用于癌症治疗和诊断的靶基因syngr4的制作方法

专利名称：用于癌症治疗和诊断的靶基因syngr4的制作方法
技术领域：
对相关申请的交叉引用 本申请要求2008年8月27日提交的美国临时申请No. 61/190，358的权益，通过述及在此将其完整公开内容并入本文。
技术领域 本发明涉及生物科学领域，更具体地，涉及癌症研究、癌症诊断和癌症治疗领域。 特别地，本发明涉及用于检测和诊断肺癌的方法以及用于治疗和预防肺癌的方法。此外，本发明涉及用于筛选用于治疗和/或预防肺癌的药剂的方法。
背景技术：
肺癌是最常见的癌症之一，而且是世界上癌症死亡的一个首要原因(NPL 1 Shibuya K et al.，BMC Cancer 2002,2 :37)。尽管使用与各种辅助治疗模态(诸如放疗和化疗)组合的现代手术技术，肺癌患者的总体5年存活率仍然保持于约20% (NPL 2 Naruke T, et al. ,Ann Thorac Surg 2001,71(6) :1759-64)。最近开发的分子靶向药物诸如吉非替尼(gefitinib)和贝伐单抗(bevacizumab)提供了希望，但是已有报告致命的不利事件，诸如吉非替尼所致的间质性肺炎或贝伐单抗所致的严重出血。因此，迫切需要开发靶向癌症特异性分子且没有不利副作用的新药剂(NPL 3 =Ranson M, et al. ,J Clin Oncol 2002,20 :2240-50 ；NPL 4 Inoue A，et al.,Lancet 2003,361 :137-9 ；NPL 5 Johnson DH, et al. , J Clin Oncol 2004，22 :2184-91)。癌抗原，包括一些具有致癌功能的癌症-睾丸抗原，是理想的治疗靶。癌症-睾丸抗原定义为如下的蛋白质，它们在癌细胞中高度表达， 但是在除生殖组织，诸如睾丸、卵巢、和胎盘中的细胞以外的正常细胞中不表达。因为来自这些组织的细胞不表达I类MHC分子，所以癌症-睾丸抗原还被认为是免疫疗法，诸如癌症疫苗的有前途的靴(NPL 6 =Daigo Y, et al.，Gen Thorac Cardiovasc Surg 2008,56 43-53)。
使用cDNA微阵列技术来系统分析数以千计的基因的表达水平是用于鉴定涉及致癌作用途径的分子或对抗癌疗法有功效的分子的一种有效办法；某些这样的基因或它们的基因产物可能是用于开发新疗法的较好靶分子和/或癌症生物标志物。先前，对101份临床肺癌样品实施了基因组范围表达谱分析，偶联通过激光显微解剖来富集肿瘤细胞，然后与31种正常人组织⑶种成人和4种胎儿器官)的表达谱数据比较(NPL 6 =Daigo Y，et al. , Gen Thorac Cardiovasc Surg 2008,56:43_53 ；NPL 7 :Kikuchi Τ, et al. , Oncogene 2003,22 :2192-205 ；NPL 8 =Kakiuchi S, et al.，Mol Cancer Res 2003,1 :485-99 ；NPL 9 Kakiuchi S，et al.，Hum Mol Genet 2004,13 :3029-43 ；NPL 10 =Kikuchi T，et al.，Int J Oncol 2006,28 :799-805 ；NPL 11 Taniwaki Μ, et al.，Int J Oncol 2006,29 :567-75)。
在本发明中，通过对临床肺癌材料的肿瘤-组织微阵列分析与RNA干扰技术的组合，建立了一种筛选系统(NPL 12 =Suzuki C, et al.，Cancer Res 2003,63 :7038-41 ； NPL 13 Jshikawa N, et al. , Clin Cancer Res 2004,10 :8363-70 ；NPL 14 =Kato T, etal. , Cancer Res 2005,65 :5638-46 ；NPL 15 Furukawa C, et al., Cancer Res 2005,65 7102-10 ；NPL 16 Jshikawa N, et al. , Cancer Res 2005,65 :9176-84；NPL 17 =Suzuki C, et al. , Cancer Res 2005,65 :11314-25 ；NPL 18 Ishikawa N, et al. , Cancer Sci 2006,97 :737-45 ；NPL 19 =Takahashi K, et al.，Cancer Res 2006,66 :9408-19 ；NPL 20 Hayama S,et al. , Cancer Res 2006,66 10339-48 ；NPL 21 :Kato Τ,et al. , Clin Cancer Res 2007，13 :434-42 ;NPL 22 =Suzuki C, et al. , Mol Cancer Ther 2007，6 :542-51 ; NPL 23 =Yamabuki T, et al.，Cancer Res 2007,67 :2517-25 ；NPL 24 =Hayama S, et al.， Cancer Res 2007,67 :4113-22 ；NPL 25 =Kato Τ, et al.，Cancer Res 2007,67 :8544-53 ； NPL 26 =Taniwaki Μ, et al. ， Clin Cancer Res 2007,13 :6624-31 ；NPL 27 Jshikawa N, et al.，Cancer Res 2007,67 :11601-11 ；NPL 28=Mano Y, et al.，Cancer Sci 2007,98 1902-13 ；NPL 29 =Suda Τ, et al. , Cancer Sci 2007,98 :1803-8 ；NPL 30=Kato Τ, et al.， Clin Cancer Res 2008,14 :2363-70 ；NPL 31 =Mizukami Y, et al.，Cancer Sci 2008,99 1448-54)。这种系统性策略揭示了突触循环蛋白4(" SYNGR4")是一种新的癌症-睾丸抗原，它通常在原发性肺癌中过表达，而且涉及细胞侵袭和癌细胞的生长/存活。
