专利名称：猪白细胞介素6基因与CpG分子融合抗感染免疫制剂的制备及应用的制作方法
技术领域：
1.生物技术 2.分子免疫学背景技术CpG ODN是指含有CpG基序(以非甲基化胞嘧啶鸟嘌呤为基元构成的特定核苷酸序列结构)的寡聚核苷酸序列。研究表明，CpG ODN对天然和获得性免疫系统具有广泛的刺激作用，是全谱非特异性免疫增强剂。CpG ODN作为佐剂，可明显促进Th1型免疫应答的产生。其与不完全弗氏佐剂(IFA)联合应用时，免疫调节效应甚至强于完全弗氏佐剂(CFA)。即使与Th2型佐剂如氢氧化铝合用亦可明显促进免疫应答的产生，且Th1型应答明显强于Th2型应答。CpG ODN能直接激活B细胞、树突状细胞、巨噬细胞、抗原提呈细胞等，间接激活T细胞、NK细胞，诱导以Th1型为主的免疫应答，是一种高效低毒的免疫佐剂。CpG ODN在基因疫苗、免疫缺陷性疾病、肿瘤、感染性疾病及过敏性疾病的治疗中有着强大的潜在应用价值。
IL-6是迄今发现的功能最为广泛的细胞因子之一，它可以促进多种细胞的增殖和分化。IL-6可由各种淋巴细胞和非淋巴细胞所产生，其产生可对各种刺激应答。成纤维细胞、单核细胞、某些T细胞系等都可以产生IL-6。特别由于T细胞在表位DNA疫苗、T细胞疫苗及常规疫苗所引起的特异性免疫反应中起关键作用，应用IL-6基因作为免疫增强剂有重要的理论和应用价值。
CpG寡聚核苷酸一般通过PCR扩增得到，还需纯化使用，大规模应用时成本偏高。为了降低成本以便生产应用，进一步探讨免疫刺激序列CpG寡聚核苷酸插入质粒应用的效果以及免疫刺激序列CpG-ODN与细胞因子之间是否存在协同作用，本研究设计了两条新型CpG ODN，应用PCR技术扩增后，将其中一条CpG ODN1导入真核载体VR1012中，构建了CpG1寡聚核苷酸的重组真核表达质粒VR1C；将另一条CpG ODN2导入含有猪白细胞介素-6的真核载体VPIL6中，构建了重组猪白细胞介素6基因与CpG2寡聚核苷酸质粒VR6C。
壳聚糖是天然生物多糖甲壳质的脱乙酰基衍生物，具有很好的生物相容性、可被体内多种酶类降解、降解产物安全无毒，并能被生物体完全吸收；而且由于其具有独特的聚阳离子特性，已有的研究结果显示它是一种具有很大潜力的缓释材料。近年来，在基因转染表达研究领域已出现了基于壳聚糖的纳米颗粒系统。大量研究表明，壳聚糖可包裹浓缩DNA，形成小的分散颗粒，将壳聚糖DNA复合物用于基因运载和转染表达时，能有效携带目的基因进入靶细胞中。包封于壳聚糖颗粒中的物质，其释放率主要决定于壳聚糖的生物降解和溶蚀，因此物质释放明显延长。初步研究结果发现基于壳聚糖的颗粒系统在生物医学方面具有广阔的应用前景。
由于壳聚糖纳米颗粒良好的生物相容性使其在DNA制剂的包裹应用中显示了广阔的前景，本发明首次将壳聚糖纳米颗粒包裹的重组猪白细胞介素6基因与CpG2寡聚核苷酸质粒VR6C和插入CpG1寡聚核苷酸的真核表达质粒VR1C组合免疫猪，并以壳聚糖纳米颗粒包裹的空质粒载体为对照，观察了重组质粒组合对猪的免疫应答的调节效应，探讨猪IL-6基因、CpG寡聚核苷酸及其不同组合对猪免疫机能效应的影响，为研制高效安全、效应持久的新型免疫增强剂奠定初步基础，为应用新技术防治疾病提供依据。
发明内容
