专利名称：一种条件性基因敲除载体的构建方法
一种条件性基因敲除载体的构建方法技术领域：
本发明涉及生物基因工程领域中的基因敲除技术，特别是涉及基因
敲除载体的构建方法，尤其是一种适用于小鼠染色体基因敲除载体的构建方法。
背景技术：
基因敲除(geneknockout)，是指对一个结构已知但功能未知的基因， 从分子水平上设计实验，将该基因去除，然后从整体观察实验动物，推测相应基因的功能。 基因敲除除可中止某一基因的表达外，还包括引入新基因及引入定点突变。既可以是用突 变基因或其它基因敲除相应的正常基因，也可以用正常基因敲除相应的突变基因。
基因敲除是80年代后半期应用DNA同源重组原理发展起来的一门新技术。
基因敲除的技术路线如下
(1)构建重组基因敲除载体 (2)用电穿孔、显微注射等方法把重组DNA转入受体细胞核内
(3)用选择培养基筛选已击中的细胞 (4)将击中细胞转入胚胎使其生长成为转基因动物，对转基因动物进行形态观察 及分子生物学检测 条件性基因敲除法可定义为将某个基因的修饰限制于小鼠某些特定类型的细胞 或发育的某一特定阶段的一种特殊的基因敲除方法。它实际上是在常规的基因敲除的基础 上，利用重组酶Cre介导的位点特异性重组技术，在对小鼠基因修饰的时空范围上设置一 个可调控的"按钮"，从而使对小鼠基因组的修饰的范围和时间处于一种可控状态。具体的 讲，就是在要敲除的基因两侧各插入一个lo邓序列。 其中，条件性基因敲除载体的构建工作在目前要花费大量的时间和人力成本，敲
除载体的构建方法也关系到整个基因敲除方案的设计的难易。 条件性基因敲除载体的最终形式如附图1所示。 第一、条件性基因敲除载体构建的第一种方法(附图2) 传统的基因敲除载体构建方法是以细菌体内同源重组为基本技术进行的。要用到 可进行高效体内同源重组的工程菌株(如DY380、EL350或EL250)，以及多个基础质粒(如 pL253、pL452、pL451)(附图3)。基本步骤如下:
l.BAC的抽提及纯化 2.电转用感受态重组菌(如EL350)的制备及电转化BAC到重组菌株
3.构建pL253打耙质粒
4.套取BAC中的目的片段
5.构建pL452打耙质粒 6.插入第一个loxP (两个loxp中间夹一个neo)
7.纯化含第一个lo邓的质粒 8.菌体内表达cre酶删除neo，剩下一个loxp序列
9.构建pL451打耙质粒 10.插入第二个loxP ( —个loxp和一个neo)
11.纯化质粒
12.测序鉴定最终得到的质粒 该方法存在的缺点是步骤繁琐，耗费时间长(通常做一个载体需要两个月甚至 更长的时间)，工作量极大。需要的材料较多，重组菌和基本质粒一般实验室难以获得，所需 的仪器设备较多，如电转化仪、水浴摇床等，并非所有实验室都有这个条件，繁琐的步骤使 得该方法具体设计变得极其复杂，并且容易受制于酶切位点，选酶变得非常困难。
第二、条件性基因敲除载体构建的第二种方法 由于PCR酶的扩增效率和保真性的提高，目前世界上很多实验室采用PCR的方法 来获取同源臂和要敲除的基因序列(即附图1中的L、M、R)，用普通的酶切连接法将三个片 段依次连入基本质粒(如pEASY-Flirt)中，从而达到载体构建的目的。(附图4)。步骤如 下 1、分别PCR出L、M、R片段(如附图1所示)，回收片段；
2、用BamHI酶切基本质粒pEASY-Flirt和L片段，并回收；
3、连接，转化普通大肠杆菌感受态，涂板；
4、挑克隆提质粒鉴定； 5、用Ascl酶切上已连入L片段的pEASY-Flirt质粒R片段，并回收；
6、连接，转化普通大肠杆菌感受态，涂板；
7、挑克隆提质粒鉴定； 8、用Sail酶切已连入L和R片段的pEASY-Flirt和M片段，并回收； 9、连接，转化普通大肠杆菌感受态，涂板； 挑克隆提质粒鉴定； 10、测序鉴定最终得到的质粒。 该方法步骤简单，但是由于方法本身的原因，有些无法克服的缺点，如 1.很难连接长片段的同源臂。由于基因敲除载体是用于基因打靶的，要求同源臂
不能太短，一般2K到7K左右，而这种长度的大片段用传统的酶切连接方法非常困难。 2.克隆过程中载体自连情况严重。这是此种方法实际应用起来最为困难的一个情
况，由于载体是采用单酶切连接，且连接片段较长，即便是优化的连接体系中，也需要耗费