SYNGR4是一种25kD蛋白质，首次被描述的是它的染色体定位为19q_臂胶质瘤肿瘤抑制基因区(NPL 32 =Smith JS, et al.，Genomics 2000,64 :44-50)。SYNGR4 被认为是突触循环蛋白家族的一个新成员。SYNGR1-3在神经元或非神经元细胞中的微泡上丰富表达 (NPL 33 =Kedra D,et al.，Hum Genet 1998,273 :2851-7 ；NPL 34 Janz R,et al.，Neuron 1999,24:687-700 ；NPL 35 Zhao H, et al. , Mol Biol Cell 2001，12 :2275-8 。SYNGRl 和SYNGR2(细胞循环蛋白)的功能已经得到了充分的表征。SYNGRl和SYNGR2具有迥异的表达谱，其中SYNGRl主要在中枢神经系统中表达，而SYNGR2在除脑以外的多种器官中遍在表达(NPL 33 =Kedra D, et al.，Hum Genet 1998,273 :2851-7)。SYNGRl 蛋白定位在神经元的突触囊泡中，而且在功能上影响神经元的可塑性和来自质膜的胞吞作用(NPL 34 Janz R, et al.，Neuron 1999,24 :687-700 ；NPL 35 =Zhao H, et al.，Mol Biol Cell 2001，12 2275-89)。SYNGR2蛋白是在大多数类型的细胞中遍在观察到的突触样微泡(SLMV)的一种成分(NPL 36 =Belfort GM, et al.，J Biol Chem 2003，278 :47971-8 ；NPL 37 =Belfort GM, et al.，J Biol Chem 2005，280 :7262-72)。SYNGR2 将 SLMV 中的主要成分蛋白即突触泡蛋白动员到SLMV上，从而对SLMV生物发生是重要的(NPL 36 =Belfort GM, et al.， J Biol Chem 2003，278 :47971-8 ；NPL 37 =Belfort GM, et al.，J Biol Chem 2005，280 7262-72)。SYNGR3蛋白展现与SYNGRl相同的表达谱，但是SYNGR3的确切功能未知(NPL 38 =Belizaire R, et al.，J Comp Neurol 2004，470 :266-81)。SYNGR4 的生理和致癌功能尚无完善记载。
引用表 非专利文献 [NPLlJShibuya K et al. ，BMC Cancer 2002,2 :37 [NPL2]Naruke Τ, et al.，Ann Thorac Surg 2001,71(6) :1759-64 [NPL3]Ranson Μ, et al.，J Clin Oncol 2002,20 :2240-50 [NPL4]Inoue A, et al.，Lancet 2003,361 :137-9 [NPL5]Jphnson DH,et al.，J Clin Oncol 2004,22 :2184-91 [NPL6]Daigo Y, et al. , Gen Thorac Cardiovasc Surg 2008,56 43-53 [NPL7]Kikuchi T, et al. , Oncogene 2003，22 :2192-205 [NPL8]Kakiuchi S, et al.，Mol Cancer Res 2003，1 :485-99 [NPL9]Kakiuchi S, et al.，Hum Mol Genet 2004，13 :3029-43 [NPL10]Kikuchi Τ, et al.，Int J Oncol 2006,28 :799-805 [NPL11]Taniwaki Μ, et al.，Int J Oncol 2006,29 :567-75 [NPL12]Suzuki C, et al. , Cancer Res 2003，63 :7038-41 [NPL13]Ishikawa N, et al.，Clin Cancer Res 2004,10 :8363-70 [NPL14]Kato T，et al. , Cancer Res 2005，65 :5638-46 [NPL15]Furukawa C, et al. , Cancer Res 2005,65 :7102-10 [NPL16]Ishikawa N, et al.，Cancer Res 2005,65 :9176-84 [NPL17]Suzuki C, et al. , Cancer Res 2005,65 :11314-25 [NPL18]Ishikawa N, et al. , Cancer Sci 2006,97 :737-45 [NPL19]Takahashi K, et al. , Cancer Res 2006，66 :9408-19 [NPL20]Hayama S, et al.，Cancer Res 2006,66 :10339-48 [NPL21]Kato T，et al. ，Clin Cancer Res 2007，13 :434-42 [NPL22]Suzuki C, et al. , Mol Cancer Ther 2007，6 :542-51 [NPL23]Yamabuki T，et al. , Cancer Res 2007，67 :2517-25 [NPL24]Hayama S, et al.，Cancer Res 2007,67 :4113-22 [NPL25]Kato T，et al. , Cancer Res 2007，67 :8544-53 [NPL26]Taniwaki M，et al. ，Clin Cancer Res 2007，13 :6624-31 [NPL27]Ishikawa N, et al.，Cancer Res 2007,67 :11601-11 [NPL28]Mano Y, et al. , Cancer Sci 2007，98 :1902—13 [NPL29]Suda T，et al. , Cancer Sci 2007，98 :1803—8 [NPL30]Kato T，et al.，Clin Cancer Res 2008，14 :2363-70 [NPL31]Mizukami Y, et al. , Cancer Sci 2008，99 :1448-54 [NPL32]Smith JS, et al.，Genomics 2000,64 :44-50 [NPL33]Kedra D, et al.，Hum Genet 1998,273 :2851-7 [NPL34]Janz R, et al.，Neuron 1999,24 :687-700 [NPL35]Zhao H, et al.，Mol Biol Cell 2001，12 :2275-89 [NPL36]Belfort GM, et al.，J Biol Chem 2003,278 :47971-8 [NPL37]Belfort GM,et al.，J Biol Chem 2005,280 :7262-72 [NPL38]Belizaire R，et al. , J Comp Neurol 2004，470 :266-81 发明概述 本发明部分基于SYNGR4作为癌症-睾丸抗原的成员，作为用于癌症疫苗疗法的一个理想靶标，以及SYNGR4在肺致癌作用和肿瘤进展中的作用的发现。SYNGR4是肺癌的一种有用的诊断生物标志物和治疗靶标。
