专利名称：新型猪白细胞介素2和6基因表达质粒抗感染制剂的应用技术的制作方法
技术领域：
1.生物技术 2.分子免疫学背景技术白细胞介素-2(Interleuki-2，IL-2)是辅助T细胞分泌的淋巴因子，在动物细胞和体液免疫调节中起枢纽性的关键作用，(1)可刺激T淋巴细胞的增殖，维持完整免疫系统发育成熟和激活T和B细胞的关键性免疫分子，增强细胞毒T细胞的杀伤活性；(2)IL-2还通过诱导促进天然杀伤(NK)细胞和淋巴因子活化的杀伤细胞(LAK)生长，参与破坏肿瘤的过程。IL-2亦能增强自然杀伤细胞(NK细胞)活性，静止NK细胞上只表达IL-2R的β链和γ链，对IL-2的亲和力低，只能对高浓度的IL-2发生反应。一旦NK细胞活化，就表达IL-2R的α链，成为高亲和力的受体；大剂量IL-2诱导的LAK活性主要来源于NK细胞，使T细胞和NK细胞产生IFNγ、TNFβ和TGFβ等因子，促进非特异性细胞毒性；激活肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)以及产生淋巴因子活化的杀伤细胞(LAK)；(3)促进B细胞的激活、增殖、分化及成熟、产生与分泌免疫球蛋白，诱使B细胞表面表达高亲和力的IL-2R，促进B细胞由分泌IgM向分泌IgG2转换；还可诱导产生某些B细胞生长因子以及造血因子等，从而发挥相应的生物学作用；(4)IL-2的持续作用可增强单核一巨噬细胞表达高亲和力IL-2R，增强其抗原呈递能力、杀菌力和细胞毒性，促进许多细胞合成与释放如干扰素、肿瘤坏死因子多种细胞因子，为动员免疫系统抗感染和抗肿瘤所必不可少的一种细胞因子。
IL-2现已大量用于提高人类疫苗免疫应答水平和增强抗肿瘤的免疫应答，治疗一些常规方法难以治疗的肿瘤疾病，已展现出广阔的应用前景。
IL-6是免疫调节网络系统的关键成分，许多活化的细胞高效表达IL-6，与靶细胞结合产生复杂的生物效应。在局部感染处，单核巨噬细胞、成纤维细胞和内皮细胞等分泌IL-6抗病毒，促进局部激活的T细胞增殖生长，诱导T细胞分化成熟为细胞毒性T细胞；增加活化B细胞抗体形成与分泌IgG、IgA和IgM；当IL-6释放进入循环后，能使静止的造血干细胞进入激活，促进血细胞的分裂增殖，促进肝脏急性期蛋白的合成，诱导或促进其他免疫细胞产生细胞因子，诱导体温升高，唤醒机体对抗感染的一系列防御性的生理应答。
由于细胞因子的作用具有多效性和网络性，细胞因子与靶细胞之间的关系复杂而独特，构成细胞因子调节网络，调节和控制着免疫应答的过程。一种细胞的活化常需多种细胞因子的协同作用；而多种细胞因子常具有某些相同或相似的生物学活性，利用不同细胞因子的组合可在功能上互相协同，相互促进。动物免疫系统的免疫应答水平、类型和抗感染免疫保护力的强弱和持续期主要由众多的细胞因子调节。目前大量实验限于单一细胞因子的免疫增强效果仍不够理想，单一细胞因子基因的表达和免疫调节活性较低，因此需用较大剂量的基因质粒，从而妨碍了免疫基因制剂的推广应用。如何提高免疫基因体细胞表达产物的免疫调节活性是在家畜传染性疾病防治中广泛应用免疫基因制剂的关键所在。
