专利名称：一种锌指蛋白dpzf基因敲除小鼠模型及用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及转基因技术领域，更具体地涉及一种锌指蛋白DPZF基因敲除 动物模型的建立和功用。
背景技术：
锌指蛋白是一类广泛存在于动植物及人类的DNA结合蛋白。由于其选择性 地结合各种DNA和RNA序列的特性，它在基因的表达调控、细胞分化、配子的 形成和胚胎发育等生命过程中起着十分重要的作用。自1985年开始，科学工 作者在这方面进行了大量的研究.目前发现，研究的大多数锌指蛋白是基因调 控因子.它们不仅可结合于DNA， RNA和DNA-RNA杂交体，还能与其他锌指蛋 白结合，控制生物体中基因的转录、翻译和蛋白的合成。
至今为止，已发现的锌指结构有10种，锌指蛋白DPZF是和BCL-6同源的 POZ锌指蛋白亚家族的新成员。目前，对锌指蛋白DPZF的了解极其有限，也缺 乏必要的手段。
因此，本领域迫切需要提供一种锌指蛋白DPZF基因敲除动物模型，它可 为深入了解锌指蛋白DPZF的生物学功能提供有效的研究途径和方法，并由此
提供其应用。
发明内容
本发明旨在提供一种锌指蛋白DPZF基因敲除动物模型。 本发明的另一个目的是提供上述锌指蛋白DPZF基因敲除动物模型的用途。
在本发明的第一方面，提供了一种产生锌指蛋白DPZF基因敲除非人哺乳动 物模型的方法，它包括步骤
(i)提供一线性化的基因打靶载体构建物，该构建物从5'至3'依次含有 (a)DPZF打耙短臂、正选择基因，(b)自杀基因，(c)DPZF打靶长臂； (ii)通过体外转染胚胎干细胞(ES细胞)、筛选与打靶载体发生同源重组 的阳性ES细胞克隆，经显微注射技术入非人哺乳动物囊胚中；
(iii) 将步骤(ii)得到的囊胚植入假孕的非人哺乳动物的子宫；
(iv) 产生锌指蛋白DPZF基因敲除非人哺乳动物模型。
在另一优选例中，还包括步骤
(v) 对步骤(iv)获得的锌指蛋白DPZF基因敲除动物进行鉴定。
在另一优选例中，还包括步骤
(vi) 使获得的锌指蛋白DPZF基因敲除动物进行交配建系，获得子代。 在另一优选例中，所述的正选择基因是Neo、 hph、或gpt。 在另一优选例中，所述的自杀基因是HSV-tk、胞嘧啶脱氨酶基因、或
VIV-TK。
在另一优选例中，所述的非人哺乳动物是小鼠、大鼠、兔或猴。 在另一优选例中，所述的非人哺乳动物是小鼠。 在另一优选例中，所述的转基因构建物基因删除外显子。 在另一优选例中，所述的转基因构建物不含启动子。
在另一优选例中，所产生的是锌指蛋白DPZF编码第91位至602位氨基酸缺
失的非人哺乳动物。
在本发明的第二方面，提供了一种用上述方法产生的锌指蛋白DPZF基因 敲除非人哺乳动物模型。
在本发明的第三方面，提供了一种用上述方法产生的锌指蛋白DPZF基因 敲除非人哺乳动物模型的用途，所述的动物模型可用于筛选(a)促进生长发育， (b)促进听力，或(c)改善血糖代谢的药物。
在本发明的第四方面，提供了一种锌指蛋白DPZF的用途，它可用于制备治疗 (a)促进生长发育，(b)促进听力，或(c)改善血糖代谢的药物。
在另一优选例中，可以将锌指蛋白DPZF及其所在的上、下游生物信号转导通 路作为治疗生长发育障碍、听力障碍和肥胖、高血糖等疾病的药物干预靶点。
据此，本发明提供了一种锌指蛋白DPZF基因敲除动物模型，有效地揭示 了锌指蛋白DPZF的生物学功能，并由此提供了锌指蛋白DPZF基因敲除动物模 型及锌指蛋白DPZF的用途。
图1是锌指蛋白DPZF基因打靶载体及其与基因组进行同源重组的示意图。 图2显示了锌指蛋白DPZF基因敲除小鼠基因型Southern (DNA印迹杂交) 鉴定；
其中4、 5、 8、 ll表示DPZF基因敲除杂合子，3、 6、 7、 9、 10表示野生 型基因；
其中+/ —表示0 2 基因敲除杂合子，一/一表示DPZF基因敲除纯合子。 图3显示了锌指蛋白DPZF基因敲除小鼠生长发育障碍的情况； 左边为出生后3周的锌指蛋白DPZF基因敲除小鼠，右边为同龄的正常对 照小鼠。
图4显示了锌指蛋白DPZF基因敲除小鼠对不同频率的声波刺激丧失反应 的情况。
图5显示了锌指蛋白DPZF在正常小鼠内耳中表达的免疫组化染色结果。 图6显示了锌指蛋白DPZF基因敲除小鼠低血糖的情况及其机理分析， 其中wt表示野生型小鼠，ko表示锌指蛋白DPZF基因缺陷小鼠。 图7是糖耐量实验显示锌指蛋白DPZF基因敲除小鼠葡萄糖清除能力增强。 其中0 2 + / +表示野生型，—/一表示DPZF基因缺陷型。
