D.Huse et al.，Science，2461275-1281(1988)]而制备其他恶性疟原虫抗体。用常规竞争检测法，如在下文实施例中描述，用本文中描述的一种或多种抗原决定簇可以筛选包括杂交瘤产物，或源于任何种类免疫球蛋白全组份抗体在内的一个抗体集合体。
如那些在上文中描述的抗体，包括那些针对一种所需要抗原决定簇的抗体以及用常规方法包括但不限于，编码鼠mAbs，人mAbs，的基因产生的抗体，以及联合体抗体都可用于作为供体抗体，作为抗体片段源，以及用于抗人体的恶性疟原虫的预防组合物中。优选的是，应答疟原虫，尤其是恶性疟原虫，抗原决定簇时产生的抗体可用作为在制备融合蛋白，包括基因工程抗体中需要的可变重和/或轻链氨基酸序列，或其功能片段(例如，CDRs)的供体。因此，本发明也可以利用除NFS2以外的供体抗体，这些抗体能结合到基本上由重复蛋白的氨基酸序列以及其类似物组成的恶性疟原虫肽上。
另外，可以进一步改变或操作在本文中鉴别的mAbs，其他用子孢子，R32tet32或本文中鉴别的重复抗原决定簇制备的并且对其应答的mAbs以使之具有其他的所需的预防特性。
Ⅲ.抗体片段，氨基酸和核苷酸序列本发明提供了离体的天然存在的或合成的源于mAb NFS2的可变轻链和可变重链序列，以及CDRs和其片段，这些成分都可用于设计具有该mAb抗原结合特异性的融合蛋白(包括基因工程抗体)。
天然存在的NFS2的可变重链具有在图4中描述的氨基酸和核苷酸编码序列的特征。该链具有含下列核苷酸和推测的氨基酸的序列的CDRs的特征。CDR1具有下列序列特征AGCTATGCCATGTCTSerTyrAlaMetSer.
天然存在的CDR2核酸和氨基酸序列是GAAATTAGTGATGGTGGTAGTTACACCTACTATCCAGACACTGTGACGGGCGluIleSerAspGlyGlySerTyrThrTyrTyrProAspThrValThrGly.
天然存在的CDR3具有核酸和氨基酸序列是CTCATCTACTATGGTTACGACGGGTATGCTATGGACTACLeuIleTyrTyrGlyTyrAspGlyTyrAlaMetAspTyr.
合成的人性的NFS2可变区重链具有在图5和图6中显示的氨基酸和核酸编码序列的特征。在二条合成链中，CDRs具有下列核苷酸和推测的氨基酸序列。由天然存在的CDRs制备核苷酸发生变化的CDR1。并在底下划线处表示核苷酸的变化。合成的CDR1具有下列序列特征AGCTATGCCATGAGCSerTyrAlaMetSer.
合成的CDR2核酸和氨基酸序列相同于天然存在的序列。合成的CDR3具有相同于天然存在的CDR3的核酸和氨基酸序列。
天然存在的NFS2的可变轻链具有图1所示的氨基酸序列和核酸编码序列的特征。该链还具有的特征是有下列核苷酸和氨基酸序列的CDRs。CDR1具有的核酸和氨基酸序列特征为AAGTCCAGTCAGAGCCTTTTATATAGTAGCAATCAAAAGAATTACTTGGCCLysSerSerGlnSerLeuLeuTyrSerSerAsnGlnLysAsnTyrLeuAla.
CDR2具有的核酸和氨基酸序列特征为
TGGGCATCCACTAGGGAATCTTrpAlaSerThrArgGluSer.
CDR3具有的核酸和氨基酸序列特征为CAGCAATATTATAGCTATCCTCGGACGGlnGlnTyrTyrSerTyrProArgThr.
合成的人性化的NFS2可变轻链具有图2中显示的氨基酸和核酸编码序列的特征。该链具有含下列推测的氨基酸序列和由所显示的核苷酸序列编码的CDRs特征。
由天然存在的相应CDRs制备核苷酸发生变化的三个CDRs。底下划线部分表示这种改变。合成的CDR1具有的核酸和氨基酸序列特征为AAGAGCTCTCAGAGCCTTTTATACTCGAGCAATCAAAAGAATTACTTGGCCLysSerSerGlnSerLeuLeuTyrSerSerAsnGlnLysAsnTyrLeuAla.
合成的CDR2具有的核酸和氨基酸序列特征如下TGGGCGTCAACTAGGGAATCTTrpAlaSerThrArgGluSer.
合成的CDR3具有的氨基酸序列和核苷酸编码序列特征如下CAGCAATATTATAGCTATCCGCGGACGGlnGlnTyrTyrSerTyrProArgThr.
另一个合成的人性化NFS2的可变轻链具有图3中所示的氨基酸和核酸编码序列特征。该链具有相同于图2中合成序列的CDR1和3的特征。尽管如此，由天然存在的相应CDR2和图2中合成CDR2制备核苷酸发生变化的CDR2。用底下划双线表示来自于图2合成序列的变化。合成的CDR2具有的核酸和氨基酸序列特征如下TGGGCGTCGACTAGGGAATCTTrpAlaSerThrArgGluSer.
本发明还包括Fab片段或F(ab′)2片段的使用。一种Fab片段含有完整轻链和重链的氨基末端部分;并且F(ab′)2片段是由通过二硫键结合的二个Fab片段形成的片段。MAb NFS2以及由其衍生的并在下文中描述基因工程抗体提供了可由常规方法，例如由合适的蛋白酶，木瓜蛋白酶和/或胃蛋白酶裂解mAb，或由重组方法获得Fab片段和F(ab′)2片段的来源。该Fab片段或F(ab′)2片段可从上文描述的任何mAbs得到，作为体内抵抗疟疾病原体，特别是恶性疟原虫感染的保护剂。
可以用鼠mAb NFS2的可变链肽序列，其可变链肽序列和CDRs，功能片段，fab片段，以及其类似物，和编码这些分子的核酸序列获得编码所需融合蛋白的各种融合分子，特别是基因工程抗体，并且用于制备和施用含有这些分子的药物组合物的方法中。
编码可变轻链和重链肽序列或CDR肽或其功能片段的本发明的核酸序列或其片段可以未修饰形式使用，或合成这些序列以诱导所需要的修饰。可以使从mAb NFS2或从其他所需抗疟原虫抗体衍生的离体的天然存在或合成的核酸序列选择性地含有限制性位点以促进其插入或连接到编码一种所需抗体骨架区的合适的核酸序列上，与诱变的CDRs连接，或与编码所选定的第二融合配对体的核酸序列融合。
考虑到遗传密码的简并性，构建编码本发明的可变重和轻链氨基酸序列，和CDR序列，例如图1-6，以及编码共有供体抗体的抗原特异性的功能片段及其类似物的各种编码序列。当与第二种融合配对体通过操作结合后，可以用编码可变链肽序列或CDRs或其功能片段的本发明的离体的或合成的核酸序列或其片段制备融合蛋白，即嵌合或人性化抗体或本发明的其他基因工程抗体。
还可以用这些序列在编码CDRs或骨架区的核酸序列内诱变插入特定的变化，并将得到的经修饰或融合的核酸序列掺入到表达载体中。例如，可以在编码CDRs的核苷酸序列内制备静止核苷酸替代，以创制限制性酶位点诱变骨架的插入，或在类似于供体抗体的那些核苷酸位置上修饰选定的骨架。这样的突变可以包括那些为了提供较高的抗原结合亲和性目的而插入的突变。
Ⅳ.融合分子和融合蛋白本发明的融合分子能编码工程抗体，嵌合抗体和人性化抗体。所需的融合分子可以含有通过操作法连接到第二融合配对体上的第一融合配对体，该第一融合配对体编码的氨基酸序列具有针对重复蛋白氨基酸序列和其类似物的疟原虫抗体的抗原特异性。令人满意的情况是第一融合配对体的来源是一种选定的mAb，例如，mAb NFS2，图1和图4中核酸序列的来源。
一种融合分子可以编码图4中天然存在的可变重链序列以及其功能片段或类似物的氨基酸序列，可以编码图1中的天然存在的可变轻链序列，以及其功能片段或类似物，或一种或多种NFS2 CDRs的氨基酸序列。另一种典型的融合分子可以编码来自抗体mAb(如在图2，3，5和6中描述的)的，具有恶性疟原虫抗体的抗原特异性的合成可变重和/或轻链。
本发明中令人满意的融合分子的特征是可以编码含至少一个;优选的是所有鼠NFS2抗体的重和/或轻链可变区的CDRs，或其功能片段或类似物的氨基酸序列。
第二融合配对体的定义如上所述，并且该第二融合配对体可以包括编码与具有NFS2的抗原特异性的含CDR的序列异源的一个肽，蛋白质或其片段的序列。这样的序列的例子是编码有意义的第二抗体区的序列并选择性包含一个接头序列。
如果第二融合配对体本身编码一种治疗蛋白，或其他特征性抗原，如果该融合配对体编码一种具有其自身抗原特异性的蛋白质，则得到的融合分子可以编码抗-恶性疟原虫抗原特异性和第二融合配对体的特征性，例如，一种功能特征，如从重组宿主中分泌，或一种治疗特征。
如果第二融合配对体是来源于另一种抗体，例如，免疫球蛋白骨架或不变区的任何同型或类别(优选的是人)等等，则得到一种工程抗体。因此，例如，本发明的一种融合分子可以包括具有全长重和轻链(图4和1)的完全抗体分子。例如，本发明包括离体的天然存在或合成的核酸序列，该序列编码来自于所需疟原虫mAbs的可变区序列，CDR肽，其片段，一种工程抗体的任何片段，如Fab或F(ab′)2片段，一种重链二聚体，或如Fv或单链抗体(SCA)的任何基本重组片段，或编码具有相同于选定的mAb，例如，疟原虫mAb NFS2的特异性的一种蛋白质的任何其他序列。