DNA Shuffling(DNA改组)是1994年由美国Affymax研究所Stemmer等发明的一种基于PCR的DNA突变、重组技术，是DNA分子的体外重组，是基因在分子水平上进行有性重组(sexual recombination)的新技术。它通过基因的有性重组，改变基因或基因家族原有核苷酸序列，不仅可以加速积累有益突变，而且可以使蛋白质两个或多个的优化性质合为一体，赋予表达产物以更好的生物学功能。同时突变后的基因在序列、结构、功能上均显著区别于原来基因，可以获得自主知识产权，故在生物工程的各个领域均已显示出具有巨大的应用潜力。
研究发现传统的提高真核基因表达效率的方法对增加白细胞介素活性的作用有限，除采用新的基因工程技术(如基因改组技术)改造白细胞介素基因以显著提高其表达产物的生物活性外，创制具有多功能的新型细胞因子基因，拓宽其免疫调节范围，这是当今寻求高效免疫增强剂的另一重要途径。因此，将多种细胞因子复合应用(包括多功能的融合细胞因子)，有可能获得高效特异的免疫调节效应，建立稳定持久和广泛的免疫抗感染保护力。而现代动物免疫学和传染病疫苗免疫预防中尚缺乏利用多种细胞因子调控免疫效应及其机理的深入研究。
本发明中，我们运用DNA改组技术，将来源于人、藏猪、牦牛和小鼠的白细胞介素-2基因家族进行了改组，构建了改组猪白细胞介素2基因真核表达质粒VRIL2S；设计合成了一新型CpGODN免疫刺激序列，将其插入含有猪白细胞介素-6的真核载体VPIL6中，构建了重组猪白细胞介素6基因与CpG寡聚核苷酸质粒VRIL6C。利用离子交联法制备壳聚糖纳米颗粒，包装改组猪白细胞介素2基因真核表达质粒VRIL2S和VRIL6C组合免疫猪，开展IL6-CpG融合基因、改组IL2基因体内协同表达、调节猪免疫机能和对疫苗的体液和细胞免疫应答的效应和机理研究，为深入研制高效免疫基因制剂，广泛提高动物抗感染水平奠定可靠基础，为开发应用具有我国自主知识产权的新型抗感染及免疫调节生物制剂开辟新途径。
发明内容
本发明所解决的技术问题具体包括白细胞介素-2的改组、改组猪白细胞介素2基因真核表达质粒VRIL2S的构建、重组猪白细胞介素6基因与CpG寡聚核苷酸质粒VRIL6C的构建、壳聚糖纳米颗粒对VRIL2S、VRIL6C重组真核质粒的分子包装及其增强动物免疫应答和免疫保护力的使用技术。该方法包括下列步骤1、IL-2基因的DNA改组DNA酶切猪、牦牛、小鼠和人IL2基因，分离回收50-100bp的核苷酸片断；经无引物和有引物两步PCR重新扩增IL2基因，分离纯化获得改组的IL2基因；构建重组基因库，筛选高活性的IL2改组基因阳性克隆，改组IL2基因(shuffled IL2，SIL2)连接入PGEX4T-1原核表达载体，转化感受态细菌，构建重组基因库；免疫印迹法筛选表达IL2的阳性转化子，PCR扩增和酶切鉴定阳性克隆基因。
2、改组猪白细胞介素2基因真核表达质粒的构建将改组IL2基因亚克隆入VR1020真核表达载体，转化、筛选阳性表达克隆，将构建的改组猪白细胞介素2基因真核表达质粒命名为VRIL2S。
3、CpG寡聚核苷酸序列及其引物的设计、合成CpGODN全序列5’>CGAGATCTAACGTTGTCGTCGACGTCGTCGTCAGGCCTGACGTTATCGATGGCGTTGTCGTCAACGTTGTCGTTAACGTTAGATCTCG<3’CpGODN序列引物P35’>CGAGATCTAACGTTGTC<3’P45’>CGAGATCTAACGTTAAC<34、重组猪白细胞介素6基因与CpG2寡聚核苷酸质粒及插入CpG1寡聚核苷酸的真核表达质粒的构建将扩增后CpGODN插入含有猪白细胞介素-6基因的真核载体VPIL6中，经Stu I酶切鉴定，该CpGODN序列已成功插入到VPIL6中，重组猪白细胞介素6基因与CpG寡聚核苷酸质粒命名为VRIL6C。
