一种基因敲除疟原虫的建立方法
【专利摘要】本发明涉及基因敲除技术，尤指一种基因敲除疟原虫的建立方法，具体包括以下步骤：(a)构建线性化的基因敲除质粒；(b)疟原虫成熟裂殖体的培养；(c)基因敲除质粒(线性化)转染；(d)基因敲除疟原虫的鉴定。本发明采用基于PCR方法的三步法扩增获得线性化的基因敲除质粒，比传统的酶切连接方法更快速，尤其是对质粒中多片段的插入更有优势。本发明的转染技术，高效、省时，转染效率可达到10-2-10-3。
【专利说明】一种基因敲除疟原虫的建立方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及基因敲除技术，尤指一种基因敲除疟原虫的建立方法。
【背景技术】
[0002]据估计，全球每年约有3亿人感染疟原虫，100万以上的患者死于疟疾。由于受媒介按蚊对杀虫剂的抗性、疟原虫对抗疟药耐药性以及人口流动等社会因素的影响，全球性疟疾控制计划实施40年后的今天又面临着新的挑战。减毒的疟原虫作为一种有效的疟疾预防性疫苗日益受到重视而传统的放射方法制备的减毒虫株因存在放射剂量不好控制，疟原虫子孢子需求量大，方法不稳定等缺点而受到限制。
【发明内容】
[0003]为解决上述技术问题，本发明提供一种基因敲除疟原虫的建立方法。
[0004]本发明是一种基因敲除疟原虫的建立方法，包括以下步骤:
[0005](a)构建线性化的基因敲除质粒；
[0006](b)疟原虫成熟裂殖体的培养；
[0007](c)基因敲除质粒(线性化)转染；
[0008](d)基因敲除痕原虫的鉴定。
[0009]所述步骤(a)采用基于PCR方法的三步法扩增获得线性化的基因敲除质粒:
[0010]第一步:根据目的基因的序列，设计两对引物，分别为Pi/Pii或者Piii/Piv，分别从疟原虫的DNA中同源扩增出目的基因的5’和3’端大约500bp左右片段；其中引物Pi和Piv在设计时在5’端分别加入EcoR V和Not I酶切位点，引物Pii和Piii在设计时在5’端引入与筛选标记序列互补的23bp核苷酸；
[0011]第二步:将第一步的产物和含有选择标记dihydrofolatereductase-thymidylatesynthase, hdhfr或者二氢叶酸还原酶的线性化质粒混匀后,加入引物Pi和hDHFR反向引物进行PCR扩增，获得线性化的同源重组质粒前半段，加入hDHFR正向引物和Piv进行PCR扩增，获得线性化的同源重组质粒的后半段，其中hDHFR的正向和反向引物之间设计20个同源序列；
[0012]第三步:以第二步扩增得到的两种产物为模板，加入引物Pi和Piv进行PCR扩增，得到完整的线性化的基因敲除质粒。
[0013]PCR体系:主要成分包括线性化的包含hDHFR的质粒DNA，50ng PCR I产物和高保真DNA聚合酶混合物；PCR扩增条件:95°C 2min，35个循环，68°C延伸，延伸时间依据需要拼接的两片段长度之和计算，lkb/min ;模板浓度为50ng，引物浓度应按IOpmol进行稀释一般稀释1/4获得较特异的扩增产物。
[0014]所述步骤(b)包括如下步骤:
[0015]第一步、常规腹腔注射感染鼠疟原虫17XL、17XNL或265BY，17XL和265BY能在感染后5天原虫血症达到20%左右；[0016]第二步、摘眼球取感染疟原虫血，大约5-10 X IO7感染红细胞加入到IOml含20%FCS的RPMI1640完全培养基中，所述完全培养基中含25mM Hepes, 40IUheparin, 50IUml-l,300g(1400rpm) X8min离心后沉淀用150ml RPMI1640完全培养基重悬，置37°C孵箱中培养，孵箱中的混合气体:10%的02，5%的C02，85%的N2 ；