因而，本发明涉及SYNGR4，及它在肺癌的致癌作用和过表达SYNGR4的其它癌症中的作用。由此，本发明涉及用于检测、诊断、治疗和/或预防过表达SYNGR4的癌症例如肺癌，特别是SCLC和NSCLC的组合物和方法，以及用于筛选结合和/或抑制SYNGR4的有用药剂的方法。
特别地，本发明部分源自如下的发现，即由特定序列(特别是SEQ ID NO =11,12, 19和20)构成的抑制SYNGR4表达的双链分子有效抑制过表达SYNGR4的癌细胞，例如肺癌细胞的细胞生长。具体地，本发明提供了靶向SYNGR4基因的小干扰RNA(siRNA)。这些双链分子可以以分离的状态利用，或者在载体中编码并自载体表达。因而，本发明的一个目的是提供此类抑制SYNGR4表达的双链分子以及表达它们的载体和宿主细胞。
在一个方面，本发明提供了用于抑制细胞生长及治疗肺癌的方法，其通过将本发明的双链分子或载体施用于需要它们的受试者来进行。此类方法涵盖对受试者施用包含一种或多种双链分子或载体的组合物。
在另一个方面，本发明提供了用于治疗肺癌的组合物，其含有至少一种可有效抑制SYNGR4表达的本发明双链分子或载体。
在又一个方面，本发明提供了一种诊断或确定受试者中对肺癌的倾向性的方法， 其通过测定源自患者的生物样品中的SYNGR4表达水平来进行。SYNGR4表达水平与SYNGR4 的正常对照水平相比的升高指示受试者患有或有风险发生肺癌。
此外，本发明涉及如下的发现，即SYNGR4的高表达水平与癌症患者中的，特别是肺癌患者中的较差存活率有关。因此，本发明提供了一种用于评估或确定癌症，例如肺癌患者的预后的方法，该方法包括下述步骤检测SYNGR4的表达水平，将它与预确定的参照水平比较，并根据它们之间的差异来确定患者的预后。
在又一个方面，本发明提供了一种筛选用于治疗和/或预防由SYNGR4过表达促进或引起或部分地由SYNGR4过表达促进的癌症，例如肺癌的化合物的方法。此类化合物会结合SYNGR4基因，降低SYNGR4的生物学活性，抑制SYNGR4与其它蛋白质之间的相互作用或降低SYNGR4基因或受SYNGR4基因的转录起始区控制的报道基因的表达。
在一个方面，本发明提供了一种治疗或预防由SYNGR4过表达促进或引起或部分地由SYNGR4促进的癌症，例如肺癌的方法，其通过施用结合和/或抑制SYNGR4蛋白的活性的抗体来进行。
本领域的技术人员会理解，本发明的一个或多个方面可以满足某些目的，而一个或多个其它方面可以满足某些其它目的。每一个目的可能不在全部方面均同等地适用于本发明的每一个方面。因此，前述目的可以择一地适用于本发明的任何一个方面。在联系附图和实施例阅读下面的详细说明时，本发明的这些和其它目的和特征将变得更加显而易见。然而，应当理解，前面的发明概要和后面的详细说明都仅仅提出了优选的实施方案，并不对本发明或本发明的其它可替换实施方案构成限制。
附图简述

图1A-C，对肿瘤组织、细胞系和正常组织中的SYNGR4表达的分析。A，通过半定量 RT-PCR分析检测的，15份临床肺癌和正常肺组织样品(顶部小图)[肺腺癌(ADC)，肺鳞状细胞癌(SCC)和小细胞肺癌(SCLC)；顶部]和22种肺癌细胞系(底部小图)中的SYNGR4 表达。B，内源SYNGR4蛋白在SYNGR4阳性和阴性肺癌细胞系，和支气管上皮细胞中的表达和亚细胞定位。在NCI-H1373、LC319、AM9、和SBC3细胞中，SYNGR4的染色主要位于胞质， 细胞表面上有弱染色，呈粒状表象，而在NCI-H1781和支气管上皮衍生的BEAS-2B和SAEC细胞系中没有观察到染色。C，通过免疫细胞化学检测细胞表面SYNGR4，对于用C端带myc/ His标签的SYNGR4转染的C0S-7细胞使用抗myc抗体，而对于用N端带3X Flag标签的 SYNGR4转染的C0S-7细胞中使用抗Flag抗体。在有和无Triton-X处理下观察到细胞表面上的SYNGR4染色，而通过用酸性甘氨酸除去细胞表面抗体，SYNGR4染色消失了，从而指示 SYNGR4的C端和N端在细胞膜以外。
图1D，D，通过流式细胞术来检测肺癌细胞系中的细胞表面SYNGR4。在表达SYNGR4 的细胞系的细胞表面上检测到SYNGR4。
图2，正常组织和肺癌中的SYNGR4表达，及它与NSCLC患者的不良预后的联系。A， 16种正常成人组织中SYNGR4转录物的Northern印迹分析。在睾丸中观察到强信号。B，通过免疫组织化学来比较正常组织与肺癌之间的SYNGR4蛋白表达。C，肺癌组织和正常组织中强、弱、和无SYNGR4表达的例子(左边照片)。原始放大倍数，XlOO0依据SYNGR4表达水平对NSCLC患者的存活的Kaplan-Meier分析(P = 0. 0002,时序检验)(右边小图)。
图3A，SYNGR4的生长促进效果。A，针对SYNGR4的siRNA对肺癌细胞生长的抑制。 上部小图，通过半定量RT-PCR分析的，si-SYNGR4(#l和#2)和对照siRNA (si-EGFP/增强型绿色荧光蛋白基因，si-LUC/萤光素酶)对A549细胞(左边)和SBC-5细胞(右边)中 SYNGR4表达的基因敲低效果。底部小图，经si-SYNGR4或对照siRNA转染的A549和SBC-5 细胞的集落形成和MTT测定。柱形，三次重复测定的相对吸光度；棒状线，SD0 图3B，B,外源性过表达SYNGR4的C0S-7或NIH-3T3细胞中细胞增殖的促进。上部小图，通过^festern印迹来检测瞬时SYNGR4表达。底部小图，转染表达SYNGR4的载体后 96小时C0S-7细胞的MTT测定。柱形，三次重复测定的相对吸光度；棒状线，SD. 图4A，SYNGR4的细胞侵袭效果。A，外源性过表达SYNGR4的哺乳动物细胞中细胞侵袭的促进。顶部小图，通过Western印迹检测的，C0S-7 (左边)和NIH3T3 (右边)细胞中 SYNGR4蛋白的瞬时表达。底部小图，展现用人SYNGR4的表达质粒转染后C0S-7和NIH3T3 细胞在基质胶基质中的侵袭性质的测定。吉姆萨染色(χ 200 ；左边底部)，和呈现迁移穿过经基质胶包被的滤器的细胞数的小图(右边底部)。棒状线，SD0测定实施三次且在三个重复孔中实施。