第一融合配对体还可以与上文中定义的效应剂联合使用，采用常规方法通过操作后可将第一融合配对体连接到该效应剂上。例如，通过共价桥键结构吸附到编码NFS2核酸上。
采用任何合适方法，例如，采用常规共价或离子键，蛋白质融合，或异源双功能交联剂，例如，碳化二亚胺，戊二醛等等，可将第一融合配对体和选定的第二融合配对体融合或键合。如果第一融合配对体与一种效应剂结合，可采用非蛋白质的，惯用化学连接剂将抗恶性疟原虫氨基酸序列融合或连接到效应剂上。这些技术在本领域内是已知的，并且在常规的化学和生物化学课本中进行了简单描述。
另外，还可以将能方便地在该融合配对体或在第一融合配对体和效应剂之间提供所需数量空间的常规椭性接头序列构建到融合分子中。设计这种接头的方法也是本领域内技术人员熟知的。
表达这些融合分子得到本发明的融合蛋白。一种特定的所需类型的融合蛋白包括工程抗体，在该抗体中，以最小程度，用来自一种或多种供体单克隆抗体可变轻和/或重链的类似部分替代一种受体mAb的可变重和/或轻链区片段，该供体单克隆抗体包括本文中描述的疟原虫mAbs，如NFS2。
特定的所需工程抗体是一种人性化抗体，在其中来自于所需供体鼠mAb的CDRs插入到一种人抗体的骨架区。一种优选的供体抗体是一种针对疟原虫抗原决定簇的抗体，优选的是特异于恶性疟原虫的重复区抗原决定簇的抗体，优选的是特异于恶性疟原虫的重复区抗原决定簇的抗体。一种特定的优选的供抗体具有NFS2的整个或部分可变区氨基酸序列。在这些人性化抗体中，将来自于疟原虫抗体重链和/或轻链可变区的一个，二个或优选的是三个CDRs插入到所选定的人抗体的骨架区，以替代该后一抗体的天然CDRs。
优选的是，通过CDR替代已改变了在人重和轻链内的可变区。因此，该人性化的工程抗体优选地具有天然人抗体或其片段的结构。这样的人性化抗体可以包括或不包括受体mAb轻和/或重可变域骨架区内的最小变化以保留供体mAb结合特异性。该人性化抗体具有为有效地抵抗和治疗人或动物中感染性恶性疟原虫疟疾所需的综合特性。
其余的工程抗体可从任何合适的受体人免疫球蛋白中获得。一种合适的人抗体可以是一种从常规数据库，例如，Kabat数据库，Los Alamos数据库，以及Swiss蛋白质数据库中选择出的与供体抗体的核苷酸和氨基酸序列同源的抗体。具有与供体抗体的骨架区(以一种氨基酸为基础)同源特征的人抗体适合于为插入供体CDRs而提供重链不变区和/或重链可变骨架区。以同样的方式选择到能够供应轻链不变或可变骨架区的合适的受体抗体。应该注意，不要求受体抗体重和轻链必须来源于相同人抗体。
令人满意的情况是，从人免疫球蛋白类别和同型，如IgG(亚型1-4)，IgM，IgA和IgE选择异源骨架和不变区。但是，受体抗体不需要只包括人免疫球蛋白序列，例如还可以构建一种基团，其中将编码部分人免疫球蛋白链的DNA序列融合到编码一种多肽效应剂或受体分子的氨基酸序列的一种DNA上。
如一个实例，通过用编码NFS2可变轻链区的CDRs或其功能片段的合成核酸序列替代至少编码一种受体mAb的轻链可变区的部分核酸序列，并用编码NFS2的可变重链区的CDRs或其功能片段的核酸序列替代至少编码一种受体mAb，如一种人抗体的重链可变区的部分核酸序列，而编码一种工程抗体。得到的人性化抗体具有mAb NFS2的抗原结合特异性特征。
或者换一种方法，可将本发明的工程抗体(或其他单克隆抗体)吸附至它的一种效应剂或受体分子上。或者，可以用重组DNA技术的步骤生产本发明的一种工程抗体，其中已用一种酶或毒素分子替代了一种完全抗体分子的Fc片段或CH3区。
本领域内熟练技术人员明白，通过改变可变区氨基酸，但不一定必须影响供体抗体的特异性而进一步修饰上述工程抗体。可以考虑用在可变区骨架或CDRs或两种结构内的其他氨基酸替代重和轻链氨基酸。在抵抗人体内有效疟疾感染(例如，由恶性疟原虫)时使用这样的工程抗体是有效的。
另外，本发明提供了如上文中定义的嵌合抗体的融合蛋白。这些抗体由于能够提供整个供体抗体的重链和轻链可变区，包括骨架区例如图1和4，以用于融合到受体抗体的相应两条链的不变区上，因而不同于上面描述的人性化抗体。
Ⅴ.蛋白质和抗体的制备使用遗传工程技术，通过重组DNA方法可令人满意地构建本发明的融合分子，重组抗体或融合蛋白。也可以用同样或类似的技术制备本发明的其他具体物质，例如，构建上文中提到的嵌合或人性化抗体，合成的轻和重链，CDRs以及编码这些物质的核酸序列。
使用鼠NFS2的CDRs和一种或多种选定的人抗体轻和重链骨架区制备的本发明的特定的具体组合物列于实施例3中。简单地描述如下，使用常规方法克隆产生鼠NFS2抗体的杂交瘤，并用本领域内技术人员已知的技术获得其重和轻链可变区的cDNA，例如，在Sambrook et al.，Molecular Cloning(A Laboratory Manual)，第2版，Cold Spring Harbor Laboratory(1889)中描述的技术。利用PCR引物获得NFS2的可变区，并用已知的计算机数据库，例如，Kabat库鉴别该CDRs，并与其他抗体比较。
使用同样的数据库，例如Kabat库鉴别人抗体的重链可变区的同源骨架区，并选择与NFS2有同源性的人抗体作为受体抗体。设计在人抗体骨架区内含有NFS2 CDRs的合成重链可变区序列，在该序列的骨架区内可以发生或不发生核苷酸替代以用作为限制性位点。通过重叠聚核苷酸而合成如此设计的序列，通过聚合酶链反应(PCR)而扩增该序列，并校正错误。
以同样方式设计一个合适的轻链可变骨架区，产生含有NFS2CDRs的两条合成的轻链可变序列。参见，图2和3。如上文指出，轻链的来源不是限制本发明的一个因素。
采用下面方法，在构建本发明的融合蛋白和工程抗体，优选的是人抗体时使用了这些合成的可变轻和/或重链序列以及mAb NFS2的CDRs，和它们的核酸编码序列。通过常规方法，获得编码供体抗体可变重或轻链区的DNA序列，其中至少需要受体mAb轻和/或重链可变域骨架区的CDRs和那些基本部分以保留供体mAb结合特异性以及并且还需要来源于人免疫球蛋白的抗体链的剩余免疫球蛋白衍生部分。
通过操作后将这些融合蛋白的编码序列与能够控制其在宿主细胞中复制和表达并/或从宿主中分泌的常规的调节控制序列相结合而制备常规的表达载体或重组质粒。本领域内任一技术人员能容易地选择到这样的调节序列，并且本发明不限于这样的调节序列。调节序列包括启动子序列，例如CMV启动子，以及用本领域内任一技术从抗体制备的信号序列。
第一个载体可以含编码一个轻链衍生的多肽的核酸序列。同样，制备第二个表达载体，该载体具有编码一个互补抗体轻或重链的同样的DNA序列。优选的情况是，在这些载体中，至少可变区的CDRs(以及为保留供体mAb结合特异性而需要的受体mAb轻和/或重链可变域结构区的那些基本部分)来源于供体抗体并且剩余的源于免疫球蛋白的抗体链部分是从人免疫球蛋白得到的。优选的情况是，这些第二表达载体除编码序列和选择性标记物不同外相同于第一载体，以确保每一条肽链功能性地表达。
在另一种可选择的方法是，也可仅用本发明的单一载体，该载体含有编码轻链和重链衍生的多肽的序列。在该编码序列中编码轻和重链的DNA还包括cDNA或基因组DNA或两者都有。
使用了第一和第二载体(或单一载体)以及常规的技术共转染选定的宿主细胞，以制备含有重组或合成轻和重链的本发明的转染的宿主细胞。然后用常规技术培养转染细胞以制备本发明的工程抗体。采用合适的检测法，如ELISA检测法，以及下面实施例中描述的子孢子入侵抑制(ISI)检测法可从培养物中筛选含有重组重链和/或轻链的组合物的人性化抗体。可用相似的常规技术构建本发明的其他融合蛋白。
因此，本发明还包括含有本发明的融合分子或工程抗体的编码序列的重组质粒。采用常规技术制备这样一种载体，并且适当地含有上面描述的DNA序列以及通过操作后连接到编码工程抗体的DNA序列上的一种合适的启动子。供助于常规技术将上述载体转染到哺乳动物细胞中。
由任一本领域内的技术人员可以选择在本发明方法和组合物构建中的克隆和亚克隆步骤中使用的合适载体。例如，可用常规的pUC克隆载体序列。所使用的一种载体是pUC19，该载体可通过商业途径从供应商社，如Amershan(Buckinghamshire，United Kingdom)或Pharmacia(Uppsala，Sweden)处购买。另外，任何能简便地复制，有丰富的克隆位点和标记基因，并容易操作加工的载体可用于克隆。因此对克隆载体的选择不是本发明的一个限制性因素。