具体实施例方式
发明人经过广泛而深入的研究，建立了锌指蛋白DPZF基因敲除小鼠模型， 通过对该模型的表型分析，意外地发现，锌指蛋白DPZF基因敲除小鼠有生长 发育障碍，听力丧失，血糖水平显著低下，胰岛素水平低下葡萄糖清除能力增 强等情况发生，有效显示了锌指蛋白DPZF的生物学功能。
锌指蛋白DPZF基因敲除动物模型的建立
本发明通过本领域熟知的基因打靶技术建立锌指蛋白DPZF基因敲除动物模 型，可用于本发明的自杀基因没有特别限制，可以选用本领域常规使用的各种 自杀基因。代表性的例子包括(但并不限于)hsv-TK、胞嘧啶脱氨酶(CD)、 VIV-TK等。
可用于本发明的正选择基因没有特别限制，可以选用本领域常规使用的各 种正选择基因。代表性的例子包括(但并不限于)Neo、 hph、 、 gpt等。
本发明利用Cre重组酶将正选择基因Neo最终从基因组中去除，避免其对 小鼠表型的可能影响。
锌指蛋白DPZF基因敲除动物模型
本发明所建立的锌指蛋白DPZF基因敲除动物模型中所敲除的可以是其基 因组结构中任一段外显子，优选敲除编码锌指蛋白DPZF第91一602位氨基酸 的外显子。
本发明的锌指蛋白DPZF基因敲除基因长度可以是l一20kb，优选3 — 6kb， 更优选3 — 4kb。
锌指蛋白DPZF基因敲除动物模型的用途
本发明提供的锌指蛋白DPZF基因敲除动物的表型分析显示了生长发育障 碍，听力丧失和血糖代谢失稳等状况。
本发明的一个优选例中，利用该模型筛选促进生长发育的化合物，方法如下
(1) 在测试组中，给锌指蛋白DPZF基因敲除动物服用待筛选的候选物，并检 测生长发育情况；
(2) 若步骤(1)测试组中生长发育情况的改善在统计学上高于(更优选明显高
于)对照组(未服用候选物组)中生长发育情况，就表明该候选物是可促进生长发 育的化合物。
本发明的另一优选例中，利用该模型筛选促进听力的化合物，方法同筛选促 进生长发育的化合物的类似。
本发明的再一优选例中，利用该模型筛选改善血糖代谢的化合物，方法同筛 选促进生长发育的化合物的类似。
本发明揭示了锌指蛋白DPZF的生物学功能，在本发明的一个优选例中提供了 一种制备治疗生长发育障碍疾病的药物的方法，就是加入治疗有效量的锌指蛋白 DPZF及药学上可接受的载体。可以制成各种剂型，包括(但不限于)片剂、胶 囊、注射剂等。
本发明的另一优选例中提供了一种制备治疗听力障碍疾病的药物的方法，就 是加入治疗有效量的锌指蛋白DPZF及药学上可接受的载体。可以制成各种剂型， 包括(但不限于)片剂、胶囊、注射剂等。
本发明的再一优选例中提供了一种制备治疗血糖代谢疾病的药物的方法，就
是加入治疗有效量的锌指蛋白DPZF及药学上可接受的载体。可以制成各种剂型，
包括(但不限于)片剂、胶囊、注射剂等。 本发明的主要优点在于
1. 首次建立了锌指蛋白DPZF基因敲除动物；
2. 首次利用该模型揭示了锌指蛋白DPZF的生物学功能，可以将锌指蛋白 DPZF及其上、下游生物传导通路作为药物治疗生长发育障碍、听力障碍、或/ 和血糖代谢疾病等的作用靶点；
3. 运用该模型有效地进行针对性的药物筛选。
下面将结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于 说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验 方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆实验室手册(New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的条件，或按照 制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则所有的百分比和份数按重量计。
除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟 悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于 本发明方法中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。