图4B，B，外源性表达SYNGR4的C0S-7细胞中抗SYNGR4抗体对细胞侵袭活性的抑制效果。左边小图，对用抗SYNGR4抗体或同种型IgG，或PBS处理过的侵袭的C0S-7细胞的显微镜评估。右边小图，迁移穿过经基质胶包被的滤器的C0S-7细胞数；棒状线，SD。测定进行三次且在三个重复孔中进行。
图4C，C，肺癌细胞中抗SYNGR4抗体对细胞侵袭活性的抑制效果。顶部小图，对用抗SYNGR4抗体、同种型IgG、或PBS处理的侵袭的A549细胞(左边)和NCI-H1781细胞(右边)的显微镜评估。底部小图，穿过经基质胶包被的滤器的侵袭癌细胞数；棒状线，SD。测定在三个重复孔中进行三次。
图5A-B，SYNGR4与GRB2的相互作用。A，SYNGR4的磷酸化的鉴定。左边顶部小图，C0S-7细胞中外源SYNGR4蛋白的磷酸酶处理。经磷酸酶处理的样品中移位的条带指示 SYNGR4被磷酸化。左边底部小图，通过抗磷酸酪氨酸抗体进行的对来自外源性表达SYNGR4 或经模拟载体转染的C0S-7细胞的溶胞物的免疫沉淀物的免疫印迹。右边小图，SYNGR4蛋白的蛋白质序列。数字指示自N端起的氨基酸数。B，哺乳动物细胞中通过免疫沉淀(IP)
9进行的外源SYNGR4结合GRB2的验证。左边小图，C0S-7细胞用模拟或SYNGR4转染，并通过抗myc抗体进行IP-myc，接着用抗GRB2抗体进行免疫印迹(IB)。同时使用未沉淀的细胞溶胞物(输入)实施了免疫印迹。用抗myc抗体实施再免疫印迹以验证SYNGR4的免疫沉淀。右边小图，C0S-7细胞用模拟或SYNGR4转染，并通过抗GRB2抗体进行IP-GRB2，接着用抗myc抗体进行免疫印迹。用抗GRB2抗体实施再免疫印迹以验证GRB2的免疫沉淀。
图5C，C，根据在SYNGR4中用苯丙氨酸替换酪氨酸-46(SYNGR4-Y46F)可见，SYNGR4 中的酪氨酸-46被磷酸化，而且对于与GRB2的相互作用是重要的。左边小图，C0S-7细胞用模拟或野生型(WT) SYNGR4或SYNGR4-Y46F转染，并用抗Flag抗体进行IP-Flag，接着用抗磷酸酪氨酸抗体进行免疫印迹(IB)。右边小图，C0S-7细胞用模拟或SYNGR4-WT或W6F 转染，并用抗myc抗体进行IP-myd，接着用抗GRB2抗体进行免疫印迹。用抗myc抗体实施再免疫印迹以验证SYNGR4的免疫沉淀。
图6A，MAPK信号传导经由它上游SYNGR4依赖性GRB2-PAK1途径的活化。A， 哺乳动物细胞中SYNGR4或针对SYNGR4转染的siRNA下的MAPK信号传导分子磷酸化状态。左边小图，C0S-7细胞用模拟或SYNGR4转染，并在转染后M小时对细胞溶胞物用抗磷酸 c-RAF (Ser338)、抗 c-RAF、抗磷酸 MEK1/2 (Ser217/221)、抗磷酸 MEKl (Ser298)、 抗磷酸ERK(Thr202/Tyr204)、抗ERK、抗myc、和抗GAPDH抗体进行免疫印迹。右边小图， A549和SBC-3细胞用针对SYNGR4的siRNA或对照siRNA(EGFP)转染，并在转染后M小时对细胞溶胞物用抗磷酸c-RAF(Ser338)、抗c-RAF、抗磷酸MEK1/2 (Ser217/221)、抗磷酸 MEKl (Ser298)、抗磷酸ERK(Thr202/Tyr204)、抗ERK、和抗GAPDH抗体进行免疫印迹。还获取细胞总RNA，并进行逆转录反应，接着进行PCR反应以评估SYNGR4转录的敲低。GAPDH转录用作内部对照。
图6B-D，B，SYNGR4增强MAPK信号传导的效果是经GRB2介导的。用针对GRB2 的siRNA或对照SiRNA(EGFP)转染C0S-7细胞，并在转染后4小时用模拟或SYNGR4转染细胞。在第二次转染后M小时，再将细胞溶胞物用抗磷酸C-RAF(Ser338)、抗c-RAF、抗磷酸 MEKl/2(Ser217/221)、抗磷酸 MEKl (Ser298)、抗磷酸 ERK(Thr202/Tyr204)、抗 ERK、抗 GRB2、抗myc、和抗GAPDH抗体进行免疫印迹。C，表达突变型SYNGR4的C0S-7细胞中受损的增强MAPK信号传导的功能。用模拟、野生型SYNGR4 (WT)、或突变型SYNGR4 (Y46F)转染 C0S-7细胞，并在转染后M小时对细胞溶胞物用抗磷酸c-RAF(Ser338)、抗c-RAF、抗磷酸 MEK1/2 (Ser217/221)、抗磷酸 MEKl (Ser298)、抗磷酸 ERK (Thr202/Tyr204)、抗 ERK、抗 myc、 和抗GAPDH抗体进行免疫印迹。D，肺癌细胞中SYNGR4转染对PAKl磷酸化的影响。A549和 SBC-3细胞用针对SYNGR4的siRNA或对照siRNA (EGFP)转染，并在转染后M小时对细胞溶胞物用抗磷酸PAKl (Thr423)、ΡΑΚΙ、和GAPDH抗体进行免疫印迹。还获取细胞总RNA，并进行逆转录反应，接着进行PCR反应以评估SYNGR4转录的敲低。GAPDH转录用作内部对照。
图6Ε，E，SYNGR4增强MAPK信号传导的效果是经PAKl介导的。用针对PAKl的 siRNA或对照SiRNA(EGFP)转染C0S-7细胞，并在转染后4小时用模拟或SYNGR4转染细胞。在第二次转染后M小时，再将细胞溶胞物用抗磷酸c-RAF(Ser338)、抗c-RAF、抗磷酸 MEKl/2(Ser217/221)、抗磷酸MEKl (Ser298)、抗磷酸ERK(Thr202/Tyr204)、抗ERK、抗ΡΑΚΙ、 抗myc、和抗GAPDH抗体进行免疫印迹。
图6F-G，F，表达突变型SYNGR4的C0S-7细胞中受损的促进细胞生长和侵袭的功能。左边小图，C0S-7细胞用模拟、野生型SYNGR4(WT)、或突变型SYNGR4(Y46F)转染，并在转染后120小时实施集落形成(顶部)和MTT (底部)测定法。柱形，三次重复测定的相对吸光度；棒状线，SD。右边小图，C0S-7细胞用模拟、SYNGR4-WT、或SYNGR4-Y46F转染，并施加到基质胶侵袭室中温育22小时，接着对迁移穿过经基质胶包被的滤器的细胞计数。吉姆萨染色(χ 200;右边顶部)，和呈现迁移细胞数的小图(右边底部)。棒状线，SD0测定实施三次且在三个重复孔中实施。G，涉及SYNGR4的可能的相互作用级联。
图7，增图。A，有或无SYNGR4抗体预温育抗原肽下肺癌组织的免疫组织化学。B， 用于检测GTP结合的RAS的RAFl下拉测定。用模拟或表达SYNGR4的质粒转染C0S-7细胞， 并在M小时后对细胞溶胞物进行与重组活性RAFl缀合珠子一起温育，接着用抗RAS抗体进行免疫印迹。
实施方案的描述 定义 除非另有具体指明，如本文中使用的词语“一个”、“一种”、和“该”意思是“至少一个”。