非常多的工作量从大量的克隆中筛选正确克隆。阳性克隆率极低。 3.实际耗费时间长。由于极低的阳性克隆率，造成在工作量大的同时耗费的时间
也相对较长，一般用此种方法完成一个载体构建需要一个月左右的时间。 4.选酶较为困难。由于基本质粒只提供单酶切位点，如果在L上有BamHI，M上有
SalI，R上有Ascl则无法进行，只能换方案或者用消化成平末端进行连接，但是会产生更多问题。
发明内容本发明目的是克服现有技术存在的上述不足，提供一种高效并且合
理的完成条件性基因敲除载体的构建方法。
本发明提供的条件性基因敲除载体的构建方法，包括如下步骤 第1、设计引物按常规设计左右同源片段L和R以及要敲除的序列M的引物，并
在引物的5'端加入如下序列 L上游引物加入TAGCGGCCGCGGATCCL下游引物加入ACGAAGTTATGGATCC
4
M上游引物加入TAGGAACTTCGTCGAC
M下游引物加入AAATGACGTGGTCGAC
R上游引物加入CGAAGTTATGGCGCGCC
R下游引物加入TGTTTAAACGGCGCGCC ; 第2、 PCR左右同源片段L、 R和要敲除的序列M，回收片段； 第3、BamHI酶切基本质粒(如pEASY-Flirt)，回收，根据实际情况，也可先切其他 两个位点； 第4、 10微升亍本系中加入亍本外重纟且酶(In-Fusion Advantage PCR Cloning Kit) 1微升，buffer2微升，载体和片段L按试剂说明书比例加入，水补齐；体系放置于 37°C 30min， 50°C 30min ;之后加入40微升pH = 8. 0的TE，混匀，从中取5微升转化感受态 细胞，转化感受态，然后加入LB液体培养基500微升，放置于37t:摇床200rpml小时；涂相 应抗性平板，37t:培养箱放置过夜；挑克隆，提质粒，酶切鉴定正确的质粒；
第5、将第4步鉴定正确的质粒用Ascl切，回收；标记为+pL
第6、10微升体系中加入体外重组酶(In-Fusion Advantage PCR Cloning Kit) 1 微升，buffer2微升，第5步得到的载体+pL和片段R按试剂说明书比例加入，水补齐；体系 放置于37°C 30min，50。C 30min ;之后加入40微升pH = 8. 0的TE，取5微升转化感受态细 胞；转化后加LB500微升200rpml小时；涂相应抗性平板，37。C培养箱放置过夜；挑克隆，提 质粒，酶切鉴定正确的质粒； 第7、将第6步鉴定正确的质粒用Sail切，回收；标记为+pLR第8、10微升体系中加入体外重组酶(In-Fusion Advantage PCR Cloning Kit) 1
微升，buffer2微升，第7步得到的载体+pLR和片段M按试剂说明书比例加入，水补齐；体
系放置于37°C 30min， 50°C 30min ;之后加入40微升pH = 8. 0的TE，取5微升转化感受态
细胞；转化后加LB500微升200rpml小时；涂相应抗性平板，37。C培养箱放置过夜；挑克隆，
提质粒，酶切鉴定正确的质粒； 第9、测序鉴定最终得到的基因敲除载体。 此方法不仅可以用于小鼠条件性基因敲除载体的构建，而且可以用于其它符合此 基因敲除原理的其他物种的条件性基因敲除载体构建工作。而且本技术思路还可用于基因 敲入载体的构建。 本发明的优点和积极效果 本发明与现有载体构建方法比较具有如下优点 1、极大节省时间。本发明所述方法一般用一周时间即可完成载体构建工作；
2、适合长片段的同源臂。由于采用重组的方法而非传统酶切连接的方法，可以在 不明显降低效率的情况下适合几十bp到十几Kb长度的片段重组。 3、阳性克隆率极高。高的克隆效率和正确率使得该方法的重复性很好，基本可以 保证一次成功。 4、极大节省工作量。该方法应用简单，并且不需要大量的挑克隆鉴定工作，大大节 省劳动量。 5、受酶切位点的影响小了很多。采用重组而非酶切，所以即便L上有BamHI， M上 有Sall， R上有Ascl也可照样进行载体构建而无须改动设计。
图1是条件性基因敲除载体示意图，图中，L为左同源臂、N为PGK-Neo序列、M为 要敲除的基因序列、R为右同源臂、TK为负筛选标记、三角形代表LoxP序列、椭圆形代表FRT 序列、虚线部分为载体骨架序列； 图2是条件性基因敲除载体构建方法一的流程图；