同样，由本领域内任一技术人员能从任何常规载体中选择出用于本发明中表达工程抗体的载体。该载体还含有选定的调节序列，该序列与免疫球蛋白区的DNA编码序列操作结合并能指导异源DNA序列在选定的宿主细胞中复制和表达，这种调节序列如CMV启动子。这些载体含有上面描述的编码工程抗体或其他融合蛋白的DNA序列。换种方法，可将载体掺入到为了便于操作插入所需的限制性位点而修饰的选定的免疫球蛋白序列中。
该表达载体的特征还在于具有适用于增加异源DNA序列表达的标记基因，例如，哺乳动物二氢叶酸还原酶基因(DHFR)或新霉素抗性基因(neoR)。其他优选的载体序列包括如来自牛生长激素(BGH)的一个多聚A信号序列，以及β-球蛋白启动子序列(β-glupro)。采用本领域内熟练技术人员熟知的技术可以合成本发明中使用的表达载体。
从天然源或用已知技术合成的用于指导重组DNA在选定的宿主中表达的物质都可获得上述载体的各种成分，例如复制子，选择基因，加强子，启动子等等。为了上述目的还可以选择本领域内已知的用于哺乳动物，细菌，昆虫，酵母和真菌表达的许多类型的其他合适表达载体。
在下列实施例中使用的用于表达合成的重和轻链序列的两个典型表达载体是哺乳动物载体Pfhzhc2-3-Pcd和Pfhzlc1-1-Pcn(见图7和8)。但是，本发明不限于使用这些举例的基于pUC19的载体。
本发明还包括用含有由本发明描述的工程抗体或其他融合蛋白的编码序列的重组质粒转染的细胞系。由于将这些克隆载体的克隆化和其他操作的宿主细胞也是常规使用的。但是，最满意的是，将来自于大肠杆菌的各种菌株的细胞用于克隆载体的复制以及在本发明的mAbs构建中的其他步骤。
用于表达本发明的工程抗体或其他蛋白质的适当的宿主细胞或细胞系优选的是真核细胞，并且最优选的是哺乳动物细胞，如CHO细胞或骨髓样细胞，可以用其他灵长类动物细胞作为宿主细胞，并且最令人满意的是使用人细胞，从而该蛋白质可用人糖基化模式进行修饰。另外，可以用其他真核细胞。合适的哺乳动物宿主细胞的选择，以及用于转化，培养，扩增，筛选和产物的制备及纯化的方法都是本领域内已知的。参见，例如，Sambrook et al.，如上所述。
细菌细胞也证明其是用作为表达本发明的重组mAbs的合适的宿主细胞。但是，由于在细菌细胞中表达的蛋白质趋向于是未折叠或非正确折叠形式或非糖基化形式，因而必需筛选出保留了抗原结合能力的细菌细胞产生的重组mAb。如果以正确折叠形式生产由细菌细胞表达的蛋白质，则该细菌细胞是满意的宿主。例如，用于表达的各种大肠杆菌菌株是生物技术领域内熟知的宿主细胞。枯草杆菌，链霉菌，其他杆菌等的各种菌株也可以在本方法中使用。
如果需要，还可以将本领域内熟练技术人员已知的酵母菌株细胞以及昆虫细胞和病毒表达系统用作为宿主细胞。参见，如Miller et al.，Genetic Engineering，8277-298，Plenum Press(1986)并引入本文作参考。
可用于构建本发明载体的通用方法，生产本发明的宿主细胞所需的转染方法，以及从上述宿主细胞制备本发明的融合蛋白，优选的是工程抗体所必需的培养方法全部是常用技术。同样，一旦制备出后，可以根据本领域内的标准方法，包括硫酸铵沉淀法，亲和柱柱层析，凝胶电泳等等从细胞培养物中纯化融合蛋白，优选是本发明的工程抗体。这些技术是本领域内技术人员已知的，并且不限制本发明。
然后采用适用于选定病原的检测法检查工程抗体的体外活性。使用目前的常规ELISA检测方案可以定性和定量地评估工程抗体与R32tet32抗原决定簇的结合情况。还可以用在实施例6描述的ISI检测法。可以完成类似的一种检测法-抑制入侵肝细胞的检测法(ILSDA)[S.Mellouk et al.，Bull.WHO，Suppl.6852-58(1990)]。另外，在进行随后的人临床研究前，还可以用在SCID鼠模型中目前建立的检测法验证效率以估测尽管存在清除机理但工程抗体仍能持久保留于体内。
下面的实施例说明了用于构建从鼠mAb NFS2衍生的人性化抗体的方法。根据所描述从该抗体制备人性化抗体的方法，本领域内的任一技术人员也可以从本文中描述的其他疟疾的抗体，可变区序列和CDR肽构建人性化抗体。用有可能被已改变的抗体受体识别为“自身”的可变区骨架制备工程抗体。在可变区骨架中进行微小修饰可以导致抗原结合力巨大增加，而受体的免疫原性并不发生可估计的增加。上述工程抗体能有效地被动地保护人体免受恶性疟原虫感染。
Ⅵ.治疗/预防用途可将本文中描述的融合蛋白，尤其是上文中描述的工程抗体，功能片段，类似物以及其他蛋白质和肽用作为预防剂，它能提供给受试者短期的对病原体感染的被动免疫力，从该病原体，例如，恶性疟原虫，衍生出原始抗原物质。通过将免疫球蛋白与病原体结合，并且随后通过正常功能的巨噬细胞而去除该结合混合物可以产生出由于使用本发明工程抗体而提供的保护作用。因此，本发明的工程抗体，当制成以适合于预防目的使用的制剂和配方时，对有可能与该病原体进行短期接触的人，例如，有可能在发病区旅行的旅行者，游客或军人是非常需要的。
因此，本发明还涉及预防治疗需要这种治疗的人体中恶性疟原虫感染的方法，该方法包括给有可能与疟原虫种接触的人体施用包括本文中描述的一种或多种工程抗体或其他融合蛋白或它们的片段的一种有效的保护剂量的抗体。
还可以将包括本发明的工程抗体或其片段的融合蛋白与其他抗体，尤其是能与引起该疾病的其他抗原决定簇发生反应的人mAbs联合使用，其中本发明的工程抗体直接抗导致疾病的抗原决定簇。同样，还可以以兽药组合物形式使用与能在选定的动物中引起疾病的其他抗原决定簇发生反应的mAbs，其中本发明的抗体直接针对引起疾病的抗原决定簇的。任何不与本发明的疟原虫抗体相抵触但能起作用的抗体，例如针对其他疟疾时期或不同抗原决定簇的抗体都能用于这些组合物中。
据认为本发明的预防剂能满意地在与病原体接触约4天-8周的时间内提供保护作用，而不需要加强使用该试剂的剂量。“短期”定义是指在人体内循环中本发明的重组抗体的相对持续期。
本发明的预防剂的给药方法可以是任何能将该药剂释放给宿主的合适途径。包括工程抗体，及其片段的融合蛋白，以及本发明的药用组合物特别适用于非肠道给药，也即皮下，肌肉或静脉内。但是该药剂优选采用肌肉注射法给药。
TGGGCGTCGA CTAGGGAATC T21(2)SEQ ID NO41的资料(ⅰ)序列特征(A)长度7个氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑结构未知(ⅱ)分子类型蛋白质(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO41Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser1 5(2)SEQ ID NO42的资料(ⅰ)序列特征(A)长度366个碱基对(B)类型核酸(C)股数双(D)拓扑结构未知(ⅱ)分子类型DNA(基因组)(ⅸ)特征(A)名称/关键词CDS(B)定位1..366(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO42
至约20mg/Kg的本发明的一种蛋白质或抗体通过非肠道给药，优选的是肌肉(i.m.)以及可能的是静脉(i.v.)给药。在接触病原体后可以以合适的间隔重复该剂量。
可将本文描述的抗体，工程抗体或其片段冻干贮存，并在使用前重新配制于合适的载体中。已经证明这些技术对常规的免疫球蛋白是有效的，并且可以用本领域内已知的冻干和重新配制方法。
使用治疗医生选定的剂量水平及模式将上述药物组合物单次或多次给药。无论如何，本发明的药物组合物应提供足够有效地抵抗感染所需的本发明的工程抗体的量。
下列实施例描述典型的工程抗体的构建，及其在合适载体和宿主中的表达，并且并不构成对本发明范围的限制。除有其他说明外，用传统代码或全称定义所有氨基酸。除有其他说明，所有限制酶，质粒，和其他试剂和材料是通过商业途径获得的。所有一般的克隆，连接和其他重组DNA技术是按照Sambrook et al.，以前描述，或其第一版描述完成的。
实施例1 描述制备NFS2的方法通过将恶性疟原虫子孢子重复注射到小鼠中，随后将B细胞与骨髓瘤细胞系融合可以制备鼠IgG mAb NFS2。鼠mAb NFS2的特征是具有针对恶性疟原虫CS蛋白质的重复区的抗原结合特异性。特殊地是，NFS2 mAb结合到抗原决定簇Pro Asn Ala Asn Pro Asn上。该抗体还可以结合到重复区的一个大的或重叠的抗原决定簇上也是可能的。
在体外检测法中，该鼠mAb阻止子孢子侵入人肝细胞和肝癌细胞。在鼠模型中类似的抗体提供抗体疟疾的被动保护性并已经发现这种抗体是十分有效的[参见，例如R.A.Wirtz et al.，Bull WHO，6539-45(1987)，引入本文作参考]，该抗体可从U.S.海军医学研究院得到。