[0017]第三步、在培养12h后，取35ml加置IOml用60 % Nycodenz/PBS配制的梯离液的表面，300g(1400rpm) X25min离心，收集位于界面的裂殖体，加培养基重悬后，200g (1000rpm) X8min 离心洗涤，大约 100 μ I 沉淀用 300 μ I 含 0.2mM CaCl2 的 PBS 重悬，
并计算裂殖体的数量。
[0018]所述步骤(C)包括如下步骤:5ml感染疟原虫的红细胞进行12小时的培养使疟原虫生长同步，用裂殖体进行电转，电转用T细胞缓冲液中程序U33，将得到的产物从尾部静脉注射感染小鼠，疟原虫复制一个周期后，饮水中加入药物处理5-6天。
[0019]所述一个周期的时间为24-30小时。
[0020]所述药物为乙胺嘧啶药物，所述乙胺嘧啶药物的配制方法为:首先用DMSO溶解至7mg/ml，然后用IM HCl调节到ρΗ3.5-5的水稀释到100倍。
[0021]所述步骤(d)包括如下步骤:在目的基因中间设计一对引物，正向引物b和反向引物c ;5’ UTR设计正向引物a ;3’ UTR设计反向引物d，若是敲除成功，野生型应用引物对a/c和b/d应能扩增出特异片段，而基因敲除型则不能。
[0022]本发明的有益技术效果在于:通过基因敲除的方法制备的减毒虫株疟原虫子孢子的需求量远少于放射减毒方法，而且遗传性状更稳定。本发明采用基于PCR方法的三步法扩增获得线性化的基因敲除质粒，比传统的酶切连接方法更快速，尤其是对质粒中多片段的插入更有优势。本发明的转染技术，高效、省时，转染效率可达到10-2-10-3。
【专利附图】
【附图说明】`
[0023]图1:基因敲除或转基因痕原虫原理。
[0024]图2:基于PCR方法的三步法扩增获得线性化的同源重组质粒流程示意图。
[0025]图3:基因敲除质粒的转染流程。
[0026]图4:基因敲除痕原虫克隆的鉴定和筛选的不意图。
【具体实施方式】
[0027]下面结合附图和实施例，对本发明的【具体实施方式】作进一步详细描述。以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
[0028]本发明是一种基因敲除疟原虫的建立方法，所依据的基本理论是基因敲除或转基因痕原虫(knock-out OR knock-1n)原理:利用基因同源重组,包括单次杂交(homologoussingle cross-over)和两次杂交(homologous doublecross-over),完成目的基因的插入、替换和缺失，如图1所示。
[0029]本发明一种基因敲除疟原虫的建立方法包括以下步骤:
[0030](a)构建线性化的基因敲除质粒；
[0031](b)疟原虫成熟裂殖体的培养；
[0032](C)基因敲除质粒(线性化)转染；[0033](d)基因敲除疟原虫的鉴定。
[0034]如图2所示，所述步骤(a)采用基于PCR方法的三步法扩增获得线性化的同源重组质粒:
[0035]第一步:根据目的基因的序列，设计两对引物，分别为Pi/Pii或者Piii/Piv，分别从疟原虫的DNA中同源扩增出目的基因的5’和3’端大约500bp左右片段；其中引物Pi和Piv在设计时在5’端分别加入EcoR V和Not I酶切位点，引物Pii和Piii在设计时在5’端引入与筛选标记序列互补的23bp核苷酸；
[0036]第二步:将第一步的产物和含有选择标记hdhfr或者二氢叶酸还原酶的线性化质粒混匀后，加入引物Pi和hDHFR反向引物进行PCR扩增，获得线性化的同源重组质粒前半段，加入hDHFR正向引物和Piv进行PCR扩增，获得线性化的同源重组质粒的后半段，其中hDHFR的正向和反向引物之间设计20个同源序列；
[0037]第三步:以第二步扩增得到的两种产物为模板，加入引物Pi和Piv进行PCR扩增，得到完整的线性化的基因敲除质粒。