如本文中使用的，术语“生物样品”指整个生物体或其组织(例如肺组织)、细胞或组成部分(例如体液，包括但不仅限于，血液、血清、血浆、黏液、淋巴液、滑液、脑脊液、唾液、痰、羊水、脐带血(amniotic cord blood)、尿液、阴道液和精液)的子集(subset)。术语“生物样品”进一步指从整个生物体或其细胞、组织或组成部分的子集制备的勻浆物、裂解物、提取物、细胞培养物或组织培养物，或其级分或部分。最后，“生物样品”指含有细胞组分(诸如蛋白质或多核苷酸)的培养基，诸如生物体已在其中繁殖的营养汤或凝胶。
术语“多核苷酸”、“寡核苷酸”、“核苷酸”、“核酸”、和“核酸分子”在本文中可互换使用，指核酸残基的多聚物，而且，除非另有具体指明，用其通常为人接受的单字母代码进行指代。所述术语适用于其中一个或更多核酸通过酯键连接的核酸(核苷酸)多聚体。所述核酸多聚体可包括DNA、RNA或其组合，而且涵盖天然出现的和非天然出现的核酸多聚体。
术语“多肽”、“肽”、和“蛋白质”在本文中可互换使用，指氨基酸残基的多聚体。所述术语适用于其中一个或多个氨基酸残基是修饰残基，或非天然出现的残基，诸如对应于天然出现残基的人工化学模拟物的氨基酸多聚体，以及天然出现的氨基酸多聚体。
SYNGR4 基因或 SYNGR4 蛋白 本发明中的基因的核酸和多肽序列示于下列数字，但不限于那些； SYNGR4 :SEQ ID NO 13 禾口 14。
另外，序列数据亦可通过下述登录号获取 SYNGR4 :ΝΜ_012451。
本发明首次公开了 SYNGR4表达能促进肺肿瘤进展，其通过经由活化新的GRB2/ PAK1/MAPK信号传导途径而刺激细胞增殖/存活和转移来进行。
GRB2基因或GRB2蛋白 本发明中的基因的核酸和多肽序列示于下列数字，但不限于那些； GRB2 =SEQ ID NO :22 至 25。
另外，序列数据亦可通过下述登录号获取 GRB2 :NM_002086 和 NM_203506。
由此基因编码的蛋白结合表皮生长因子受体，而且含有一个SH2域和两个SH3域。 它的两个SH3域指导与其它蛋白的富含脯氨酸区的复合物形成，而它的SH2域结合酪氨酸磷酸化序列。此基因类似于秀丽线虫(C.elegans)的基因，后者牵涉信号转导途径。 已经为此基因找到编码不同同等型的两种可变剪接转录物变体。变体(1) (NM_002086)代表较长的转录物，而且编码较长的那种同等型。
PAK1基因或PAK1蛋白 本发明中的基因的核酸和多肽序列示于下列数字，但不限于那些； PAKl :SEQ ID NO :26 至 29。
另外，序列数据亦可通过下述登录号获取 ΡΑΚΙ :NM_001128620 和 NM_002576。
PAK蛋白是将P GTP酶与细胞骨架重组和核信号传导联系起来的至关重要的效应器。PAK蛋白是一个丝氨酸/苏氨酸p21活化激酶家族，包括PAK1、PAK2、PAK3和PAK4。这些蛋白充当小GTP结合蛋白Cdc42和Rac的靶，而且已经与广泛的生物学活性联系起来。 PAKl调节细胞运动性和形态学。已经为此基因找到编码不同同等型的可变剪接转录物变体。变体(1) (ΝΜ_001128620)编码较长的那种同等型。
C-Raf 基因或 c-fcif 蛋白 本发明中的基因的核酸和多肽序列示于下列数字，但不限于那些； c-Raf :SEQ ID NO :30 至 31 ； 另外，序列数据亦可通过下述登录号获取 c-Raf :NM_002880 ； 此基因是病毒raf基因(ν-raf)的细胞同源物。所编码的蛋白是一种MAP激酶激酶激酶(MAP3K)，它直接结合膜结合GTP酶Ras家族，并在其下游发挥功能。一旦活化，细胞RAFl蛋白能磷酸并从而活化双特异性蛋白激酶MEKl和MEK2，它们继而磷酸化并从而活化丝氨酸/苏氨酸特异性蛋白激酶ERKl和ERK2。活化的ERK是细胞生理学的多效效应器， 而且在参与细胞分裂周期、凋亡、细胞分化和细胞迁移的基因表达的控制中发挥重要作用。 此基因中的突变与努南综合征(Noonan syndrome) 5和豹斑综合征(LEOPARDsyndrome) 2有关。
MEK1/2的基因或蛋白 本发明中的基因的核酸和多肽序列示于下列数字，但不限于那些； MEKl =SEQ ID NO :32 和 33，MEK2 :SEQ ID NO 34 和 35。
另外，序列数据亦可通过下述登录号获取 MEKl :NM_002755, MEK2 :NM_030662o MEKl是双特异性蛋白激酶家族的一个成员，起丝裂原活化蛋白(MAP)激酶激酶的作用。MAP激酶，也称作细胞外信号调节激酶(ERK)，起多种生化信号的整合点的作用。此蛋白激酶位于MAP激酶的上游，而且应答于极其多种细胞外和细胞内信号而刺激MAP激酶的酶活性。作为MAP激酶信号转导途径的一种至关重要的成分，此激酶牵涉许多细胞过程，诸如增殖、分化、转录调节和发育。MEK2是一种属于MAP激酶激酶家族的双特异性蛋白激酶。 已知此激酶在丝裂原生长因子信号转导中发挥至关重要的作用。它磷酸化并从而MAPKl/ ERK2和MAPK2/ERK3。此激酶自身的活化依赖于MAP激酶激酶激酶的Ser/Thr磷酸化。此基因中的突变引起心面皮肤综合征迟缓(cardiofaciocutaneous syndrome retardation), 和与努南综合征中出现的特征相似的独特的面部特征。还发现此激酶的抑制或降解参与了耶尔森氏菌属(Yersinia)和炭疽的发病机制。已经为此基因鉴定了一种假基因，其位于染色体7上。
ERK1/2的基因或蛋白 本发明中的基因的核酸和多肽序列示于下列数字，但不限于那些； ERKl =SEQ ID NO :36 至 41，ERK2 :SEQ ID NO 42 至 45。
另外，序列数据亦可通过下述登录号获取 ERKl :ΝΜ_002746, ΝΜ_001040056, ΝΜ_001109891, ERK2 :NM_002745, NM_138957。
ERKl是MAP激酶家族的一个成员。MAP激酶，也称作细胞外信号调节激酶(ERK)，响应多种细胞外信号在调节多种细胞过程(诸如增殖、分化、和细胞周期行进)的信号传导级联中起作用。此激酶由上游激酶活化，导致其易位至核，在那里它磷酸化核靶。已经记载了编码不同蛋白同等型的可变剪接转录物变体(ΝΜ_002746，ΝΜ_001040056, NM_001109891)。 变体(1) (NM_002746)蛋白最常见的转录物，而且编码同等型1。ERK2是MAP激酶家族的一个成员。MAP激酶，也称作细胞外信号调节激酶(ERK)，起多种生化信号的整合点的作用，而且参与极其多种细胞过程，诸如增殖、分化、转录调节和发育。此激酶的活化需要上游激酶对它的磷酸化。活化后，此激酶易位至受到刺激的细胞的核，它在那里磷酸化核靶。 已经为此基因报告了编码相同蛋白但UTR不同的两种可变剪接转录物变体。此变体(1) (NM_002745)代表较长的那种转录物。变体1 (匪_00274幻和2 (NM_138957)均编码相同的蛋白。