5、纳米颗粒的制备利用离子交联法，以分子量150000，脱乙酰度95％以上的壳聚糖制备纳米包装颗粒，将壳聚糖溶液(pH5.5)和VRIL2S+VRIL6C质粒组合、VR1020质粒(含适当浓度三聚磷酸盐)溶液50℃水浴分别恒温20min，然后均匀混合质粒溶液和壳聚糖溶液5min，即得质粒壳聚糖纳米颗粒样品液。
6、免疫用质粒DNA的大量制备接种含有重组真核表达质粒VRIL2S、VRIL6C、VR1020单菌落于含相应抗生素的LB培养基，37℃振摇过夜；离心后收集菌体；加入溶液I悬浮菌体，加入溶液II，翻转混合后，冰浴加入溶液III，翻转混合，冰浴；离心后转移上清至新的离心管，加入异丙醇，-20℃放置，离心去上清，Tris.Cl溶解DNA，加入亚精胺、异丙醇、70％乙醇纯化质粒，溶解于灭菌生理盐水，调节浓度为3pmol/μl。
7、质粒组合壳聚糖纳米颗粒抗感染制剂的应用选择3周龄小猪20只，随机分为2组，每组10只。采用肌肉注射法，每头质粒剂量0.5mg/头。所有猪按该常规免疫程序接种疫苗1周龄免疫接种蓝耳病疫苗；2周龄免疫接种伪狂犬疫苗。3周龄在免疫注射基因制剂时同时免疫接种猪瘟疫苗。
猪自免疫后第0，1，2，4，6，8周前腔静脉采血，分离血清，按照常规ELSA方法检测体液免疫反应(IgG、IgA、IgM及特异性抗体的含量)，SABC-ELISA检测了实验猪细胞免疫水平(血清IL2、IL4和IL6含量)，血球自动分析计数外周血淋巴细胞、单核细胞、中性粒细胞等免疫细胞数量)的变化情况。
结果发现以壳聚糖纳米颗粒包裹的改组猪白细胞介素2基因真核表达质粒VRIL2S和重组猪白细胞介素6基因与CpG寡聚核苷酸质粒VRIL6C组合，联合猪常规疫苗免疫猪，可以显著提高免疫猪的IgG、IgA、IgM含量，IL-2、IL-4、IL-6等细胞因子水平，免疫细胞数量与对照组差异显著(P＜0.05)，对疫苗的特异性抗体免疫应答也显著加强。壳聚糖纳米颗粒包裹质粒后，有效地防止了DNA被体内其它组织蛋白的吸附和体液核酸酶的降解，同时又促进质粒进入细胞，使质粒DNA缓慢释放，将目的基因DNA转运到靶细胞中，发挥基因转录表达，分泌更多的细胞因子，增强对免疫应答的上调效应，提高体液和细胞免疫水平。这些结果表明壳聚糖纳米颗粒包裹改组猪白细胞介素2基因真核表达质粒VRIL2S和重组猪白细胞介素6基因与CpG寡聚核苷酸质粒VRIL6C组合能显著提高疫苗免疫猪只的免疫应答水平，可作为有效的新型抗感染免疫调节剂，在增强猪对疫苗体液和细胞免疫应答、提高免疫保护水平和抗病力等方面具有广泛的重要应用前景。