实施例l
建立锌指蛋白基因敲除模型
1、 通过构建基因打靶载体，见图1;
2、 将上述载体转染胚胎干细胞(ES)，筛选同源重组的ES克隆；
3、 将步骤(3)获得的同源重组的ES细胞行囊胚注射后、植入假孕小鼠
子宫，得到嵌合小鼠；
5、嵌合小鼠进一步交配后得到锌指蛋白DPZF的基因敲除小鼠，其基因型 经Southern印迹杂交鉴定，见图2， DPZF蛋白缺失经Western免疫印迹和免 疫组化分析确认。
实施例2
锌指蛋白基因敲除敲除小鼠的表型分析1
实施例1获得的DPZF基因缺陷小鼠出生时无明显异常，出生后一周表现 出明显的生长发育障碍，体重是正常小鼠的50%左右，见图3。
结果显示大部分小鼠出生后3周死亡，其余小鼠存活时间不超过5个月。
实施例3
锌指蛋白基因敲除小鼠的表型分析2
实施例1获得的DPZF基因缺陷小鼠听力完全丧失，见图4。 免疫组化分析结果显示，DPZF在正常小鼠的内耳细胞中特异表达(见图5)， 提示DPZF为小鼠听力发育所必需。
实施例4
锌指蛋白基因敲除敲除小鼠的表型分析3
实施例1获得的DPZF基因缺陷小鼠异常消瘦，见图3，血糖水平显著低下， 进一步分析其肝糖原水平基本正常，血清胰高血糖素水平正常、胰岛素水平低 下(见图6、 7)，葡萄糖耐量试验显示其对血清葡萄糖的清除能力增强。
结果显示锌指蛋白DPZF在维持机体血糖代谢的稳态中发挥重要作用。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并非用以限定本发明的实质技术 内容范围，本发明的实质技术内容是广义地定义于申请的权利要求范围中，任 何他人完成的技术实体或方法，若是与申请的权利要求范围所定义的完全相 同，也或是一种等效的变更，均将被视为涵盖于该权利要求范围之中。
权利要求
1.一种产生锌指蛋白DPZF基因敲除非人哺乳动物模型的方法，其特征在于，它包括步骤(i)提供一线性化的基因打靶载体构建物，该构建物从5’至3’依次含有(a)DPZF打靶短臂、正选择基因，(b)自杀基因，(c)DPZF打靶长臂；(ii)通过体外转染胚胎干细胞(ES细胞)、筛选与打靶载体发生同源重组的阳性ES细胞克隆，经显微注射技术入非人哺乳动物囊胚中；(iii)将步骤(ii)得到的囊胚植入假孕的非人哺乳动物的子宫；(iv)产生锌指蛋白DPZF基因敲除非人哺乳动物模型。
2. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的正选择基因是Neo、 hph、 或gpt。
3. 如权利要求l所述的方法，其特征在于，所述的自杀基因是HSV-tk、胞 嘧啶脱氨酶基因、或VIV-TK。
4. 如权利要求l所述的方法，其特征在于，所述的非人哺乳动物是小鼠、 大鼠、兔或猴。
5. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的非人哺乳动物是小鼠。
6. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的转基因构建物基因删 除外显子。
7. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，产生锌指蛋白DPZF编码第91 位至602位氨基酸缺失的非人哺乳动物。
8. —种用权利要求l一6任一所述的方法产生的锌指蛋白DPZF基因敲除非 人哺乳动物模型。
9. 一种用权利要求1-6中任一项所述的方法产生的锌指蛋白DPZF基因敲 除非人哺乳动物模型的用途，其特征在于，所述的动物模型用于筛选(a)促进生 长发育，(b)促进听力，或(c)改善血糖代谢的药物。
10. —种锌指蛋白DPZF的用途，其特征在于，用于制备治疗(a)促进生长发 育，(b)促进听力，或(c)改善血糖代谢的药物。
全文摘要
本发明公开了一种锌指蛋白DPZF基因敲除非人哺乳动物模型及其制备方法，本发明还公开了利用所述的锌指蛋白DPZF基因敲除非人哺乳动物模型筛选促进生长发育、改善听力和血糖代谢的化合物的方法，以及将DPZF及其所在的上、下游生物信号转导通路作为药物干预靶点治疗生长发育障碍、听力障碍和肥胖、高血糖等疾病的用途。
文档编号A01K67/027GK101096684SQ200610028218
公开日2008年1月2日 申请日期2006年6月27日 优先权日2006年6月27日
发明者章卫平 申请人:章卫平