本发明所解决的技术问题具体包括重组猪白细胞介素6基因与CpG2寡聚核苷酸质粒VR6C的构建、插入CpG1寡聚核苷酸的真核表达质粒VR1C的构建，壳聚糖纳米颗粒对VR1C+VR6C重组真核质粒的分子包装及其增强动物免疫应答和免疫保护力的应用技术。该方法包括下列步骤1、CpG寡聚核苷酸序列及其引物的设计、合成CpGODN1全序列5’>CGCTGCAGAACGTTGTCGTCAACGTTGTCGTCAAGCTTGACGTTATCGATGGCGTTGACGTTGACGTCATCGATGTCGTTCTGCAGCG<3’CpGODN1序列引物P15’>CGCTGCAGAACGTTGTC<3’P25’>CGCTGCAGAACGACATCG<3’CpGODN2全序列5’>CGAGATCTAACGTTGTCGTCGACGTCGTCGTCAGGCCTGACGTTATCGATGGCGTTGTCGTCAACGTTGTCGTTAACGTTAGATCTCG<3’CpGODN2序列引物P35’>CGAGATCTAACGTTGTC<3’P45’>CGAGATCTAACGTTAAC<32、免疫用CpG寡聚核苷酸制备以合成的CpG序列为模版，利用PCR(多聚酶连链式反应)扩增，扩增产物溶解于灭菌生理盐水，用紫外分光光度计测其浓度。
3、重组猪白细胞介素6基因与CpG2寡聚核苷酸质粒及插入CpG1寡聚核苷酸的真核表达质粒的构建将扩增后CpGODN1导入真核载体VR1012中，经HindIII酶切鉴定，该CpGODN1序列已成功插入到VR1012中，插入CpG1寡聚核苷酸的真核表达质粒命名为VR1C。将扩增后CpGODN2导入含有猪白细胞介素-6基因的真核载体VPIL6中，经Stu I酶切鉴定，该CpGODN2序列已成功插入到VPIL6中，重组猪白细胞介素6基因与CpG2寡聚核苷酸质粒命名为VR6C。
4、纳米粒的制备利用离子交联法，以分子量150000，脱乙酰度95％以上的壳聚糖制备纳米包装颗粒，将壳聚糖溶液(pH5.5)和VR1C+VR6C质粒组合、VR1020质粒(含适当浓度三聚磷酸盐)溶液50℃水浴分别恒温20min，然后均匀混合质粒溶液和壳聚糖溶液5min，即得质粒壳聚糖纳米颗粒样品液。
5、免疫用质粒DNA的大量制备接种含有重组真核表达质粒VR1C、VR6C单菌落于含相应抗生素的LB培养基，37℃振摇过夜；离心后收集菌体；加入溶液I悬浮菌体，加入溶液II，翻转混合后，冰浴加入溶液III，翻转混合，冰浴；离心后转移上清至新的离心管，加入异丙醇，-20℃放置，离心去上清，Tris.Cl溶解DNA，加入亚精胺、异丙醇、70％乙醇纯化质粒，溶解于灭菌生理盐水，调节浓度为3pmol/μl。
6、质粒组合壳聚糖纳米颗粒抗感染制剂的应用选择3周龄小猪20只，随机分为2组，每组10只。采用肌肉注射法，每头质粒剂量0.5mg/头，一组免疫壳聚糖纳米颗粒包裹VRlC+VR6C质粒组合，另一组为对照组，免疫壳聚糖纳米颗粒包裹VR1020空载体。所有猪按该养猪场常规免疫程序接种疫苗1周龄免疫接种蓝耳病疫苗；2周龄免疫接种伪狂犬病疫苗。3周龄在免疫注射基因制剂时同时免疫接种猪瘟疫苗。
猪自免疫后第0，1，2，4，6，8周前腔静脉采血，分离血清，用以检测体液免疫反应。酶联免疫检测技术按照常规ELSA方法。
检测了各组猪只的体液免疫(IgG、IgA及IgM的含量、特异性抗体的测定)和细胞免疫水平(细胞因子和外周血免疫细胞数量)的影响情况，并对不同形式的质粒作用下细胞免疫和体液免疫应答的变化，进行了较为系统地分析。