依照本发明的一个方面，功能等同物亦认为是上述“多肽”。在本文中，蛋白的“功能等同物”为具有与该蛋白等同的生物学活性的多肽。也就是，任何保留生物学能力的多肽均可用作本发明中的此类功能等同物。此类功能等同物包括那些对蛋白的天然存在氨基酸序列替代、删除、添加、或插入一个或多个氨基酸的。或者，多肽可包含与相应蛋白的序列具有至少约80 %同源性(也称作序列同一性)，更优选与参照序列，例如SYNGR4多肽，例如 SEQ ID N0:14具有至少约90%，93%，95%，97%，99%序列同一性的氨基酸序列，如使用已知的序列比较算法，例如BLAST或ALIGN(设为缺省设置)确定的。在其它实施方案中，多肽可以由在严格条件下与基因的天然存在核苷酸序列杂交的多核苷酸编码。在一些实施方案中，多肽由与参照序列，例如SYNGR4多核苷酸，例如SEQ ID NO 13共享至少约90%,93%, 95^,97^,99%序列同一性的多核苷酸编码，如使用已知的序列比较算法确定的。
本发明的多肽可在其氨基酸序列、分子量、等电点、糖链的有无、或形式等方面有变化，这取决于用于产生它的细胞或宿主，或使用的纯化方法。无论如何，只要它具有与本发明的人类蛋白的功能等同的功能，它就在本发明的范围内。
短语“严格(杂交)条件”指这样的条件，在该条件下，核酸分子会与其靶序列杂交，通常在核酸复杂混合物中，而没有与其它序列的可检测的杂交。严格条件取决于序列，而且在不同情况中会有所不同。较长的序列在更高温度特异性杂交。对于核酸杂交详尽指导可见于 Tijssen, Techniques in Biochemistry and Molecular Biology—Hybridization with Nucleic Probes, "Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid assays，，(1993)。 一1 ^ZieH-^r件选择为在限定的离子强度PH，比特定序列的热熔点(Tm)低大约5-10°C。Tm是如下的温度 (在限定的离子强度、PH和核酸浓度下)，在该温度下在平衡时50%的与靶互补的探针与靶序列杂交(因为靶序列过量存在，所以在Tm，在平衡时50%的探针被占据)。严格条件还可以通过添加去稳定剂(诸如甲酰胺)来实现。对于选择性或特异性杂交，阳性信号是背景的至少两倍，优选背景杂交的10倍。例示性的严格杂交条件包括如下50%甲酰胺、5xSSC、 和 SDS，在 42°C温育，或 ^cSSCU % SDS、在 65°C温育，用 0. 2xSSC 和 0. SDS 在 50°C 清洗。
在本发明的语境中，用于分离编码与上述人类蛋白功能等同的多肽的DNA的杂交条件可由本领域技术人员常规选择。例如，可用下述步骤进行杂交在68摄氏度用 "Rapid-hyb buffer"(Amersham LIFE SCIENCE)进行30分钟或更长的预杂交，添加经过标记的探针，并在68摄氏度温育一小时或更长。下面的清洗步骤可在例如低严格度条件中进行。一种例示性的低严格度条件可包括42°C、2xSSC与0. 1 % SDS，优选50°C、2xSSC与0. 1 % SDS。经常优选使用高严格条件。一种例示性的高严格条件可包括在室温在hSSC、0. SDS中清洗3次各20分钟，然后在lxSSC、0. 1 % SDS中在37摄氏度清洗3次各20分钟，并在lxSSC、0. 1% SDS中在50摄氏度清洗2次各20分钟。然而，数种因素，诸如温度和盐浓度，可影响杂交的严格度，而且本领域技术人员可合适地选择所述因素以达到所需的严格度。
一般地说，蛋白中一个、两个或更多个氨基酸的修饰不会影响蛋白的功能。事实上，已知突变的或经过修饰的蛋白(即由如下氨基酸序列构成的肽，其中已通过替代、删除、插入和/或添加修饰了一个、两个或更多个氨基酸残基)保留原始的生物学活性(Mark et al. ， Proc Natl Acad Sci USA 81 :5662-6(1984) ；Zoller and Smith, Nucleic Acids Res 10 :6487-500(1982) ；Dalbadie-McFarland et al. , Proc Natl Acad Sci USA 79 6409-13(1982))。因而，本领域技术人员会认识到，对氨基酸序列进行改变单个氨基酸或小百分比的氨基酸的个别添加、删除、插入、或替代，或者被认为是“保守修饰”的那些修饰， 其中蛋白的改变产生具有相似功能的蛋白，这些都是本发明的语境中可接受的。如此，在一个实施方案中，本发明的肽可具有如下的氨基酸序列，其中添加、插入、删除、和/或替代 C120RF48序列中的一个、两个或甚至更多个氨基酸。
只要保持蛋白的活性，氨基酸突变的数目不受特别限制。在本发明中，发明人证明了强的SYNGR4表达与NSCLC患者的较差临床结果有关，通过siRNA来抑制SYNGR4的内源表达导致肺癌细胞的存活力显著降低，而且在哺乳动物细胞中，SYNGR4的外源表达增强细胞生长和细胞迁移/侵袭性活性。另外，揭示了 SYNGR4中的Tyr46被磷酸化，而且对于与 GRB2的结合及对于活化GRB2/PAK1/MAH(信号传导途径是重要的。然而，一般优选改变氨基酸序列的5%或更少。因而，在一个优选的实施方案中，在此类突变体中要突变的氨基酸数目一般为30个氨基酸或更少，优选20个氨基酸或更少，更优选10个氨基酸或更少，更优选 6个氨基酸或更少，甚至更优选3个氨基酸或更少。
要突变的氨基酸残基优选突变为保持氨基酸侧链特性的另一种氨基酸(称为保守性氨基酸替代的过程)。氨基酸侧链特性的例子有疏水性氨基酸(A，I，L，M，F，P，W，Y，V)、 亲水性氨基酸(R，D，N, C，E，Q，G，H，K，S, T)、和具有下列共同官能团或特征的侧链脂肪族侧链(G，A，V，L，I，P)；含有羟基基团的侧链(S，T，Y)；含有硫原子的侧链(C，M)；含有羧酸和酰胺的侧链(D，N，E，Q)；含有碱的侧链(R，K，H)；和含有芳香族的侧链(H，F，Y，W)。 提供功能相似氨基酸的保守性替代表在本领域是公知的。例如，下列8个组各种包含彼此构成保守性替代的氨基酸 1)丙氨酸(A)、甘氨酸(G)； 2)天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)； 3)天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)； 4)精氨酸(R)、赖氨酸(K)； 5)异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)、缬氨酸(V)； 6)苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)； 7)丝氨酸(S)、苏氨酸(T)；和 8)半胱氨酸(C)、甲硫氨酸(M)(参见例如 Creighton, Proteins 1984)。
