可控的基因组修饰疟原虫、重组表达载体及构建方法、应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及基因工程领域，尤其是涉及一种可控的基因组修饰追原虫、重组表达 载体及构建方法、应用。
【背景技术】
[0002] 由追原虫感染引起的追疾是全球Η大主要传染性疾病之一。每年有数亿人感染追 疾，逾百万人因追疾死亡，其中多数是5岁W下的儿童。追疾难W有效控制和根除的主要原 因之一在于对其病原体一追原虫的生物学复杂性了解有限。追原虫具有复杂的生活史，其 生长发育需要在雌性按蚊和人（或其他脊椎动物）等宿主体内完成；追原虫在按蚊体内进 行有性繁殖，而在人或其他脊椎动物宿主体内则进行无性繁殖。追原虫在宿主体内的发育 过程分为肝期（红外期）和红细胞内期（红内期）。肝期追疾一般不表现出临床症状，而追 疾感染的主要病理反应是由红内期引发的。由肝细胞释放出的红外期裂殖子进入血流侵入 红细胞内进行红内期增殖，虫体增殖和释放导致红细胞破裂，从破裂红细胞释出的裂殖子 侵入健康的红细胞，周而复始，导致大量红细胞被破坏，病人表现出严重的临床症状。目前 追原虫基因组测序工作已基本完成，因而大量已测序基因的功能有待阐明。人们对参与追 原虫生活史各阶段分化、发育和增殖过程中的重要基因及其调控还了解甚少。探明追原虫 各种基因及其基因产物的具体功能对于开发有效追疾疫苗和发现抗追新药物祀位具有重 要的意义。
[0003] 因此，拓展分析追原虫基因功能的方法已成为追疾研究的热点。通过生物芯片 技术与抑制性消减杂交技术（Suppressivesubhactivehybridization,SSH)等技术 结合生物信息学分析，可W筛选得到许多与追原虫生长，繁殖及其对宿主作用相关的基因 并预测其可能功能，但对于疫苗与新药的开发尤为重要的是确证追原虫重要基因的具体 功能。早期科学家用酶抑制分子研究酶蛋白的功能，但由于酶抑制物的低特异性W及应 用范围的局限性限制了送种方法的发展。随着追原虫基因转染技术的发展，实验者可W 通过转基因技术进行祀基因失活直接研究该基因功能。RNA干扰（RNAinterference, RNAi)与基因敲除（geneknockout)技术是目前在哺乳动物应用较多的基因失活方法， 然而，追原虫基因组中缺少RNAi所需的重要元件，因而RNAi在追原虫中的应用仍存在困 难。基因敲除是研究基因功能的经典遗传学方法，但由于红内期追原虫为单倍体，对红内 期追原虫具有重要功能的基因被敲除后将会导致虫体死亡而无法研究其功能，因此，建立 追原虫基因条件性敲除技术将会极大地方便研究其基因功能。将基因诱导表达系统与 基因敲除结合起来是建立基因条件性敲除技术最有效的方法之一。另有研究通过化e/ loxP或Flp/FRT系统与基因敲除结合实现基因条件敲除，但送种基因条件敲除技术局限 于必须使用特异性或组织特异性启动子，并且送种条件性敲除在该特定期或特定组织内发 生后是不可逆转的，因此，对于大部分生长期为单倍体的追原虫，仍然存在重要基因缺失 后虫体死亡或严重受损而不能进行转基因虫筛选与克隆的难题，而对追原虫各个生长期 都起重要作用的基因更难W用送种方法进行研究。动物细胞中用到的基因诱导表达方式 常利用一些特殊的启动子，送些启动子在某些理化条件下可诱导启动，如热休克蛋白启动 子可在高温下被诱导、糖皮质激素和重金属反应启动子等，送些基因表达诱导方式存在W 下缺陷：诱导表达特异性差，系统处于关闭状态时表达有泄漏，诱导剂本身有毒性对细胞 造成损伤等。1992年，Gossen等利用大肠杆菌化10转座子的四环素抗性操纵子为基础 构建了可用于研究哺乳类动物基因功能的四环素调控的tet-off基因诱导表达系统。该 系统包括调节单元和应答单元二部分。调节部分表达的转录激活因子（tTA)在四环素存 在的情况下不激活目的基因表达；而在四环素去除后，tTA可激活应答单元中目的基因表 达。而后Gossen等对tet-off系统进行了改造，构建了受四环素调控的Tet-on基因诱 导表达系统，该系统在没有诱导剂的条件下启动子不被激活，而在加入诱导剂后目的基因 高效表达。tet-on系统具有严密、高效、可控制性强和诱导速度快等优点，已广泛用于基 因功能研究。但已广泛用于真核生物的tet-on系统不适用于追原虫，因为系统包含的调 节单元和应答单元中的关键元件单纯疮疹病毒HSV蛋白化e巧essimplexvirusvirion proteinlG,VP16)和四环素应答兀件（tetra巧cline-responsiveelement,TRE)在追 原虫中不工作。许多与追原虫种属接近的原虫类生物已成功应用四环素诱导表达系统 调控基因表达：如布氏锥虫（WirtzE.等，Science, 1995,268:1179-1183)、阿米己原虫 (HamannL.等，Mol.Biochem.Parasitol. 1997,84:83-91.)、利氏曼原虫（YanS.等，Woods HoleMol.Parasitol.Meet, ,10th, 1999.)、藍氏贾第鞭毛虫（SunCH.等，Mol.Biochem. Parasitol. 2000, 105:51-60.)、弓形虫（MeissnerM.