图1 IL2基因家族改组结果1Marker2无引物PCR3有引物PCR图2 改组的TPIL-2酶切电泳图1DL20002pGTPIL-2/BamHI+EcoRI双酶切3pGTPIL-2图3 VRIL2S质粒PCR电泳图1DL2,0002VRIL2S质粒PCR图4 重组质粒VP6C的酶切图谱1marker(Lambda EcoRI/HindIII)2VRIL6C质粒3VRIL6C质粒用stuI单酶切图5 免疫猪血清中IgG含量图6 免疫猪血清中IgA含量图7 免疫猪血清中IgM含量图8 免疫猪血清中猪瘟特异性抗体含量图9 免疫组猪血清中猪蓝耳病特异性抗体含量图10 免疫猪血清中IL-2含量图11 免疫猪血清中IL-4含量图12 免疫猪血清中IL-6含量图13 免疫猪白细胞数量变化图14 免疫猪单核细胞数量变化图15 免疫猪淋巴细胞数量变化图16 免疫猪中性粒细胞数量变化
具体实施例方式
1、IL-2基因的DNA改组将克隆得到的猪、牦牛、小鼠和人IL2基因进行DNA酶切，分离回收50-100bp的核苷酸片断；经无引物和有引物两步PCR重新扩增IL2基因，分离纯化获得改组的IL2基因；改组PCR后的片段进行2.0％琼脂糖凝胶电泳，琼脂糖凝胶小分子DNA抽提试剂盒回收500bp的改组片段。然后将此DNA片段用BamHI/EcoRI进行酶切，与脱脱磷酸化、BamHI/EcoRI双酶切的pGEX 4T-1载体在T4DNA连接酶作用下16℃水浴过夜。连接产物转化E.coli DH5α感受态细胞，构建重组质粒，酶切鉴定阳性克隆基因。
结果见说明书附图1、2。图1显示DNaseI消化后获得的50-100bp左右的随机片段，经55个循环的无引物PCR后，这些小片段拼接为许多大小不一的改组分子，经电泳检测为主要集中在100-250bp左右的模糊条带(第二泳道)，是PCR重组配对的结果。无引物PCR的产物再经过30个循环的有引物PCR，与原模板大小相同的IL-2改组分子(约500bp)被富集(第三泳道)，电泳结果显示在500bp处出现一特异条带。图2显示将初步筛选的阳性菌落，接种于3ml含Amp的LB培养液中，37℃震荡过夜，用碱裂解法提取出所有菌落的质粒，然后用BamHI/EcoRI进行酶切，发现大部分切出小片段，大小约500bp左右。
2、改组猪白细胞介素2基因真核表达质粒的构建改组的IL-2基因亚克隆到VR1020载体，PCR反应和酶切反应鉴定重组子，构建改组猪白细胞介素2基因真核表达质粒，命名为VRIL2S。结果见附图3。重组子VRIL2S的质粒PCR的结果显示，所构建的重组子已成功插入了改组的IL-2基因。
3、CpG寡聚核苷酸序列及其引物的设计、合成CpGODN全序列5’>CGAGATCTAACGTTGTCGTCGACGTCGTCGTCAGGCCTGACGTTATCGATGGCGTTGTCGTCAACGTTGTCGTTAACGTTAGATCTCG<3’CpGODN2序列引物P35’>CGAGATCTAACGTTGTC<3’P45’>CGAGATCTAACGTTAAC<34、免疫用CpG寡聚核苷酸制备以合成的CpG序列为模版，利用PCR(多聚酶连链式反应)扩增，扩增产物溶解于灭菌生理盐水，用紫外分光光度计测其浓度。
5、重组猪白细胞介素6基因与CpG寡聚核苷酸质粒的构建将含CpGODN的重组质粒用BglII酶切后与VPIL6质粒BglII酶切、脱磷酸化的DNA在T4 DNA连接酶作用下进行连接反应。连接产物转化DH5α感受态细胞，转化子经酶切Stu I鉴定，得到含有目的CpG片段的重组质粒，将重组猪白细胞介素6基因与CpG2寡聚核苷酸质粒命名为VRIL6C。