[0038]PCR体系:主要成分包括线性化的包含hDHFR的质粒DNA，50ng PCRI产物和高保真DNA聚合酶混合物；PCR扩增条件:95°C 2min，35个循环，68°C延伸，延伸时间依据需要拼接的两片段长度之和计算lkb/min ;模板浓度为50ng，引物浓度应按IOpmol进行稀释一般稀释1/4获得较特异的扩增产物。需要注意的是:引物浓度不能按太高否则容易出现非特异性扩增，模版的浓度一般控制在50ng左右可以得到较特异的扩增产物。
[0039]在上述步骤中 所需主要试剂:
[0040]1、pDEFhDHPEA ;2、Advantage 2 Polymerase Mix ;3、引物 Pi/Pii&Piii/Piv，hDHFR正向和反向引物；4、限制性内切酶Scal ;5、筛选药物乙胺嘧唳(pyrimethamine)或WR99210
[0041]上述步骤获得线性化的同源重组质粒:比传统的酶切连接方法更快速，尤其是对质粒中多片段的插入更有优势。
[0042]所述步骤(b)包括如下步骤:
[0043]第一步、常规腹腔注射感染鼠疟原虫17XL、17XNL或265BY，17XL和265BY能在感染后5天原虫血症达到20%左右；
[0044]第二步、摘眼球取感染疟原虫血，大约5-10 X IO7感染红细胞加入到IOml含20%FCS的RPMI1640完全培养基中，所述完全培养基中含25mM Hepes, 40IUheparin, 50IUml-l,300g(1400rpm) X8min离心后沉淀用150mlRPMI1640完全培养基重悬，置37°C孵箱中培养，孵箱中的混合气体:10%的02，5%的C02，85%的N2 ;
[0045]第三步、在培养12h后，取35ml加置IOml用60 % Nycodenz/PBS配制的梯离液的表面，300g(1400rpm) X25min离心，收集位于界面的裂殖体，加培养基重悬后，200g (1000rpm) X8min 离心洗涤，大约 100 μ I 沉淀用 300 μ I 含 0.2mM CaCl2 的 PBS 重悬，
并计算裂殖体的数量。
[0046]如图3所示,所述步骤(C)包括如下步骤:5ml感染痕原虫的红细胞进行12小时的培养使疟原虫生长同步，用裂殖体进行电转，电转用T细胞缓冲液中程序U 33，将得到的产物从尾部静脉注射感染小鼠，疟原虫复制一个周期后，饮水中加入药物处理5-6天，具体根据阴性对照(未转染疟原虫感染小鼠)的原虫血症归零的时间进行调整。[0047]所述一个周期的时间为24-30小时。
[0048]所述药物为乙胺嘧啶药物，所述乙胺嘧啶药物的配制方法为:首先用DMSO溶解至7mg/ml，然后用IM HCl调节到ρΗ3.5-5的水稀释到100倍。
[0049]如图4所示，所述步骤(d)包括如下步骤:在目的基因中间设计一对引物，正向引物b和反向引物c ;5’ UTR设计正向引物a ;3’ UTR设计反向引物d，若是敲除成功，野生型应用引物对a/c和b/d应能扩增出特异片段，而基因敲除型则不能。
[0050]以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本【技术领域】的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和变型，这些改进和变型也应视为本发明的保护范 围。
【权利要求】
1.一种基因敲除疟原虫的建立方法，其特征在于，包括以下步骤: (a)构建线性化的基因敲除质粒； (b)疟原虫成熟裂殖体的培养； (C)基因敲除质粒(线性化)转染； (d)基因敲除疟原虫的鉴定。