图3是条件性基因敲除载体构建方法二的示意图；
图4是本发明方法的示意图；
图5是实施例1的最终条件性基因敲除载体图。
具体实施方式
实施例1 : mirna-146a的条件性基因敲除载体的构建
第1、设计引物，L上游引物TAGCGGCCGCGGATCCGGCTCTCTGTGAGATCTCACGA
L下游引物ACGAAGTTATGGATCCGATATCATCCCAGCGAAGAAGAAGGT
M上游引物TAGGAACTTCGTCGACTATGGGGTGGCCTCAAACTG
M下游引物AAATGACGTGGTCGACGCTCTCTTTTTCTTCTTGACGAT
R上游引物CGAAGTTATGGCGCGCCGATATCAAACATTGTGGCACATAC
R下游引物TGTTTAAACGGCGCGCCTCTTTGGTATCAACTTGACA 。 第2、用以上引物PCR左右同源片段和要敲除的序列，分别标记为aL、 aR和aM，回 收片段； 第3 、 BamHI酶切基本质粒pEASY-Fl irt ，回收 第4、 10微升体系中加入体外重组酶(In-Fusion Advantage PCR Cloning Kit)l微升，buffer2微升，载体和片段aL按试剂说明书比例加入，水补齐。体系放置于 37°C 30min， 50°C 30min。之后加入40微升pH = 8. 0的TE，混匀，从中取5微升转化感受态 细胞，转化感受态，然后加入LB液体培养基500微升，放置于37t:摇床200rpml小时；涂相 应抗性平板，37t:培养箱放置过夜；挑克隆，提质粒，酶切鉴定正确的质粒。
第5、鉴定正确的质粒用Ascl切，回收； 第6、 10微升体系中加入体外重组酶(In-Fusion Advantage PCR Cloning Kit)l微升，buffer2微升，载体和片段aR按试剂说明书比例加入，水补齐。体系放置于 37°C 30min， 50°C 30min。之后加入40微升pH = 8. 0的TE，混匀，从中取5微升转化感受态 细胞，转化感受态，然后加入LB液体培养基500微升，放置于37t:摇床200rpml小时；涂相 应抗性平板，37t:培养箱放置过夜；挑克隆，提质粒，酶切鉴定正确的质粒。
第7、鉴定正确的质粒用Sail切，回收 第8、 10微升体系中加入体外重组酶(In-Fusion Advantage PCR Cloning Kit)l微升，buffer2微升，载体和片段aM按试剂说明书比例加入，水补齐。体系放置于 37°C 30min， 50°C 30min。之后加入40微升pH = 8. 0的TE，混匀，从中取5微升转化感受态 细胞，转化感受态，然后加入LB液体培养基500微升，放置于37t:摇床200rpml小时；涂相
6应抗性平板，37。C培养箱放置过夜；挑克隆，提质粒，酶切鉴定正确的质粒。 第9、将最终得到设计的基因敲除载体质粒，质粒送测序公司测序，测序结果与设
计的序列比对后证明序列完全符合设计。测序结果如下，
aL ggctctctgtgagatctcacgagggtggggcaaaggcctggcagccttggtcttgctgcatccccagca tctggcctcacctctccg gtectctgtgggtgagtgatgagccggtggaggtggagggagagctgtcgctggatc^tgcgattggc ttttcaaagtgcatcatg gtcccctcctagggcacttggcatgctgtgggaggcatcctacctgctcaagtctcatatgctcataaa gctgcca^gag^gg^t tagatgataccatctttcatctttggagtctggctcacacaggagctttgtgaaggcacacaggctgga c3C肌3tg肌ggtg3ctcatctc3ctttg3tgC3C3CC3tggg^tg3gggtgtegg^^tg^ttte actctgtctcctttcttgaaaaaaaatttctggactgtgtctatgatccaagtgtgttctagaagctgg ctactccctactccgacatgaaaaaagttaaaagtgagcttatagggtcagaaccccccctggaaatat ^tete3ttcttet^ttte3tg3te^^g3C3^c3gcccagttteg^gttgc肌^tetgtg肌t tttttttttttgtctgaacaaagta gctgtgc3肌tgc3gte肌teg3tg^肌ggtgcgc^cctcattegcc3cc3ggg3g3ggc3^tc^