等，Science, 2002, 298:837-840.) 等。然而，追原虫的基因组富含AT碱基干扰对其基因启动子序列的分析，也给包含追原虫 基因的质粒载体在大肠杆菌的扩增带来麻烦；并且，追原虫主要寄生于脊椎动物和人的红 细胞内，外源性的DNA通过转染整合到追原虫基因组上需要经过红细胞膜、纳虫泡、虫细胞 膜与核膜四层膜，转染效率极低，送些都给追原虫的基因修饰研究造成困难。近几年，随着 追原虫核转染技术的提高，追原虫的基因修饰研究开始充满活力。2005年，Meissner等构 建的tet-off系统在人恶性追原虫内调控了绿色英光蛋白（GFP)基因表达（Proc.化tl. Acad.Sci.USA. 2005, 102(8) :2980-2985)，不过，转染质粒并未整合到追原虫基因组而W游 离体（episome)形式存在，而游离体容易丢失导致转染结果不稳定，受调控的基因诱导表 达率很低（约20%)且持续时间短暂，追原虫内源性基因保持完整无敲除。2012年底， PacoPino等建立tet-off系统条件性敲除PRF与NMT基因（CellHost&Microbe2012,12: 824 - 834.)。Tet-off在启动基因表达时受机体代谢诱导剂速度的影响，不及tet-on系统 启动基因表达快速、高效，而在关闭基因表达时tet-off系统需要持续给诱导剂，给基因功 能研究过程带来不方便、对追原虫及其宿主存在潜在的副作用W及实验结果可能受干扰等 不利因素。并且，研制开发可控的基因组修饰追原虫全虫疫苗，只能选择tet-on系统不可 用tet-off系统，因为机体给予疫苗后不能同时给予四环素来致弱追原虫。追原虫基因的 AT含量非常高；另外还具有许多与其它真核生物不一样的基因特征，比如在多数真核细胞 内可W工作的CMV启动子与SV40启动子在追原虫细胞内不起作用，追原虫基因的启动子也 常常缺少真正的TATA盒，追原虫基因启动子常有多个转录起始位点，送些都为追原虫基因 组的研究工作的开展增加了困难。
[0004] 此外，有效的抗追疾疫苗是人类控制追疾的重要手段。过去50年中，各国研究者 曾尝试多种方案研发追疾疫苗，但至今仍未获得可用于临床的有效疫苗。早期研究表明，用 放射线照射减毒的子抱子免疫实验动物或人，能够诱导出清除性的免疫保护力。但是送种 放射线减毒子抱子难W大量制备和生产，因而其全虫无法作为疫苗在人类大规模接种，并 且放射线减毒的方法难W控制其质量。上个世纪80年代，分子克隆技术的建立使人们将追 疾疫苗的研发寄希望于亚单位疫苗。过去40年中已发现和鉴定了数十种追疾疫苗候选抗 原，送些抗原与各种疫苗载体或佐剂配合设计了多种不同的亚单位疫苗方案。大量的测试 表明，追疾亚单位疫苗普遍保护效力低。由于追原虫具有复杂的生活史，而且其抗原具有多 形性和变异性，目前追疾疫苗研究领域的许多学者认为，基于一种或几种抗原的亚单位追 疾疫苗可能很难诱导具有临床意义的免疫力。为此，近年来研究的注意力集中到全虫疫苗。 超低剂量红内期追原虫多次接种感染机体可诱导很强的免疫保护力。但送种疫苗的明显缺 点是可能会引发感染，特别是在免疫功能低下或受损的个体。随着分子生物学技术的进步、 追原虫基因组序列测定W及追原虫转染与基因敲除技术的建立，通过敲除追原虫某些与分 化发育相关的重要基因而使追原虫遗传灭活制备全虫疫苗成为可能，近来有基因敲除的子 抱子感染动物后可W诱导清除性免疫保护力的报道。然而，对生长发育至关重要的基因被 敲除的追原虫由于为缺陷虫株不能正常生长发育带来难W大量生产的问题，并且与放射线 减毒的子抱子疫苗类似，存在子抱子难W大量生产、纯化和储存等方面的问题，并且一旦有 少量子抱子逃过针对肝期的免疫力侵入血液红细胞就将进入追原虫致病的重要阶段从而 导致疫苗保护失败。
【发明内容】
[0005] 基于此，针对上述技术问题，有必要提供一种可控的基因组修饰追原虫、重组表达 载体及构建方法、应用，W用于追原虫基因功能和疫苗的研究。
[0006] -种重组表达载体，其特征在于，包括长同源臂和短同源臂W及位于所述长同源 臂与所述短同源臂之间的四环素阻遏蛋白基因表达框、己胺嚼巧抗性基因表达框W及目的 基因表达框；其中，所述目的基因表达框中含有目的基因启动子W及目的基因；所述目的 基因启动子在多个转录起始位点处插入有四环素操纵基因序列；所述目的基因选自追原虫 基因组中功能基因编码序列中的一种；所述长同源臂与短同源臂的序列为追原虫基因组中 与所述功能基因对应的DNA序列。
[0007] -种重组表达载体的构建方法，包括如下步骤：
[0008] 扩增四环素阻遏蛋白的表达序列，并插入到含有己胺嚼巧抗性基因表达框的质粒 载体中，得到含有四环素阻遏蛋白基因表达框及己胺嚼巧抗性基因表达框的质粒A;
[0009] 在所述质粒A的四环素阻遏蛋白基因表达框的3'端插入目的基因的长同源臂，得 到质粒B;
[0010] 合成在转录起始位点处插入有四环素操纵基因序列的修饰后的启动子，并将该修 饰后的启动子插入到已消除多克隆酶切位点的质粒载体上，得到质粒C，其中，所述修饰后 的启动子是在eflαa启动子片段的-205位点、-184位点W及-163位点中的至少一个位点 处插入有所述四环素操纵基因序列，所述eflαa启动子片段的序列如SEQIDNo.9所示；