结果见说明书附图4。图4显示VPIL6质粒没有Stu I酶切位点，而CpGODN有Stu I酶切位点，重组质粒被Stu I酶切成一条带，说明重组猪白细胞介素6基因与CpG寡聚核苷酸质粒已构建成功。
6、纳米颗粒的制备以分子量150000，脱乙酰度95％以上的壳聚糖分散在1％醋酸溶液中(A液)；分别将VR1020、VRIL2S+VRIL6C质粒溶解于三聚磷酸盐溶液(B液)。将A液、B液置于50℃水浴分别恒温20min，将DNA溶液按一定比例(氨基摩尔数与DNA的磷酸酯基摩尔数比)加入壳聚糖溶液，磁力搅拌使其充分混合，静置过滤得到粒径40-60nm的复合物微粒，即是各质粒壳聚糖纳米颗粒样品液。
7、实验动物的免疫选择3周龄小猪20只，随机分为2组，每组10只。采用肌肉注射法，每头质粒剂量0.5mg/头。所有猪按该养猪场常规免疫程序接种疫苗1周龄免疫接种蓝耳病疫苗；2周龄免疫接种伪狂犬疫苗。3周龄在免疫注射基因制剂时同时免疫接种猪瘟疫苗。
动物免疫分组见说明书表1。
表1免 疫猪分组
注CNP壳聚糖纳米颗粒8、壳聚糖纳米颗粒包装VR1C+VRIL6C质粒组合对猪特异性免疫应答的影响猪自免疫后第0，1，2，4，6，8周前腔静脉采血，分离血清，用以检测各项免疫指标。
(1)IgG、IgA及IgM的测定含量实验猪血清分别作105(IgG)和104(IgM、IgA)稀释包被Costar酶标板，用特异性的兔抗猪IgG、IgM和IgA重链抗体(美国Bethyl公司生产)作一抗，酶标羊抗兔IgG为二抗(华美生物工程公司)，TMB(四甲基联苯胺)为底物，测定猪血清中IgG、IgM和IgA含量。
结果见说明书附图5、图6、图7。图5、6、7显示了壳聚糖纳米颗粒包裹改组猪白细胞介素2基因真核表达质粒与重组猪白细胞介素6基因-CpG寡聚核苷酸质粒组合与猪瘟疫苗、猪蓝耳病疫苗联合免疫猪后，猪只血清中免疫球蛋白的变化情况。结果表明在同时免疫了改组猪白细胞介素2基因真核表达质粒与重组猪白细胞介素6基因-CpG寡聚核苷酸质粒组合后，猪的IgG、IgA、IgM含量比对照组有显著提高(P＜0.05)。
(2)特异性抗体的测定间接ELISA法。用猪瘟抗原、猪蓝耳病抗原包被Costar酶标板，实验猪血清100倍稀释为一抗，TMB(四甲基联苯胺)为底物，测定猪血清中猪瘟、猪蓝耳病特异性抗体含量。
结果见说明书附图8、9。图8、9显示了猪瘟疫苗、猪蓝耳病疫苗与VRIL2S+VRIL6C质粒组合联合免疫动物后猪只特异性抗体变化情况。结果显示动物在免疫一周后，就检测到特异性抗体的产生；在同时免疫VRIL2S+VRIL6C质粒组合后，实验猪只的上述特异性抗体比对照组显著提高(P＜0.05)。
(3)细胞因子的检测实验猪血清100倍稀释包被Costar酶标板，兔抗猪IL2、IL4、IL6 IgG抗体(武汉博士德生物工程公司提供)为一抗，TMB(四甲基联苯胺)为底物，SABC法检测血清中IL2、IL4及IL6含量，观测猪细胞免疫应答情况。
结果见说明书附图10、11、12。图结果显示壳聚糖纳米颗粒包裹VRIL2S+VRIL6C质粒组合与猪瘟疫苗、猪蓝耳病疫苗联合免疫猪后，猪只血清中IL-2、IL-4和IL-6的含量较对照组高，差异显著(P＜0.05)。
(4)免疫猪外周血免疫细胞数量的动态变化常规法血球自动计数仪分类计数中性粒细胞、单核细胞核、淋巴细胞。