^CC3C3gtg3ggC3C cgctttgtecctgctggg3g^ctec^tc^肌3gtc3ggccatetegc^ggctgtgg3g^3gg^ cccccagaccctggcg g3gg^3tgtc^3tggtgg3gc3gctttegtgg3g3gtgtg3g3gttctcte^g3g3C3tggatgte atggaaccccaccatcta ctctg3gttec3g3gtc^g3g^3tg3C3gcatctetc3gc3C3g3gctggg肌tggcccteg^gc3 C3g3ggtgggctgg3g3gggggctgtgttte3肌gc3c3gactgttcttgc3g3ggtgcc^gtttgct ccccagaacccatgttgg tggctcacaacaacttgtaaatctagctctagggggactctgtagcctcctttgccacctgcattcatg ccteg3ggtcgggteteg^gtc3gg3gte^tgtg3ttegc3tgtegttteggg3tg3tt^^catt cttagattaactatggtggct atcaaacaacttcatggtaatattgaaagccattgagttttatcctttatgagtaggtaaattgtatag tcgtgagttctatttcaaagaaac agttacaattatttaaaaaaaattacttgttgttgtaggggggtcttttgttcagagacttactctataatgctagttggtctggaacccataa tgctacccaggatgaccttgaactcacagaaatcctcctgccttaacctcaagagtgctagggttacag gaatgctccattttgccgag ctgttgtttatatactttcaaaaaaaagcactagcatgggctctgcccctgtgaaaatatagtcttgtt g3C3tc^3ggctctetc^ttegttteteactetg^ggg^gg3ttg^c3tg3C3C3gg3g^tgg caggtetcactgggg^c gg3g3cg3ggtettegtg3ggctettec3ctc肌tg3ttcte3C3gatgccte^tegc3gtggcttg3 ■agggg^ggtcctgctc ttgctgacgtgaagaaatacagtttcaaagatcatctagtgccatgccctgccctatcatgggtggtgc atggcccacattgcatggtg tgggtgcagctgtactgtgcgctctgtctccatgtagaactgggtcactctaggaaatggggcctttgt gcc3ggagtgtgtgtecac ggtgtgtggggggg3ggggtggtgggttcggtg^c3C3g^g3g3C3C3gggtgac^tcc3gtc3tc tctgctattgatggtct tgctg3gg3ggtgattc3gteggtg3g3gcctc3gg3gg^teggcgttg3gggc3gttttcc3ggcc3 ggggcac3tgtetgag ggcacagtggggacggaaagaccatctgtcatgttcctgattgcttttgagaaaatcttgctacgtact tcaggctgcccttggaccag cagtcctcttgatgcaccttcttcttcgctgggatgatatc
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C3tC3Cgg3CCtg^g^C3 ctggttgg肌C3^ctctg^ggccttcategtctgcc^gg肌cttg^g3gtgg3g3g3gtggggtg ■gcgtgg^ctgctg gcaccggagggagtcatgttggattgatgtgtgttctaatttcatttctgttgctctgataaaatatct ^3gggtttetteg3ttet肌ttcc3ggtc3C3gctg3tcatteteggg^g3C3^gtegg肌cttg3