此类保守性修饰多肽包括在本发明的蛋白中。然而，本发明并不仅限于此，而且蛋白包括非保守性修饰，只要蛋白的至少一种生物学活性得以保留即可。另外，经过修饰的蛋白并不排除多态变体、种间同源物、和那些由这些蛋白的等位基因编码者。
此外，本发明的基因涵盖编码蛋白的此类功能等同物的多核苷酸。除了杂交之外， 可以利用基因扩增方法，例如聚合酶链式反应(PCR)方法，使用基于上述信息的序列合成的引物来分离编码与蛋白功能等同的多肽的多核苷酸。分别构成人类基因和蛋白的功能等同物的多核苷酸和多肽通常与其原始核苷酸或氨基酸序列具有高同源性。“高同源性”通常指40%或更高的同源性，优选60%或更高，更优选80%或更高，甚至更优选90%至95% 或更高。特定多核苷酸或多肽的同源性可遵循“Wilbur and Lipman，Proc Natl Acad Sci USA 80 :726-30(1983) ”中的算法来确定。
抗体 如本文中使用的，术语“抗体”意图包括可以与指定的蛋白或其肽特异性反应的免疫球蛋白及其片段。抗体可以包括人抗体、灵长源化(primatized)抗体、嵌合抗体、双特异性抗体、人源化抗体、与其它蛋白或放射性标记物融合的抗体、和抗体片段。另外，在本文中，抗体以最广义使用，而且具体涵盖完整单克隆抗体、多克隆抗体、由至少两种完整抗体形成的多特异性抗体(例如双特异性抗体)、和抗体片段，只要它们展现期望的生物学活性。“抗体”指示所有类别(例如IgA、IgD、IgE、IgG和IgM)。
特异性结合SYNGR4的抗体对于抑制肺癌细胞增殖和侵袭性活性是有用的(图 4A-C 和图 6F)。
因此，本发明的抗体可用于治疗肺癌。这些抗体可通过已知方法来生成。用于生成依照本发明使用的抗体的例示性技术是本领域已知的，而且在本文中有描述。
本发明使用针对SYNGR4的抗体来治疗和预防肺癌。这些抗体将通过已知方法来提供。
描述了用于生成依照本发明使用的抗体的例示性技术。
( )多克隆抗体 多克隆抗体优选地通过多次皮下(sc)或腹膜内(ip)注射相关抗原和佐剂在动物中产生。可能有用的是，使用双功能或衍生化试剂将相关抗原与在待免疫的物种中具有免疫原性的蛋白相偶联，其中具有免疫原性的蛋白例如钥孔i威血蓝蛋白、血清清蛋白、牛甲状腺球蛋白、或大豆胰蛋白酶抑制剂，且其中双功能或衍生试剂例如马来酰亚胺苯甲酸硫代琥珀酰亚胺酯(maleimidobenzoyl sulfosuccinimide ester)(通过半胱氨酸残基偶联)、 N-羟基琥珀酰亚胺(通过赖氨酸残基)、戊二醛、琥珀酸酐、SOCl2或R' N = C = NR,其中 R和R’是不同的烷基。
用抗原例如SYNGR4、免疫原性偶联物、或衍生物免疫动物，这通过例如组合 100 μ g或5 μ g蛋白或偶联物(分别用于家兔或小鼠)与3倍体积的弗氏完全佐剂，并在多点皮内注射该溶液。一个月后，用弗氏完全佐剂中1/5-1/10原始量的肽或偶联物在多点通过皮下注射来对动物加强免疫。7-14天后，对动物进行采血，并测定血清的抗体滴度。加强免疫动物，直至滴度达到高平台。优选地是，用于对动物进行加强免疫的是相同抗原的偶联物，但与不同的蛋白偶联和/或通过不同的交联剂偶联。
偶联物亦可在重组细胞培养中作为蛋白融合物来制备。聚集剂诸如明矾亦适用于增强免疫应答。
OD单克降抗体 单克隆抗体自基本上均质的抗体的群体获得，即构成该群体的单个抗体是相同的，只是可能存在少量的可能的天然发生的突变。如此，修饰语“单克隆”是指抗体的这样的特征，即其不是离散(discrete)抗体的混合物。
例如，单克隆抗体可以使用杂交瘤方法来制备，该方法首先记载于 KohlerG&MiIstein C. Nature. 1975 Aug 7 ；256 (5517) :495_7，或者可以通过重组 DNA 方法来制备(美国专利No. 4，816，567)。
在杂交瘤方法中，小鼠或其它适宜的宿主动物，诸如仓鼠，用本文上文所述免疫以引发淋巴细胞产生或能够产生会特异性结合用来免疫的蛋白的抗体。或者，可在体外免疫淋巴细胞。然后使用合适的融合剂诸如聚乙二醇使淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合以形成杂交瘤细胞(Goding, Monoclonal Antibodies principles and Practice, pp.59-103 (Academic Press，1986))。
将如此制备的杂交瘤细胞在合适的培养基中接种并培养，所述培养基优选包含一种或多种抑制未融合的亲本骨髓瘤细胞生长或存活的物质。例如，如果所述亲本骨髓瘤细胞缺乏次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(HGPRT或HPRT)，那么所述杂交瘤的培养基通常会包含次黄嘌呤、氨甲蝶呤、和胸腺嘧啶(HAT培养基)，这些物质阻止HGPRT缺陷细胞的生长。
优选的骨髓瘤细胞是那些高效融合，支持所选抗体产生细胞稳定高水平产生抗体，且对某种培养基诸如HAT培养基敏感的。在这些中，优选的骨髓瘤细胞系是鼠骨髓瘤系，诸如那些自可以从&ilk研究所细胞配送中心(Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, California USA)获得的M0PC-21和MPC-11小鼠肿瘤和可以从美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection, Manassas, Virginia, USA)获得的SP-2或)(63-Ag8-653细胞衍生的。人骨髓瘤和小鼠-人异源骨髓瘤细胞系也有记载用于产生人单克隆抗体(Kozbor D，et al.，J Immunol. 1984 Dec ； 133 (6) :3001-5 ；Brodeur et al. ,Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications,pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc.，New York,1987))。
对杂交瘤细胞在其中生长的培养基分析针对抗原的单克隆抗体的生成。优选地， 通过免疫沉淀或通过体外结合测定诸如放射性免疫测定法(RIA)或酶联免疫吸收测定法(ELISA)来测定由杂交瘤细胞产生的单克隆抗体的结合特异性。