2.根据权利要求1所述的一种基因敲除疟原虫的建立方法，其特征在于， 所述步骤(a)采用基于PCR方法的三步法扩增获得线性化的基因敲除质粒: 第一步:根据目的基因的序列，设计两对引物，分别为Pi/Pii或者Piii/Piv，分别从疟原虫的DNA中同源扩增出目的基因的5’和3’端大约500bp左右片段；其中引物Pi和Piv在设计时在5’端分别加入EcoR V和Not I酶切位点，引物Pii和Piii在设计时在5’端引入与筛选标记序列互补的23bp核苷酸； 第二步:将第一步的产物和含有选择标记hdhfr或者二氢叶酸还原酶的线性化质粒混匀后，加入引物Pi和hDHFR反向引物进行PCR扩增，获得线性化的同源重组质粒前半段，加入hDHFR正向引物和Piv进行PCR扩增，获得线性化的同源重组质粒的后半段，其中hDHFR的正向和反向引物之间设计20个同源序列； 第三步:以第二步扩增得到的两种产物为模板，加入引物Pi和Piv进行PCR扩增，得到完整的线性化的基因敲除质粒。
3.根据权利要求2所述的一种基因敲除疟原虫的建立方法，其特征在于，PCR体系:主要成分包括线性化的包含hD HFR的质粒DNA，50ng PCR I产物和高保真DNA聚合酶混合物；PCR扩增条件:95°C 2min，35个循环，68°C延伸，延伸时间依据需要拼接的两片段长度之和计算，lkb/min ;模板浓度为50ng,引物浓度应按IOpmol进行稀释一般稀释1/4获得较特异的扩增产物。
4.根据权利要求1所述的一种基因敲除疟原虫的建立方法，其特征在于，所述步骤(b)包括如下步骤: 第一步、常规腹腔注射感染鼠疟原虫17XLU7XNL或265BY，17XL和265BY能在感染后5天原虫血症达到20%左右； 第二步、摘眼球取感染疟原虫血，大约5-10X IO7感染红细胞加入到IOml含20% FCS的RPMI1640完全培养基中，所述完全培养基中含25mM Hepes, 40IUheparin, 50IU ml-1,300g(1400rpm) X8min离心后，沉淀用150ml RPMI1640完全培养基重悬，置37°C孵箱中培养，孵箱中的混合气体:10%的02，5%的C02，85%的N2 ; 第三步、在培养12h后，取35ml加置IOml用60 % Nycodenz/PBS配制的梯离液的表面，300g (1400rpm) X 25mi η离心，收集位于界面的裂殖体，加培养基重悬后，200g (1000rpm) X8min 离心洗涤，大约 100 μ I 沉淀用 300 μ I 含 0.2mM CaCl2 的 PBS 重悬，并计算裂殖体的数量。
5.根据权利要求1所述的一种基因敲除疟原虫的建立方法，其特征在于，所述步骤(c)包括如下步骤:5ml感染疟原虫的红细胞进行12小时的培养使疟原虫生长同步，用裂殖体进行电转，电转用T细胞缓冲液中程序U33，将得到的产物从尾部静脉注射感染小鼠，疟原虫复制一个周期后，饮水中加入药物处理5-6天。
6.根据权利要求6所述的一种基因敲除疟原虫的建立方法，其特征在于，所述一个周期的时间为24-30小时。
7.根据权利要求6所述的一种基因敲除疟原虫的建立方法，其特征在于，所述药物为乙胺嘧啶药物，所述乙胺嘧啶药物的配制方法为:首先用DMSO溶解至7mg/ml，然后用IMHCl调节到pH 3.5-5的水稀释到100倍。
8.根据权利要求1所述的一种基因敲除疟原虫的建立方法，其特征在于，所述步骤(d)包括如下步骤:在目的基因中间设计一对引物，正向引物b和反向引物c ;5’ UTR设计正向引物a;3’UTR设计反向引物d，若是敲除成功，野生型应用引物对a/c和b/d应能扩增出特异片段，而基因敲除型则·不能。
【文档编号】C12R1/90GK103849641SQ201210595231
【公开日】2014年6月11日 申请日期:2012年12月31日 优先权日:2012年12月31日
【发明者】刘权兴, 谭章平, 戴纪刚, 徐文岳 申请人:徐文岳, 戴纪刚, 谭章平, 刘权兴