结果发现以壳聚糖纳米颗粒包裹重组猪白细胞介素6基因与CpG2寡聚核苷酸质粒VR6C和插入CpG1寡聚核苷酸的真核表达质粒VR1C组合作为免疫增强剂时，与猪瘟疫苗、猪蓝耳病疫苗联合使用，猪只的IgG、IgA、IgM含量和血清IL-2、IL-4、IL-6等细胞因子水平比对照组显著升高；同时，淋巴细胞、单核细胞、中性粒细胞等免疫细胞数量也明显增加；对疫苗的特异性免疫应答也显著加强。
这些结果表明壳聚糖纳米颗粒包装重组猪白细胞介素6基因与CpG2寡聚核苷酸质粒VR6C和插入CpG1寡聚核苷酸的真核表达质粒VR1C组合能显著提高猪只的免疫应答水平，提高机体细胞免疫和体液免疫水平，增强免疫应答及免疫保护力，可望作为有效的新型畜用抗感染免疫调节剂，具有潜在的广泛应用前景。
图1 VR1C转化子质粒HindIII酶切电泳图谱1λDNA EcoRI/HindIII双酶切Marker2重组子质粒3重组子质粒HindIII酶切图2 VR1C转化子质粒Pst I酶切电泳图谱1重组子质粒2重组子质粒Pst I酶切3DL2000 Marker图3 重组质粒VP6C的酶切图谱1marker(Lambda EcoR I/HindIII)2VR6C质粒3VR6C质粒用stuI单酶切图4 免疫猪血清中IgG含量图5 免疫猪血清中IgA含量图6 免疫猪血清中IgM含量图7 免疫猪血清中猪瘟特异性抗体含量图8 免疫组猪血清中猪蓝耳病特异性抗体含量图9 免疫猪血清中IL-2含量图10 免疫猪血清中IL-4含量图11 免疫猪血清中IL-6含量图12 免疫猪白细胞数量变化图13 免疫猪单核细胞数量变化图14 免疫猪淋巴细胞数量变化图15 免疫猪中性粒细胞数量变化具体实施方式
1、CpG寡聚核苷酸序列及其引物的设计、合成CpGODN1全序列5’>CGCTGCAGAACGTTGTCGTCAACGTTGTCGTCAAGCTTGACGTTATCGATGGCGTTGACGTTGACGTCATCGATGTCGTTCTGCAGCG<3’CpGODN1序列引物P15’>CGCTGCAGAACGTTGTC<3’P25’>CGCTGCAGAACGACATCG<3’CpGODN2全序列5’>CGAGATCTAACGTTGTCGTCGACGTCGTCGTCAGGCCTGACGTTATCGATGGCGTTGTCGTCAACGTTGTCGTTAACGTTAGATCTCG<3’CpGODN2序列引物P35’>CGAGATCTAACGTTGTC<3’P45’>CGAGATCTAACGTTAAC<32、免疫用CpG寡聚核苷酸制备以合成的CpG序列为模版，利用PCR(多聚酶连链式反应)扩增，扩增产物溶解于灭菌生理盐水，用紫外分光光度计测其浓度。
3、重组猪白细胞介素6基因与CpG2寡聚核苷酸质粒及插入CpG1寡聚核苷酸的真核表达质粒的构建将扩增后CpGODN1与经Pst I酶切的真核载体VR1012连接、转化，经HindIII、PstI酶切鉴定筛选重组质粒，将插入CpG1寡聚核苷酸的真核表达质粒命名为VR1C。将含CpGODN2的重组质粒用BglII酶切后与VPIL6质粒BglII酶切、脱磷酸化的DNA在T4 DNA连接酶作用下进行连接反应。连接产物转化DH5α感受态细胞，转化子经酶切Stu I鉴定，得到含有目的CpG2片段的重组质粒，将重组猪白细胞介素6基因与CpG2寡聚核苷酸质粒命名为VR6C。