实施例2 NFS2的克隆化和测序使用Favaloro et al.，的方法Meth.Enzymal.，65718-749(1980)从NFS2，和杂交瘤细胞系制备胞质RNA。分别在Ig重(VH)和轻(VL)链可变区cDNAs的合成中使用下列引物。该VL引物，＃2580和＃2789从HindⅡ延伸直穿过XbaⅠ，并使该引物到达鼠RNA的保守区。
HindIII#2580:5'CCAGATGTAAGCTTCAGCTGACCCAGTCTCCA3'PvuIIXbaI NaeI#2789:
5'CATCTAGATGGCGCCGCCACAGTACGTTTGATCTCCAGCTTGGTCCC3'VH引物，＃2621和＃2853从KpnⅠ延伸直到PstⅠ，并使该引物到达鼠RNA的保守区。
KpnI XhoI#2621:5'GGGGTACCAGGTCCA(A/G)CT(G/T)CTCGAGTC(A/T)GG3'PstI#2853:5'GCCTGCAGCTAGCTGAGGAGACGGTGACCGTGGTCCCTTGG-NheICCCCAG3'
按照Saiki et al.，Science，239487-491(1988)描述，在RNA模板上完成PCR。对于PCR，按照上文所述鉴别所使用的引物。对于VH的PCR扩增，DNA/引物混和物由5μlRNA和0.5μM的该引物组成。对于VL的PCR扩增，DNA/引物混合物由5μl RNA和0.5μM的该引物组成。向这些混合物中加入250μM的各种dATP，dCTP,dGTP和dTTP，10mM Tris-HCl pH8.3，50mM KCl，1.5mM MgCl2，0.01%(W/V)明胶，0.01%(V/V)吐温20，0.01%(V/V)Nonidet P40和5单位的Ampli Taq[Cetus]。将样本进行25个PCR热循环，每个循环在94℃，30秒;在55℃，30秒;72℃，45秒;并在72℃进行5分钟而结束。为了克隆和测序，在低熔点琼脂糖凝胶上以及采用Elutip-d柱层析[Schleicher和Schuell-Dussel，Germany]纯化扩增的VHDNA，并克隆到pUC18[New England Biolabs]。在Maniatis等人，同上文中描述了常用的克隆和连接方法学。
将VHDNA以KpnI-PstⅠ片段形式克隆到同样消化的pUC18中。将VLDNA以HindⅢ-XbaⅠ片段形式克隆到用同样酶消化的pUC18中。采用双脱氧法[Sanger et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，745463-5467(1977)]并用T7DNA聚合酶[US Biologicals]测定代表性克隆的序列。从NFS2VH和VL区的序列，根据Kabat等人，在“Sequerices of Proteins of Immunological Interest”，US Dept of Health and Human Services，US Government Printing office(1987)中所述的方法，使用计算机辅助的与其他VH和VL序列的排列对照解释CDR序列。NFS2的重和轻链的CDRs列于上文中并鉴别于图1中。
实施例3 人性化抗体下面的实施例描述了一种典型的工程抗体制剂。使用由常规方法制备的其他疟原虫抗体或其他抗病原体抗体，使用同样的方法用于制备工程抗体。
用于制备这些工程抗体的供体CDRs源是上述实施例1和2中描述的鼠mAb，NFS2。使用经过测序的NFS2可变骨架区再次检索Kabat数据库以识别人抗体的同源骨架区。测出从人SLE患者的B细胞骨髓瘤细胞系18/17中获得的抗体的骨架区[H.Dersimonian et al.，J.Immunol.，1392496-2501(1987)]与NFS2可变重链骨架区约有80%同源性。
在具备了鼠NFS2 CDRs(实施例2)以及人抗体18/17序列的情况下，制备合成的重链可变区，并进行PCR以填补和扩增DNA。采用下列的重叠寡聚核苷酸合成NFS2 CDR序列以及18/17VH骨架区TAGTGAAGAATTCGAGGACGCCAGCAACATGGTGTTGCAGACCCAGGTCTTCATTTCTCTGTTGCTCTGGATCTCTGGTGCCTACGGGGAGGTGCAG(Base 1-97);
GCTAGCGGATTCACCTTTAGCAGCCATGTCGGACCCCCCAGGGACTCTGAGAGGACACGTCGATCGCCTAAGTGGAAATCCTATGCCATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAAGGTCTAGAGTGGGTCTCAGAAATCTTTATAGTGATGGTGGTAGTTAC(Base158-259);
GAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGTCTCTGTTAAGGTTCTTGTGCGACATAGACGTTTACTGCAGTATATTACTGTGCGAAACTCATCTACTATGGTTACGACGGGTATGCTATGGACTAGCTGCCCATACGATACCTGATC(Base316-421);
TTCTTGAAAGCTTGGGCCCTTGGTACTAGCTGAGCTCACGGTGACCAGGGTACCCTGGCCCCAGTAGTCCATAGCATACCCGTCG(Base 484-400);
CATTTGCAGATACAGCGTGTTCTTGGAATTGTCTCTGGATATCGTGAACCGGCCCGTCACAGTGTCTGGATAGTAGGTGTAACTACCACCATCACTAATTTC(Base 337-236);
CTAAAGGTGAATCCGCTAGCTGCACAGGAGAGTCTCAGGGACCCCCCAGGCTGTACCAAGCCTCCCCCAGACTCGAGCAGCTGCACCTCCCCGTAGGCACC(Base 177-77).
将这些引物退火到一起并用Taq聚合酶填补DNA，随后用下列5′引物CCGCGAATTCGAGGACGCCAGCAAC和3′CCGCAAGCTTGGGCCCTTGGTACTAGCT..进行PCR扩增。
改正通过PCR插入到所检测的序列中的任何错误。另外，在骨架区中置入保守性的核苷酸替代物以引入适用于酶促切割的选定的限制性位点。由在图2，3，5和6中序列上的加框子部分表示骨架区内的这些变化。另外，大多数的鼠和人抗体在CDR3之前有碱性残基。因为NFS2的可变重链在CDR3前有一非碱性残基Ser，缺失受体的CDR3前的碱性残基(Lys)并用Ser替代以制备重链Pfhzhc2-3。
获得两条合成的重链可变区，命名为Pfhzhc2-3和Pfhzhc2-4。在图5和6中详细描述了这些序列。这些合成的重链可变区的每一种具有一种或多种核苷酸，或氨基酸不相同的特征。例如，Pfhzhc2-3在98位有一个Ser;而Pfhzhc2-4在98位上有一个Lys。另外，这些重链可变区是相同的。
对于合适的轻链可变骨架区，采用同样方法，使用在H.G.Klobeck et al.，Nucl.Acids Res.，136515-6529(1985)中识别的人抗体的NFS2轻链CDRs和轻链可变骨架序列以制备合适的合成轻链序列。使用的寡聚核苷酸如下所示TAAGCGGAATTCGTAGTCGGATATCGTGATGACCCAGTCTCCAGACTCGCTAGCTGTGTCTCTGGGCGAGAGGGC(Base 1-75);
TTACTTGGCCTGGTATCAGCAGAAACCCGGGCAGTCTCCTAAGTTGCTCATAGTTTTCTTAATGAACCGGACTTACTGGGCGTCAACTAG(Base 130-198);
GACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTGCAGGCTGAAGATGTGGCAGTATACTACTGCTGTCTAAAGTGTCAGCAATATTATAGCTATCC(Base 241-321);
CAGTTGGAAAGCTTGGCGCCGCCACAGTACGTTTGATCTCCACCTTGGTCCCTCCGCCGAACGTCCGCGGATAGCTATAATATTGC(Base 389-304);
GTGAAATCTGTCCCAGACCCGCTGCCACTGAATCGGTCAGGTACCCCAGATTCCCTAGTTGACGCC(Base 252-187);
CAGGCCAAGTAATTCTTTTGATTGCTCGAGTATAAAAGGCTCTGAGAGCTCTTGCAGTTGATGGTGGCCCTCTCGCCC(Base 141-64).