结果见说明书附图13、14、15、16。用猪瘟疫苗、猪蓝耳病疫苗联合壳聚糖纳米颗粒包裹VRIL2S+VRIL6C质粒组合免疫猪，猪外周血免疫细胞数量的变化情况结果同样发现肌肉注射VRIL2S+VRIL6C质粒组合对猪只外周血免疫细胞有较好的提升能力。
8、数据分析上述各种数据均用方差分析进行差异显著性比较，以P＜0.05为差异显著性标准。
权利要求
1.新型猪白细胞介素2和6基因表达质粒抗感染制剂的应用技术，其特点包括白细胞介素-2基因的改组、改组猪白细胞介素2基因真核表达质粒VRIL2S的构建，重组猪白细胞介素6基因与CpG寡聚核苷酸质粒(VRIL6C)的构建，壳聚糖纳米颗粒对VRIL2S+VRIL6C质粒组合进行分子包装制备基因纳米颗粒制剂，并将此基因制剂应用于增强猪机体免疫应答及抗感染免疫力的使用技术。
2.根据权利要求1所述的新型猪白细胞介素2和6基因表达质粒抗感染制剂的制备，其特征在于所述的基因制剂的主题成分是改组猪白细胞介素2基因真核表达质粒VRIL2S和猪白细胞介素6基因与CpG寡聚核苷酸重组质粒VRIL6C质粒组合。
3.根据权利要求1所述的新型猪白细胞介素2和6基因表达质粒抗感染制剂的制备，其特征在于所述的基因制剂的包裹材料是分子量为150000，脱乙酰度95％以上的壳聚糖，用离子交联法制备壳聚糖纳米颗粒分子。
4.使用权利要求1要求的壳聚糖纳米颗粒包装改组猪白细胞介素2基因真核表达质粒与重组猪白细胞介素6基因-CpG寡聚核苷酸质粒组合作为猪新型抗感染分子免疫调节剂的使用技术，其特征在于以制备的壳聚糖纳米颗粒包装改组猪白细胞介素2基因真核表达质粒与重组猪白细胞介素6基因-CpG寡聚核苷酸质粒组合联合疫苗(猪瘟疫苗、猪蓝耳病疫苗、伪狂犬病疫苗)免疫猪，以壳聚糖纳米颗粒包装VR1020空质粒为对照，检测了壳聚糖包装VRIL2S+VRIL6C质粒组合对猪的体液免疫(IgG、IgA及IgM的含量、特异性抗体的测定)和细胞免疫水平(细胞因子和外周血免疫细胞数量)的影响情况，结果表明壳聚糖酸纳米颗粒包裹改组猪白细胞介素2基因真核表达质粒与重组猪白细胞介素6基因-CpG寡聚核苷酸质粒组合可显著增强实验猪对疫苗的细胞免疫和体液免疫应答反应，提高特异免疫水平，增进疫苗接种动物的免疫保护力。
全文摘要
本发明改组了白细胞介素－2基因，构建了改组猪白细胞介素2基因真核表达质粒VRIL2S，构建了猪白细胞介素6基因与CpG寡聚核苷酸重组真核质粒VRIL6C，以分子量为150000、脱乙酰度95％以上的壳聚糖制备了壳聚糖纳米颗粒，提供了利用壳聚糖纳米颗粒对VRIL2S+VRIL6C质粒组合进行分子包装制备基因纳米颗粒制剂的方法，公开了该纳米颗粒基因制剂作为新型抗感染分子免疫增强剂的应用技术。该方法包括壳聚糖纳米颗粒包装VRIL2S+VRIL6C质粒组合，将此制备纳米颗粒基因制剂以肌肉注射方式协同疫苗免疫猪，增强猪特异细胞和体液免疫机能，提供了壳聚糖纳米颗粒包装VRIL2S+VRIL6C质粒组合作为新型动物抗感染分子免疫增强剂的应用技术。
文档编号A61K9/16GK1954886SQ20051002195
公开日2007年5月2日 申请日期2005年10月28日 优先权日2005年10月28日
发明者高荣, 武梅, 王泽州, 李江凌, 吕学斌, 谢曌, 王颖玉, 赵钟钟, 陈茜, 吴凯源 申请人:四川大学