agcagctcgtctcatacatc gtc^g^g^3^g3gagc最终的mirna-146a条件性基因敲除载体图见附图5。
SEQUENCE LISTING
9〈uo〉南开大学〈120〉 一种条件性基因敲除载体的构建方法〈130〉〈160>21〈170>PatentIn version<210>1〈211>16〈212>DNA<213>Artificial〈220〉〈223〉<400>1tagcggccgc ggatcc〈210>2<211>16〈212>DNA〈213〉Artificial<220>〈223〉〈400>23cg朋gttet ggatcc〈210>3〈211>16〈212>DNA〈213〉Artificial<220>〈223〉〈400>3taggaacttc gtcgac〈210>4〈211>16<212>DNA〈213〉Artificial〈220〉<223>〈400>4a朋tgacgtg gtcgac〈210>5〈211>17
10693902 A〈212>DNA〈213〉Artificial〈220〉〈223〉〈400>5cgaagttatg gcgcgcc〈210>6〈211>17〈212>DNA〈213〉Artificial〈220〉〈223〉〈400〉6tgtttaaacg gcgcgcc〈210>7〈211>16〈212>DNA〈213>Artificial〈220〉〈223〉〈400>7tagcggccgc ggatcc〈210>8〈211>16〈212>DNA〈213〉Artificial〈220〉〈223>〈400>8acg朋gttet ggatcc〈210>9〈211>16〈211>16〈212>DNA〈213〉Artificial<220>〈223〉〈400>10肌atgacgtg gtcgac〈210>11〈211>17〈212>醒〈213〉Artificial〈220〉〈223〉〈400>11cgaagttatg gcgcgcc〈210>12〈211>17<212>DNA〈213〉Artificial〈220〉〈223〉〈400>12tgtttaaacg gcgcgcc〈210>13<211>38〈212>DNA〈213〉Artificial〈220〉〈223〉〈400>13tagcggccgc ggatccggctctctgt.gagatctcacga<210>14〈211>42〈212>DNA〈213〉Artificial〈220〉〈223〉〈400>14acg朋gttat ggatccg;at3tcatcccagcg33g朋gemg gt
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13
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〈210〉20〈211〉1704〈212〉DNA〈213〉Mus musculus〈400〉20gatetc朋3cattgtggcacataccttcacctctctggtaggccagcctgatgtecagagg卿ttgtgtctc朋ca朋gttgaccccctctctacactt3朋gagtcte織gtgggcttggatcttcctatgccaattacctgatcgagatgatcccttgtgtc郷ttgacagtgctgcg朋gcatcctete朋tegcctcactgagtttccatgattteggatgagtcaggtetgaggagactcatggg朋3C3CCactttaatgagatttcccagtctctttatgggaccagatggcatggtctgctg郷tgtttggctgctttcacatccttcttatagcccctcatcccttt朋gca朋c朋ggggt卿gtgttcttttgttacactccactgtaactgacagtttcttccctatttggacatatagtctagacctctgtc3CC朋gC3tgttgggtctctgattatctgggcttttgaatttgggaactcctctttgactcatcactacgttgtctctgaatga朋3gag郷gaggtegtgctcagtctttcaactgaggaacgteggtgctttgcctatacgatctcagtgaatcttacaacaaaaggattttttcccctgttattetattttggctcggtattgttctgagagctgctggccacatgacctcggcaggctcactttctcctttgcatg朋gtccaggttetggtggctcttcttecatcaattaactactcgatctaaateacccctcctegggateatcttgtcaagttgatacca朋ga〈210〉21〈211〉644〈212〉DNA〈213〉Mus musculus〈400〉21
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一种条件性基因敲除载体的构建方法，其特征在于该方法包括如下步骤第1、设计引物按常规设计左右同源片段L和R以及要敲除的序列M的引物，并在引物的5’端加入如下序列L上游引物加入TAGCGGCCGCGGATCCL下游引物加入ACGAAGTTATGGATCCM上游引物加入TAGGAACTTCGTCGACM下游引物加入AAATGACGTGGTCGACR上游引物加入CGAAGTTATGGCGCGCCR下游引物加入TGTTTAAACGGCGCGCC；第2、PCR左右同源片段L、R和要敲除的序列M，回收片段；第3、BamHI酶切基本质粒，回收，根据实际情况，也可先切其他两个位点；第4、10微升体系中加入体外重组酶(In-Fusion Advantage PCR Cloning Kit)1微升，buffer2微升，载体和片段L按试剂说明书比例加入，水补齐；体系放置于37℃30min，50℃30min；之后加入40微升pH＝8.0的TE，混匀，从中取5微升转化感受态细胞，转化感受态，然后加入LB液体培养基500微升，放置于37℃摇床200rpm1小时；涂相应抗性平板，37℃培养箱放置过夜；挑克隆，提质粒，酶切鉴定正确的质粒；第5、将第4步鉴定正确的质粒用AscI切，回收；标记为+pL第6、10微升体系中加入体外重组酶(In-Fusion Advantage PCR Cloning Kit)1微升，buffer2微升，第5步得到的载体+pL和片段R按试剂说明书比例加入，水补齐；体系放置于37℃30min，50℃30min；之后加入40微升pH＝8.0的TE，取5微升转化感受态细胞；转化后加LB500微升200rpm1小时；涂相应抗性平板，37℃培养箱放置过夜；挑克隆，提质粒，酶切鉴定正确的质粒；第7、将第6步鉴定正确的质粒用SalI切，回收；标记为+pLR第8、10微升体系中加入体外重组酶(In-Fusion Advantage PCR Cloning Kit)1微升，buffer2微升，第7步得到的载体+pLR和片段M按试剂说明书比例加入，水补齐；体系放置于37℃30min，50℃30min；之后加入40微升pH＝8.0的TE，取5微升转化感受态细胞；转化后加LB500微升200rpm1小时；涂相应抗性平板，37℃培养箱放置过夜；挑克隆，提质粒，酶切鉴定正确的质粒；第9、测序鉴定最终得到的基因敲除载体。
全文摘要
一种高效并且合理的完成条件性基因敲除载体的构建方法。包括如下步骤设计出包含15bp重组序列的左右同源片段L和R以及要敲除的序列M的引物，并PCR扩增出L、R和M，经过三次线性化载体，体外重组酶(In-Fusion Advantage PCR Cloning Kit)重组，转化感受态的步骤，完成最终载体的构建工作。本发明极大的节省了构建时间，且阳性克隆率极高，适合长片段的同源臂。此方法不仅可以用于小鼠条件性基因敲除载体的构建，而且可以用于符合此基因敲除原理的其它物种的条件性基因敲除载体构建工作，同时还可用于基因敲入载体的构建。
文档编号C12N15/85GK101693902SQ200910070819
公开日2010年4月14日 申请日期2009年10月16日 优先权日2009年10月16日
发明者尹芝南, 张松, 王璞玥, 罗维, 赵立青 申请人:南开大学;