如上文描述，将引物退火到一起，并用Taq聚合酶填补该DNA，随后用下列引物5' GCGGAATTCGTAGTCGGATATCGTGATGAC 和3' TGGAAAGCTTGGCGCCGCCACAGTACGTTTGATC 引物进行PCR扩增。
按照上文中描述的用于合成重链的方法设计和合成两条含有NFS2CDRs的两个合成的轻链可变序列并称之为Pfhzlc1-1和Pfhzlc1-2。这两条序列仅在氨基酸序列的49位上有一个氨基酸不相同。Pfhzlc1-1在49位上有一个Ser;Pfhzlc1-2在相同位置上有一个Pro。
在一种例举的人性化抗体的构建过程中使用了这些合成的可变轻和/或重链序列。我们期望任何合成的重链能成功地与任何合成的轻链相结合以制备一种有用的人性化抗体。
为了制备人性化抗体，对于重链可变序列Pfhzhc2-3(见图6)，在该可变区上合成下列信号序列ATGGTGTTGCAGACCCAGGTCTTCATTTCTCTGTTGCTCTGGATCTCTGGTGCCTAC,该序列编码MetValLeuGlnThrGlnValPheIleSerLeuLeuLeuTrpIleSerGlyAlaTyr.
对于合成的轻链可变序列Pfhzlcl-1(图2)，用EcoR I和EcoR V消化该构建体，并将相同的信号序列连接到可变序列上。对本领域内技术人员而言其他信号序列也是熟知的，并可用于替代该典型序列。
通过PCR合成和证实选用作重和轻链的选定的人IgG1抗体的不变区。然后将这些不变区序列插入到基于pUC19的表达载体中。之后采用常规方法[Maniatis et al.，同上文]将含有轻和重链的信号及可变区的上述合成可变构建体插入到这些基于pUC19的含有CMV启动子和不变区的表达载体中，并在框架中与前面插入的人重和轻链不变区融合。因此，在将合成的可变区插入到这些表达载体中后，产生在图7和8中显示的质粒。然后将这些质粒共转染到选定的宿主中，并在培养后，采用下列实施例4中描述的ELISA法分析该培养基的抗体活性。
使用同样的技术，以及合成的重链序列Pfhzhc2-3(图6)和合成的轻链序列Pfhzlcl-2构建另一种代表性的人性化抗体。
实施例4 高度亲和性人性化抗体测定实施例1和2中描述的原始鼠抗体NSF2的骨架的可变区以及Pfhzhc2.3中氨基酸的变化，并且制备几种变化以提高原始抗体构型的保存水平。
在49位氨基酸位点上，将人性化重链Pfhzhc2.3的Ser改变为Ala，Ala是存在于该天然鼠NSF2的相应位置上的氨基酸。这一替代过程应用了常规的遗传工程技术，例如，制备含有适当的核苷酸变化的合成DNA片段以改变氨基酸。用XbaⅠ和EcoRⅤ消化Pfhzhc2.3的一个片段，并且将携带了编码Ala而不是Ser密码子的核苷酸变化的合成片段插入以发生氨基酸替代。将得到的合成重链称为Pfhzhc2.6。
按照前面描述的用于Pfhzhc2.3合成重链的方法表达合成此重链。该人性化重链序列的表达质粒基本上等同于图7中描绘的表达质粒，不同的是有如前所述的单个氨基酸有区别。
同样，借助于共转染哺乳动物细胞制备由Pfhzhc2.6重链和Pfhzlc.1轻链和Pfhzhc2.6重链和Pfhzlc1.2轻链组成的人性化抗体，并用下文实施例5中描述的ELISA检测抗体活性。
利用设计来用于获得最小可变区骨架修饰的同样方法可以制备其他高亲和性的特异于恶性疟原虫的抗体。该方法包括下列顺序的改变和测试步骤(1)除在49位氨基酸发生变化外，将存在于原始抗体和发生CDR替代的工程抗体中的已知在与CDRs相互作用中起关键性作用的其他单个骨架氨基酸残基进行比较。例如，将存在于原始(供体)和工程抗体中的重链氨基酸残基(Kabat编号;参见Kabat et al.，同上文)进行比较。据认为该位点上的一个残基借助于一个盐桥与94位上的不变重链CDR残基相互作用。
如果一个氨基酸在供体抗体的骨架中而不在工程抗体的骨架中，则制备含有该工程抗体的另一种重链基因。在相反情况下，如果在工程抗体骨架的一个位置上含有一个残基而在供体抗体中没有，则重新制备一种在那个位点上含有原始氨基酸的另一种重链基因。在进一步分析前，检测以此为基础制备的另一种质粒以制备高亲和性的工程抗体。
(2)将存在于原始抗体和发生CDR替代的工程抗体中的根据Kabat(参见Kabat等人，同上)定义的CDRs的四个残基内的骨架氨基酸进行比较。如果存在不同，则对于每一区域来说将那区域内的特定氨基酸替代工程抗体中的相应区域的氨基酸，以提供小量的工程基团。然后检测在此基础上产生的另外质粒以制备高度亲和性抗体。
(3)将原始和发生CDR替代的工程抗体内的骨架残基进行比较，并标示出在电荷，大小或疏水性方面有巨大不变的残基。以此为基础用原始抗体的相应氨基酸代表的单个标示的氨基酸制备替补质粒，测试该替补质粒以产生高亲和性抗体。
实施例5 ELISA检测法通过将质粒DNAs瞬时转染到猴COS细胞中而检测合成的重链和轻链序列的表达。下面报道的是Pfhzhc2-3和Pfhzlc1-1的结果。将10微克的质粒混合在一起，并用乙醇沉淀。将该DNAs溶于Tris缓冲盐水(TBS)中并与DEAE-葡聚糖(400μg/ml终浓度)/氯喹(0.1mm)混和，将混合物加到生长于T25烧瓶中的3-4×105COS细胞中，并在37℃培养4小时。用溶于磷酸缓冲盐水(PBS)中的10%DMSO使细胞休克1-2分钟并在用PBS洗涤后，将细胞在无血清生长培养基中培养。转染后72小时(3天的样本)收集培养基并且加入新鲜培养，在转染后120小时(称作5天样本)收集培养物。
为了比较各种抗体即嵌合和人性化抗体的结合亲和力，按如上所述完成大规模的COS转染。对于每一种抗体，使用200μg重链质粒和200μg轻链质粒DNAs以转染2.5×107总数的COS细胞。贮存收集的培养基(3天和5天)，用Fc捕获ELISA检测抗体表达。用Amicon将培养基浓缩至6ml。在贮存的培养基中抗体的量从9mg/ml至25mg/ml范围内变化。利用ISI和ILSDA检测法比较上述浓缩样本的结合亲和性。
采用常规的ELISA技术检测在含转染克隆的平板孔的培养基中存在的人性化抗体。以每孔0.1μg深度的山羊抗-人IgG(Fc特异性)抗体[Sigma，St.Louis，MO]包被微滴板，在4℃过夜。在用PBS(pH7.5)洗涤后，将来自含转染子的孔中的50μl培养基加到每个微滴孔中，室温下保持2小时。然后空出每个孔，用PBS洗涤并向每孔加入50μl的1/1000稀释的过氧化物酶结合的山羊抗-人IgG抗体(BioRad，Richmond，CA)。然后将平板在室温下培养1小时。然后空出每个孔，用PBS洗涤。向每孔中加入100μl的2.2′-连氮基-二(3-乙基-苯基噻唑啉磺酸盐(6)]。随后使反应在室温下继续1小时。然后采用分光光度计检测405nm处的吸收值。通过ELISA检测在含有转染克隆的孔的培养基中的人性化抗体结合物至恶性疟原虫环子孢子蛋白上的能力。以每孔0.1μg浓度用大肠杆菌产生的R32tet32包被微滴定板，在4℃过夜。用PBS洗涤之后，将来自含转染子的孔中的50μl培养基加到每个微滴定孔中，室温下保持2小时。然后空出每个孔，用PBS洗涤并向每孔加入50μg的1/1000稀释的过氧化物酶结合的山羊抗-人IgG抗体(BioRad，Richmond，CA]。然后将平板在室温下培养1小时。然后空出每个孔，用PBS洗涤。向每孔中加入100μl的2.2′-连氮基-二(3-乙基-苯基噻唑啉磺酸盐(6)]。随后使反应在室温下继续1小时。然后采用分光光度计检测405nm处的吸收值。
在预备研究中，与Pfhzhc2-3重链构建体比较，观察到含有Pfhzhc2-6重链构建体的实施例4中的人性化抗体的亲和性提高。
实施例6 嵌合抗体的构建基本上按上文中描述构建本发明的嵌合抗体。一种嵌合抗体含有选择来用作重链[H.Dersimonian et al.，J.Immunol.，1392496-2501(1987)和轻链[Klobeck et al.，Nucl.Acids.Res.，136515-6529(1985)]的天然鼠NSF2可变骨架以及人不变区上的CDR区域，例外的情况是将从NFS2杂交瘤获得的鼠抗体的RNA进行PCR而获得可变区并且通过重叠寡聚核苷酸合成人IgG1抗体的整个不变区并通过PCR进行扩增。校正由于PCR而插入的任何错误。按上述描述的用于人性化抗体的方法表达得到的嵌合重链和嵌合轻链。
由于该嵌合抗体具有基本上等同于天然鼠抗体的活性的特征，因而是有利的，但该抗体含有可用于治疗人体疾病的足够的人序列。
实施例7 ISI检测按照M.R.Hollingdale et al.，J.Immunol.132909-913(1984)描述的方法完成抑制子孢子入侵的检测法以用于估测抗活恶性疟原虫子孢子的中和作用。在ISI检测法中，在1%CO2玻璃盖玻片上用MEM和10%胎牛血清将人肝癌细胞克隆细胞系Hep G-2-Alb2培养至接近融合。用培养基稀释抗血清或纯化抗体(见下表)并加到细胞培养物中。将从解剖的蚊子唾液腺中分离到的30，000个恶性疟原子虫子孢子计数，稀释并加到每个细胞培养物中。在37℃将培养物培养2.5小时，用PES浸洗，并用甲醇固定。在免疫过氧化物酶抗体检测中用能识别恶性疟原虫CS蛋白质的一种标记的mAb与固定的培养物反应，以观察入侵的子孢子。然后，采用400×的相差显微镜计数入侵的子孢子数。ISI值是在检测抗体，人性化抗体存在下，与对照(即非相关)抗体相比较，入侵孢子数降低的百分数。该检测法将抗体按照其相对效力排列顺序。
下列表提供了用前面描述的嵌合和合成抗体进行检测时得到的结果。所给出的值是抑制百分数并且是2-3个独立检测的平均值。
ISI研究的总结In μg/ml: 20 10 5.0 2.0 1.0 0.1嵌合抗体 99 98.5 98 88 83 50PfHzhc2-3/lc1-1 92 75.5 60PfHzhc2-3/lc1-2 85 80.0 0PfHzhc2-6/lc1-1 90.0 75 53 0PfHzhc2-6/lc1-2 87.0 65 50 0在上面描述的说明书中包括了本发明的许多修改和变化形式，并且预期这些修改和变化对本领域内的任一技术人员都是显而易见的。例如，根据本发明的教导可以提供能中和除恶性疟原虫以外的病原体的重组抗体以用于制备能够提供针对其他人疾病的被动免疫性的预防剂。优选的是，能够识别其他疟病原体上重复区域的工程抗体或针对疟原虫种生活周期任何阶段的表面上存在的任何区域的工程抗体或能够中和该寄生虫生活周期任何阶段的工程抗体是令人满意的用于制备本发明被动免疫剂的起始材料。据信，对本发明的组合物和方法进行上述修改和变化都包含于本文所附权利要求的范围内。