结果见说明书附图1、2、3。图1显示在卡那平板上挑取单菌落，接菌培养提取质粒后用HindIII酶切，电泳结果显示重组子质粒被切成两条2000多bp的条带，与预期相符。图2显示用Pst I酶切重组质粒，切出一小片段，通过与DL2000Marker对比，略小于100bp，与CpGODN1大小相符，从而说明CpG1片段已被正确连接到载体VR1012上。图3显示VPIL6质粒没有Stu I酶切位点，而CpGODN2有Stu I酶切位点，重组质粒被Stu I酶切成一条带，说明重组猪白细胞介素6基因与CpG2寡聚核苷酸质粒已构建成功。
4、纳米颗粒的制备以分子量150000，脱乙酰度95％以上的壳聚糖分散在1％醋酸溶液中(A液)；分别将VR1C、VR6C、VR1C+VR6C质粒溶解于三聚磷酸盐溶液(B液)。将A液、B液置于50℃水浴分别恒温20min，将DNA溶液按一定比例(氨基摩尔数与DNA的磷酸酯基摩尔数比)加入壳聚糖溶液，磁力搅拌使其充分混合，静置过滤得到粒径40-60nm的复合物微粒，即为质粒壳聚糖纳米颗粒样品液。
6、实验动物的免疫选择3周龄小猪20只，随机分为2组，每组10只。采用肌肉注射法，每头质粒剂量0.5mg/头，一组免疫壳聚糖纳米颗粒包裹VR1C+VR6C质粒组合，另一组为对照组，免疫壳聚糖纳米颗粒包裹VR1020空载体。所有猪按该养猪场常规免疫程序接种疫苗1周龄免疫接种蓝耳病疫苗；2周龄免疫接种伪狂犬疫苗。3周龄在免疫注射基因制剂时同时免疫接种猪瘟疫苗。
动物免疫分组见说明书表1。
表1 免疫猪分组
注CNP壳聚糖纳米颗粒7、壳聚糖纳米颗粒包装VR1C+VR6C质粒组合对猪特异性免疫应答的影响猪自免疫后第0，1，2，4，6，8周前腔静脉采血，分离血清，用以检测各项免疫指标。
(1)IgG、IgA及IgM的测定含量实验猪血清分别作105(IgG)和104(IgM、IgA)稀释包被Costar酶标板，用特异性的兔抗猪IgG、IgM和IgA重链抗体(美国Bethyl公司生产)作一抗，酶标羊抗兔IgG为二抗(华美生物工程公司)，TMB(四甲基联苯胺)为底物，测定猪血清中IgG、IgM和IgA含量。
结果见说明书附图4、5、6。从图中可见，猪只在注射壳聚糖纳米颗粒包装的重组猪白细胞介素6基因与CpG2寡聚核苷酸质粒VR6C和插入CpGl寡聚核苷酸的真核表达质粒VR1C组合后，其血清中IgG、IgA、IgM含量比对照组有显著增高。
(2)特异性抗体的测定间接ELISA法。用猪瘟抗原、猪蓝耳病抗原包被Costar酶标板，实验猪血清100倍稀释为一抗，TMB(四甲基联苯胺)为底物，测定猪血清中猪瘟、猪蓝耳病特异性抗体含量。
结果见说明书附图7、8。图7、8显示了猪瘟疫苗、猪蓝耳病疫苗与相应VR6C和VR1C组合联合免疫动物后猪只特异性抗体变化情况。结果显示动物在免疫一周后，就检测到特异性抗体的产生，免疫组猪特异性抗体含量比对照组显著提高(P＜0.05)。
(3)细胞因子的检测实验猪血清100倍稀释包被Costar酶标板，兔抗猪IL2、IL4、IL6 IgG抗体(武汉博士德生物工程公司提供)为一抗，TMB(四甲基联苯胺)为底物，SABC法检测血清中IL2、IL4及IL6含量，观测猪细胞免疫应答情况。
结果见说明书附图9、10、11。由图可知，VR6C和VR1C组合免疫猪血清中IL-2、IL-4和IL-6的含量均较对照组明显升高(P＜0.05)。