序列目录(1)一般资料(ⅰ)申请人Smithkline Beecham，CorporationU.S.Government，Secretary of the NavyU.S.Government，Secretary of the Army(ⅱ)发明名称使人具有抗病原体感染的被动免疫力的新抗体(ⅲ)序列数61(ⅳ)联系地址(A)地址Howson and Howson(B)街道Box 457，321 Norristown Road(C)城市Spring House(D)州PA(E)国家USA(F)邮编19477(ⅴ)计算机可读形式(A)媒质类型Floppy盘(B)计算机IBM PC兼容(C)操作系统PC-DOS/MS-DOS(D)软件PatentIn Pelease ＃1.0，Version ＃1.25(ⅵ)现在的申请资料(A)申请号(B)申请日(C)分类号
(ⅶ)以前的申请资料(A)申请号US 07/941，654(B)申请日1992年9月9日(ⅷ)代理人/代理商资料(A)姓名Bak，Mary E.
(B)登记号31，215(C)资料/档案号SBC P50107-1(ⅸ)电讯资料(A)电话(215)540-9200(B)传真(215)540-5818(2)SEQ ID NO1的资料(ⅰ)序列特征(A)长度164个氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑结构未知(ⅱ)分子类型蛋白质(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO1
(2)SEQ ID NO2的资料(ⅰ)序列特征(A)长度163个氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑结构未知(ⅱ)分子类型蛋白质(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO2
(2)SEQ ID NO3的资料(ⅰ)序列特征(A)长度339个碱基对(B)类型核酸(C)股数双(D)拓扑结构未知(ⅱ)分子类型DNA(基因组)(ⅸ)特征(A)名称/关键词CDS(B)定位1..339(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO3
(2)SEQ ID NO4的资料(ⅰ)序列特征(A)长度113个氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型蛋白质(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO4
(2)SEQ ID NO5的资料(ⅰ)序列特征(A)长度339个碱基对(B)类型核酸(C)股数双(D)拓扑结构未知(ⅱ)分子类型DNA(基因组)(ⅸ)特征(A)名称/关键词CDS(B)定位1..339(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO5
按前面描述的(参见实施例Ⅴ和Ⅵ)方法将乙二醇(0.17g，2.7mmoles)与在二氯甲烷(10ml)中的硼酸(13)(1.06g，2.5mmoles)混合来制备化合物(14)。将该酯，化合物(14)(1.07g，2.4mmoles)溶于甲醇(60ml)中并放入加压容器中。向该容器中加入10%钯/碳(0.21g)，在50psi氢气下，在室温下，将该容器振动3小时。之后，经过滤除去催化剂，经减压下加热除去溶剂。剩余物用硅胶色谱纯化得到化合物(15)。向安装有气体入口和间隔膜的含二氯甲烷(50ml)的100ml圆底烧瓶中，按顺序加入溶解于二氯甲烷(5ml)中的化合物(15)(0.65g，2.0mmoles)，溶解于二氯甲烷(5ml)中的N-MOC-Phe(0.48g，2.2mmoles)和也溶解于二氯甲烷(5ml)中的三乙胺(0.52g，5.15mmoles)来制备化合物(16ml)。<p>(B)类型核酸(C)股数双(D)拓扑结构未知(ⅱ)分子类型DNA(基因组)(ⅸ)特征(A)名称/关键词CDS(B)定位1..339(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO7
(2)SEQ ID NO8的资料(ⅰ)序列特征
(A)长度113个氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型蛋白质(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO8
(2)SEQ ID NO9的资料(ⅰ)序列特征(A)长度354个碱基对(B)类型核酸(C)股数双(D)拓扑结构未知(ⅱ)分子类型DNA(基因组)(ⅸ)特征
(A)名称/关键词CDS(B)定位1..354(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO9
(2)SEQ ID NO10的资料(ⅰ)序列特征(A)长度118个氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型蛋白质(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO10
(2)SEQ ID NO11的资料(ⅰ)序列特征(A)长度389个碱基对(B)类型核酸(C)股数双(D)拓扑结构未知(ⅱ)分子类型DNA(基因组)(ⅸ)特征(A)名称/关键词CDS(B)定位1..366(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO11
(2)SEQ ID NO12的资料(ⅰ)序列特征(A)长度122个氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型蛋白质(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO12
(2)SEQ ID NO13的资料(ⅰ)序列特征(A)长度389个碱基对(B)类型核酸(C)股数双股(D)拓扑结构未知(ⅱ)分子类型DNA(基因组)(ⅸ)特征(A)名称/关键词CDS(B)定位1..366(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO13
(2)SEQ ID NO14的资料(ⅰ)序列特征(A)长度122个氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型蛋白质(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO14
(2)SEQ ID NO15的资料(ⅰ)序列特征(A)长度15个碱基对(B)类型核酸(C)股数双(D)拓扑结构未知(ⅱ)分子类型DNA(基因组)(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO15AGCTATGCCA TGAGC 15(2)SEQ ID NO16的资料(ⅰ)序列特征(A)长度5个氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑结构未知(ⅱ)分子类型蛋白质(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO16Ser Tyr Ala Met Ser1 5(2)SEQ ID NO17的资料(ⅰ)序列特征
(A)长度51个碱基对(B)类型核酸(C)股数双(D)拓扑结构未知(ⅱ)分子类型DNA(基因组)(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO17
(2)SEQ ID NO18的资料(ⅰ)序列特征(A)长度17个氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑结构未知(ⅱ)分子类型蛋白质(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO18
(2)SEQ ID NO19的资料(ⅰ)序列特征(A)长度39个碱基对(B)类型核酸(C)股数双(D)拓扑结构未知
(ⅱ)分子类型DNA(基因组)(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO19CTCATCTACT ATGGTTACGA CGGGTATGCT ATGGACTAC 39(2)SEQ ID NO20的资料(ⅰ)序列特征(A)长度13个氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑结构未知(ⅱ)分子类型蛋白质(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO20Leu Ile Tyr Tyr Gly Tyr Asp Gly Tyr Ala Met Asp Tyr1 510(2)SEQ ID NO21的资料(ⅰ)序列特征(A)长度51个碱基对(B)类型核酸(C)股数双(D)拓扑结构未知(ⅱ)分子类型DNA(基因组)(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO21AAGAGCTCTC AGAGCCTTTT ATACTCGAGC AATCAAAAGA ATTACTTGGC C 51
(2)SEQ ID NO22的资料(ⅰ)序列特征(A)长度17个氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑结构未知(ⅱ)分子类型蛋白质(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO22
(2)SEQ ID NO23的资料(ⅰ)序列特征(A)长度21个碱基对(B)类型核酸(C)股数双(D)拓扑结构未知(ⅱ)分子类型DNA(基因组)(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO23TGGGCGTCAA CTAGGGAATC T 21(2)SEQ ID NO24的资料(ⅰ)序列特征(A)长度7个氨基酸(B)类型氨基酸
(D)拓扑结构未知(ⅱ)分子类型蛋白质(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO24Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser1 5(2)SEQ ID NO25的资料(ⅰ)序列特征(A)长度27个碱基对(B)类型核酸(C)股数双(D)拓扑结构未知(ⅱ)分子类型DNA(基因组)(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO25CAGCAATATT ATAGCTATCC GCGGACG 27(2)SEQ ID NO26的资料(ⅰ)序列特征(A)长度9个氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑结构未知(ⅱ)分子类型蛋白质(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO26
Gln Gln Tyr Tyr Ser Tyr Pro Arg Thr1 5(2)SEQ ID NO27的资料(ⅰ)序列特征(A)长度6个氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑结构未知(ⅱ)分子类型蛋白质(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO27Pro Asn Ala Asn Pro Asn1 5(2)SEQ ID NO28的资料(ⅰ)序列特征(A)长度32个碱基对(B)类型核酸(C)股数单股(D)拓扑结构未知(ⅱ)分子类型DNA(基因组)(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO28CCAGATGTAA GCTTCAGCTG ACCCAGTCTC CA 32
(2)SEQ ID NO29的资料(ⅰ)序列特征(A)长度47个碱基对(B)类型核酸(C)股数单(D)拓扑结构未知(ⅱ)分子类型DNA(基因组)(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO29CATCTAGATG GCGCCGCCAC AGTACGTTTG ATCTCCAGCT TGGTCCC 47(2)SEQ ID NO30的资料(ⅰ)序列特征(A)长度30个碱基对(B)类型核酸(C)股数单(D)拓扑结构未知(ⅱ)分子类型DNA(基因组)(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO30GGGGTACCAG GTCCARCTKC TCGAGTCWGG 30(2)SEQ ID NO31的资料(ⅰ)序列特征(A)长度47个碱基对(B)类型核酸
(C)股数单(D)拓扑结构未知(ⅱ)分子类型DNA(基因组)(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO31GCCTGCAGCT AGCTGAGGAG ACGGTGACCG TGGTCCCTTG GCCCCAG 47(2)SEQ ID NO32的资料(ⅰ)序列特征(A)长度15个碱基对(B)类型核酸(C)股数双(D)拓扑结构未知(ⅱ)分子类型DNA(基因组)(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO32AGCTATGCCA TGTCT 15(2)SEQ ID NO33的资料(ⅰ)序列特征(A)长度5个氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑结构未知(ⅱ)分子类型蛋白质(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO33
Ser Tyr Ala Met Ser1 5(2)SEQ ID NO34的资料(ⅰ)序列特征(A)长度51个碱基对(B)类型核酸(C)股数双(D)拓扑结构未知(ⅱ)分子类型DNA(基因组)(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO34AAGTCCAGTC AGAGCCTTTT ATATAGTAGC AATCAAAAGA ATTACTTGGC C(2)SEQ ID NO35的资料(ⅰ)序列特征(A)长度17个氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑结构未知(ⅱ)分子类型蛋白质(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO35
(2)SEQ ID NO36的资料(ⅰ)序列特征(A)长度21个碱基对(B)类型核酸(C)股数双(D)拓扑结构未知(ⅱ)分子类型DNA(基因组)(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO36TGGGCATCCA CTAGGGAATC T 21(2)SEQ ID NO37的资料(ⅰ)序列特征(A)长度7个氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑结构未知(ⅱ)分子类型蛋白质(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO37Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser1 5(2)SEQ ID NO38的资料(ⅰ)序列特征(A)长度27个碱基对(B)类型核酸
(C)股数双(D)拓扑结构未知(ⅱ)分子类型DNA(基因组)(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO38CAGCAATATT ATAGCTATCC TCGGACG 27(2)SEQ ID NO39的资料(ⅰ)序列特征(A)长度9个氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑结构未知(ⅱ)分子类型蛋白质(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO39Gln Gln Tyr Tyr Ser Tyr Pro Arg Thr1 5(2)SEQ ID NO40的资料(ⅰ)序列特征(A)长度21个碱基对(B)类型核酸(C)股数双(D)拓扑结构未知(ⅱ)分子类型DNA(基因组)(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO40
TGGGCGTCGA CTAGGGAATC T 21(2)SEQ ID NO41的资料(ⅰ)序列特征(A)长度7个氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑结构未知(ⅱ)分子类型蛋白质(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO41Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser1 5(2)SEQ ID NO42的资料(ⅰ)序列特征(A)长度366个碱基对(B)类型核酸(C)股数双(D)拓扑结构未知(ⅱ)分子类型DNA(基因组)(ⅹⅰ)特征(A)名称/关键词CDS(B)定位1..366(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO42
(2)SEQ ID NO43的资料(ⅰ)序列特征(A)长度122个氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型蛋白质(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO43
(2)SEQ ID NO44的资料(ⅰ)序列特征(A)长度97个碱基对(B)类型核酸(C)股数单(D)拓扑结构未知(ⅱ)分子类型DNA(基因组)(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO44
(2)SEQ ID NO45的资料(ⅰ)序列特征(A)长度164个碱基对(B)类型核酸(C)股数单(D)拓扑结构未知
(ⅱ)分子类型DNA(基因组)(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO45
(2)SEQ ID NO46的资料(ⅰ)序列特征(A)长度164个碱基对(B)类型核酸(C)股数单(D)拓扑结构未知(ⅱ)分子类型DNA(基因组)(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO46
(2)SEQ ID NO47的资料(ⅰ)序列特征(A)长度85个碱基对(B)类型核酸(C)股数单(D)拓扑结构未知(ⅱ)分子类型DNA(基因组)(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO47
(2)SEQ ID NO48的资料(ⅰ)序列特征(A)长度102个碱基对(B)类型核酸(C)股数单(D)拓扑结构未知(ⅱ)分子类型DNA(基因组)(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO48
(2)SEQ ID NO49的资料(ⅰ)序列特征(A)长度101个碱基对(B)类型核酸(C)股数单(D)拓扑结构未知(ⅱ)分子类型DNA(基因组)(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO49
(2)SEQ ID NO50的资料(ⅰ)序列特征(A)长度25个碱基对(B)类型核酸(C)股数单(D)拓扑结构未知(ⅱ)分子类型DNA(基因组)(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO50CCGCGAATTC GAGGACGCCA GCAAC 25(2)SEQ ID NO51的资料(ⅰ)序列特征(A)长度28个碱基对(B)类型核酸(C)股数单(D)拓扑结构未知(ⅱ)分子类型DNA(基因组)(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO51CCGCAAGCTT GGGCCCTTGG TACTAGCT 28(2)SEQ ID NO52的资料(ⅰ)序列特征(A)长度75个碱基对(B)类型核酸
(C)股数单(D)拓扑结构未知(ⅱ)分子类型DNA(基因组)(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO52