(4)免疫猪外周血免疫细胞数量的动态变化血球自动分类计数仪分类计数中性粒细胞、单核细胞核、淋巴细胞。
结果见说明书附图12、13、14、15。免疫猪外周血免疫细胞数量的动态变化是考察猪只细胞免疫应答的一个重要指标。结果显示壳聚糖纳米颗粒包装重组猪白细胞介素6基因与CpG2寡聚核苷酸质粒VR6C和插入CpG1寡聚核苷酸的真核表达质粒VR1C组合免疫猪后，免疫猪只外周血白细胞、单核细胞、中性粒细胞、淋巴细胞数量较对照组都有显著增加。
8、数据分析上述各种数据均用方差分析进行差异显著性比较，以P＜0.05为差异显著性标准。
权利要求
1.猪白细胞介素6基因与CpG分子融合抗感染免疫制剂的制备及应用，其特点包括重组猪白细胞介素6基因与CpG2寡聚核苷酸质粒VR6C的构建、插入CpG1寡聚核苷酸的真核表达质粒VR1C的构建，壳聚糖纳米颗粒对VR1C+VR6C质粒组合进行分子包装制备基因纳米颗粒制剂，并将此基因制剂应用于增强猪机体免疫应答及抗感染免疫力的应用技术。
2.根据权利要求1所述的猪白细胞介素6基因与CpG分子融合抗感染免疫制剂的制备，其特征在于所述的免疫制剂包括猪白细胞介素6基因与CpG2寡聚核苷酸重组质粒VR6C和插入CpG1寡聚核苷酸的真核表达质粒VR1C组合。
3.根据权利要求1所述的猪白细胞介素6基因与CpG分子融合抗感染免疫制剂的制备，其特征在于所述的免疫制剂的包裹材料是分子量为150000，脱乙酰度95％以上的壳聚糖，用离子交联法制备的壳聚糖纳米颗粒分子。
4.使用权利要求1要求的猪白细胞介素6基因与CpG分子融合抗感染免疫制剂作为猪用新型抗感染分子免疫调节剂的应用技术，其特征在于以下两方面a)将制备的重组猪白细胞介素6基因与CpG2寡聚核苷酸质粒和插入CpG1寡聚核苷酸的真核表达质粒组合纳米颗粒以肌肉注射的投递方式免疫猪只，以壳聚糖纳米颗粒包装VR1020空质粒为对照，检测了壳聚糖包装VR1C+VR6C质粒组合对猪的体液免疫(IgG、IgA及IgM的含量、特异性抗体的测定)和细胞免疫水平(细胞因子和外周血免疫细胞数量)的影响情况，进行了较为系统地分析；b)以制备的壳聚糖VR1C+VR6C质粒组合纳米颗粒联合疫苗(猪瘟疫苗、猪蓝耳病疫苗)共免疫实验动物，结果表明壳聚糖VR1C+VR6C质粒组合纳米颗粒可显著增强猪对疫苗的细胞免疫和体液免疫应答反应，增强免疫保护水平。
全文摘要
本发明构建了猪白细胞介素6基因与CpG2寡聚核苷酸重组质粒VR6C，构建了插入CpG1寡聚核苷酸的真核表达质粒VR1C，以分子量为150000、脱乙酰度95％以上的壳聚糖制备了壳聚糖纳米颗粒，提供了利用壳聚糖纳米颗粒对VR1C+VR6C质粒组合进行分子包装制备纳米颗粒免疫制剂的方法，公开了该纳米颗粒免疫制剂作为新型抗感染分子免疫增强剂的应用技术。该方法包括壳聚糖纳米颗粒包装VR1C+VR6C质粒组合，将此制备纳米颗粒免疫制剂以肌肉注射方式协同疫苗免疫猪，增强猪特异细胞和体液免疫机能，提供了壳聚糖纳米颗粒包装VR1C+VRIL6C质粒组合作为新型融合抗感染免疫制剂的应用技术。
文档编号A61P37/00GK1954884SQ20051002195
公开日2007年5月2日 申请日期2005年10月28日 优先权日2005年10月28日
发明者武梅, 高荣, 李江凌, 王泽州, 吕学斌, 吴凯源, 谢曌, 王颖玉, 赵钟钟, 陈茜 申请人:四川大学