(2)SEQ ID NO53的资料(ⅰ)序列特征(A)长度90个碱基对(B)类型核酸(C)股数单(D)拓扑结构未知(ⅱ)分子类型DNA(基因组)(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO53
(2)SEQ ID NO54的资料(ⅰ)序列特征(A)长度93个碱基对(B)类型核酸(C)股数单(D)拓扑结构未知
(ⅱ)分子类型DNA(基因组)(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO54
(2)SEQ ID NO55的资料(ⅰ)序列特征(A)长度86个碱基对(B)类型核酸(C)股数单股(D)拓扑结构未知(ⅱ)分子类型DNA(基因组)(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO55
(2)SEQ ID NO56的资料(ⅰ)序列特征(A)长度66个碱基对(B)类型核酸(C)股数单(D)拓扑结构未知(ⅱ)分子类型DNA(基因组)(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO56
(2)SEQ ID NO57的资料(ⅰ)序列特征(A)长度78个碱基对(B)类型核酸(C)股数单(D)拓扑结构未知(ⅱ)分子类型DNA(基因组)(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO57
(2)SEQ ID NO58的资料(ⅰ)序列特征(A)长度30个碱基对(B)类型核酸(C)股数单股(D)拓扑结构未知(ⅱ)分子类型DNA(基因组)(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO58GCGGAATTCG TAGTCGGATA TCGTGATGAC 30
(2)SEQ ID NO59的资料(ⅰ)序列特征(A)长度34个碱基对(B)类型核酸(C)股数单(D)拓扑结构未知(ⅱ)分子类型DNA(基因组)(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO59TGGAAAGCTT GGCGCCGCCA CAGTACGTTT GATC 34(2)SEQ ID NO60的资料(ⅰ)序列特征(A)长度57个碱基对(B)类型核酸(C)股数双(D)拓扑结构未知(ⅱ)分子类型DNA(基因组)(ⅸ)特征(A)名称/关键词CDS(B)定位1..57(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO60
(2)SEQ ID NO61的资料(ⅰ)序列特征(A)长度19个氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型蛋白质(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO6
权利要求
1.一种融合分子，该分子包括编码具有抗疟原虫抗体的抗原特异性的一个氨基酸序列的第一融合配对体核苷酸序列，并且已经过操作使该序列在框架中与第二融合配对体核苷酸序列相连接。
2.根据权利要求1所述的分子，其中所述的第一融合配对体是一种合成的免疫球蛋白可变区核苷酸序列，该序列编码包含源于疟原虫抗体的一个互补决定区，其片段或等位变化或修饰的一个氨基酸序列。
3.根据权利要求2所述的分子，其中所述的第二融合配对体是异源的免疫球蛋白可变骨架区。
4.根据权利要求2所述的分子，其中所述的可变区核苷酸序列选自于由重链可变区和轻链可变区组成的组中。
5.根据权利要求4所述的分子，它们选自于下列物质组成的组中(a)图5的一条重链核苷酸序列;(b)图6中的一条重链核苷酸序列;(c)图2或图3中的一条轻链核苷酸序列;(d)图3中的一条轻链核苷酸序列;(e)及其它们的功能片段。
6.根据权利要求4的分子，其中所说的第一融合配对体核苷酸序列包含选自于下列物质组成的组(a) AGCTATGCCATGAGC;(b) GAAATTAGTGATGGTGGTAGTTACACCTACTATCCAGACACTGTGACGGGC;(c) CTCATCTACTATGGTTACGACGGGTATGCTATGGACTAC;(d) AAGAGCTCTCAGAGCCTTTTATACTCGAGCAATCAAAAGAATTACTTGGCC;(e) TGGGCGTCAACTAGGGAATCT;(f) CAGCAATATTATAGCTATCCGCGGACG;(g) AGCTATGCCATGTCT;(h) AAGTCCAGTCAGAGCCTTTTATATAGTAGCAATCAAAAGAATTACTTGGCC;(i) TGGGCATCCACTAGGGAATCT;(j) CAGCAATATTATAGCTATCCTCGGACG;(k) TGGGCGTCGACTAGGGAATCT;and an allelic以及其等位变化或修饰，并具有鼠NFS2的抗原特异性特征，所述的核酸序列可以含有或不含有限制性位点以促使其插入到所需的抗体骨架区或质粒载体上。
7.一种合成的免疫球蛋白可变区核苷酸序列，该序列编码包含源于疟原虫抗体的互补决定区，它的片段或等位变化或修饰的一个氨基酸序列。
8.一种融合蛋白，它含有源于能结合位于选择的疟原虫种类上的抗原决定簇的疟原虫抗体的第一氨基酸序列，所述序列具有针对所述抗体的抗原特异性并且融合到异源的第二氨基酸序列上。
9.根据权利要求8所述的融合蛋白，其中所述的第一氨基酸序列包含选自于由下列物质组成的氨基酸序列(a)所述抗体的一种可变重链序列;(b)所述抗体的一种可变轻链序列;(c)所述抗体的互补测定区;以及(d)从(a)至(c)的各序列的功能片段。
10.根据权利要求8的融合蛋白，其中所述的融合蛋白选自于由下列物质组成的组中(a)一种完全的工程抗体，它具有至少含源于所说疟原虫抗体的可变区片段的全长重和轻链;(b)(a)中工程抗体的Fab或(Fab′)2片段;(c)衍生于(a)中的工程抗体的重链形成的一种二聚体;(d)(a)中的工程抗体的Fv片段;并且(e)来源于(a)中的工程抗体的一个单链抗体;所述的蛋白质具有相同于疟原虫抗体的特异性。
11.一种恶性疟原虫工程抗体，该抗体包含含有互补决定区的一条重链，该互补决定区来源于一种非人恶性疟原虫单克隆抗体的可变重链区。
12.根据权利要求11的抗体，其中所述的非人CDRs是与下列物质组成的组中的一种物质进行可操作的连接(a)一种选定的人抗体重链骨架和不变区;以及(b)来自于所述抗体的重链骨架以及来自于一种选定的人抗体的一个不变区。
13.根据权利要求11的抗体，进一步包括选自于下列物质组成的组中的一个轻链(a)含有来源于所述单克隆抗体的可变轻链区的CDR的一条轻链，所述的可变轻链区与选定的人抗体轻链骨架和不变区进行可操作的结合;(b)来源于所述抗体的轻链骨架以及来源于选定的人抗体的不变区;(c)从所述抗疟原虫抗体得到的全部轻链;以及(d)来自于选定的人抗体的全部轻链。
14.根据权利要求11的抗体，其中所述的重链含有选自于图5，图6中的Pfhzhc2-3以及Pfhzhc2-6的序列的可变重链序列。
15.根据权利要求13的抗体，其中所述的轻链包含选自于图2和图3中的序列的一个可变轻链序列。
16.根据权利要求13的抗体，其中的轻链互补决定区选自于由下列物质组成的一种或多种序列(a) LysSerSerGlnSerLeuLeuTyrSerSerAsnGlnLysAsnTyrLeuAla;(b) TrpAlaSerThrArgGluSer;and(c) GlnGlnTyrTyrSerTyrProArgThr.
17.根据权利要求11的抗体，其中所述的重链互补决定区选自于由下列物质组成的一个或多个序列(a) SerTyrAlaMetSer;(b) GluIleSerAspGlyGlySerTyrThrTyrTyrProAspThrValThrGly;and(c) LeuIleTyrTyrGlyTyrAspGlyTyrAlaMetAspTyr.
18.一种选自于下列组的抗恶性疟原虫互补决定区肽及其一种类似物，它具有NFS2的抗原特异性的特征，(a) SerTyrAlaMetSer;(b) GluIleSerAspGlyGlySerTyrThrTyrTyrProAspThrValThrGly;(c) LeuIleTyrTyrGlyTyrAspGlyTyrAlaMetAspTyr;(d) LysSerSerGlnSerLeuLeuTyrSerSerAsnGlnLysAsnTyrLeuAla;(e) TrpAlaSerThrArgGluSer;(f) GlnGlnTyrTyrSerTyrProArgThr;
19.一种合成的免疫球蛋白可变链氨基酸序列，该序列在异源可变链骨架中含有来源于疟原虫抗体的互补决定区或具有所说序列的抗疟原虫抗原特异性的一个片段或其类似物。
20.根据权利要求19的序列，它选自于由图5，图6，图2和图3的氨基酸序列组成的组中。
21.一种除NFS2以外的单克隆抗体，它具有结合到含有序列Pro Asn Ala Asn Pro Asn的恶性疟原虫抗原决定簇上的能力，或是该抗体的一个Fab片段或(Fab′)2片段。
22.一种药物预防组合物，含有权利要求8至21的任何一种融合蛋白或抗体以及药物学上可接受的载体或稀释剂。
23.根据权利要求22所述的药物组合物，其中所述的蛋白质是一种人性化恶性疟原虫抗体。
24.一种重组质粒，包括与一个调节控制序列进行可操作结合的权利要求1至7任何一项的核酸序列，该调节控制序列能指导所说核酸序列在宿主细胞中复制和表达。
25.一种用至少一种重组质粒转染的哺乳动物细胞系，该质粒含有权利要求1至7的任一项中的核酸序列。
26.制备工程抗体的方法，包括在适合于使互补重和轻链表达和装配的条件下，将哺乳动物细胞系用至少一种含有权利要求1至7任一项的核酸序列的重组质粒转染，并从细胞培养物中回收装配的抗体。
27.将权利要求8至21的蛋白质或抗体用于制备药物组合物，该组合物适合于被动性地保护人体抵抗疟原虫种的感染。
全文摘要
本文提供了衍生于鼠恶性疟原虫的单克隆抗体的蛋白质和肽，包括用于治疗方法和组合物中的合成的人性化可变轻链和可变重链序列，CDR肽，以及人性化抗体，所述组合物能对引起疟疾的寄生虫感染提供被动性免疫力。
文档编号C07H21/04GK1087681SQ93119080
公开日1994年6月8日 申请日期1993年9月9日 优先权日1992年9月9日
发明者M·S·格罗斯, M·赫勒, S·霍夫曼, Y·夏朗维特, M·罗森堡, J·C·沙多夫, D·R·施维斯特 申请人:史密丝克莱恩比彻姆公司, 美国政府海军部, 美国政府陆军部