例如，单克隆抗体的结合亲和力可通过Munson PJ & Rodbard D. Anal Biochem. 1980Sep 1 ；107(1) :220-39 的 3(^catchard 分析来测定。
在鉴定出产生具有期望的特异性、亲和力、和/或活性的抗体的杂交瘤细胞后，该克隆可通过有限稀释规程来亚克隆，并通过标准方法来培养(Goding，Monoclonal Antibodies :Principles and Practice, pp. 59-103 (Academic Press, 1986))。适合于此目的的培养基包括，例如D-MEM或RPML-1640培养基。另外，杂交瘤细胞可以在动物中作为腹水瘤来体内培养。
通过常规免疫球蛋白纯化规程合适地将由亚克隆分泌的单克隆抗体与培养基、腹水、或血清分开，所述规程诸如例如蛋白A-kpharose、羟基磷灰石层析、凝胶电泳、透析、或亲和层析。
编码单克隆抗体的DNA易于使用常规规程，例如通过使用能够特异性结合编码鼠抗体重链和轻链的基因的寡核苷酸探针，来分离和测序。杂交瘤细胞是此类DNA的优选来源。一旦分离，就可将DNA置入表达载体中，然后将其转染进入本身不另外产生免疫球蛋白的宿主细胞，诸如大肠杆菌细胞、猿COS细胞、中华仓鼠卵巢(CHO)细胞、或骨髓瘤细胞中，从而在重组宿主细胞中获得单克隆抗体的合成。关于在细菌中重组表达编码抗体的 DNA 的综述论文包括 Skerra A. Curr Opin Immunol. 1993Apr ；5 (2) :256-62 和 PlUckthun A.Immunol Rev. 1992Dec ；130 :151_88。
另一种产生可与SYNGR4起反应的特异性抗体或抗体片段的方法是用SYNGR4筛选在细菌中表达的、编码免疫球蛋白基因或其部分的表达文库。例如，可以使用噬菌体表达文库，在细菌中表达完整的Fab片段、VH区和Fv区。参见例如Ward ES，et al. ,Nature. 1989 Oct 12 ；341 (6242) :544-6；Huse WD, et al.，Science. 1989 Dec 8 ；246 (4935) :1275-81 ； 及 McCafferty J, et al.，Nature. 1990 Dec 6 ；348 (6301) :552_4。用 SYNGR4 月太筛选此类文库能鉴定出可与SYNGR4起反应的免疫球蛋白片段。或者，SCID-hu-mouse (可从Genpharm 获得)可用来产生抗体或其片段。
在又一个实施方案中，可以从使用McCafferty J, et al. , Nature. 1990 Dec 6 ； 348(6301) :552-4 ；Clarkson T, et al.，Nature. 1991 Aug 15 ；352 (6336) :624-8 中记载的技术产生的抗体噬菌体文库分离抗体或抗体片段；Marks JD, et al.，J MoL BioL, 222 581-597(1991) J Mol Biol. 1991 Dec 5 ；222 (3) :581-97 分别记载了使用噬菌体文库分离小鼠和人抗体。后续出版物记载了通过链改组产生高亲和性(nM范围)人抗体(Marks JD, et al.，Biotechnology(N Y). 1992Jul ；10(7) :779-83)，以及组合感染(combinatorial infection)和体内重组作为构建超大噬菌体文库的策略(Waterhouse P, et al.，Nucleic Acids Res. 1993 Mayll ；21 (9) :2265-6) 0因此，这些技术是用于分离单克隆抗体的传统单克隆抗体杂交瘤技术的可行替代方法。
也可以通过例如用人重链和轻链恒定域编码序列替换同源鼠序列(美国专利 No. 4, 816, 567 ；Morrison SL, et al. , Proc Natl Acad Sci U S Α. 1984Νον ；81 (21) 6851-5)，或者通过将免疫球蛋白编码序列与非免疫球蛋白多肽的整个或部分编码序列共价连接来修饰DNA。
通常，用此类非免疫球蛋白多肽替换抗体恒定域，或者用它们替换抗体的一个抗原结合位点的可变域以创建包括一个具有某种抗原特异性的抗原结合位点和另一个具有不同抗原特异性的抗原结合位点的嵌合双价抗体。
(iii)人源化抗体 用于将非人抗体人源化的方法在本领域中已有记载。优选地，人源化抗体中引入了一个或多个来自非人来源的氨基酸残基。这些非人源氨基酸残基经常称作“输入 (import) ”残基，通常取自某个“输入”可变域。人源化可以基本上遵循Winter及其合作者的方法(Jones PT，et al. ,Nature. 1986 May29-Jun 4 ；321 (6069) :522-5 ；Riechmann L，et al.，Nature. 1988 Mar24 ；332 (6162) :323-7 ；Verhoeyen Μ, et al.，Science. 1988 Mar25 ； 239(4847) :1534-6)来实施，用高变区序列替换人抗体的相应序列。因而，此类“人源化”抗体是嵌合抗体(美国专利No. 4，816，567)，其中完整人可变域的一小部分(substantially less than intact)被来自非人物种的相应序列替换。在实践中，人源化抗体通常是人抗体中一些高变区残基，可能还有一些FR残基被来自啮齿动物抗体中类似位点的残基替代而得到的抗体。
在制备人源化抗体中要使用的人可变域，包括轻链和重链可变域，的选择对于降低抗原性是非常重要的。依照所谓的“最佳拟合(best-fit)”方法，针对已知人可变域序列的整个文库来筛选啮齿动物抗体的可变域的序列。然后，接受与啮齿动物序列最接近的人序列作为用于人源化抗体的人框架区(FR) (Sims MJ, et al.，J Immunol. 1993 Aug 15 ； 151(4) :2296-308 ；Chothia C &Lesk AM. J Mol Biol. 1987 Aug 20 ； 196 (4) :901-17)。另一种方法使用自轻链或重链特定亚群的所有人抗体的共有序列衍生的特定框架区。同一框架可用于数种不同的人源化抗体(Carter P, et al.，Proc Natl Acad Sci USA. 1992 May15 ；89 (10) :4285-9 ；Presta L G, et al.，J Immunol. 1993 Sep 1 ；151 (5) :2623-32))。
另外，重要的是，抗体的人源化保留对抗原的高亲和力和其它有利的生物学特性。 为了实现这一目标，依照一种优选的方法，人源化抗体的制备借助下述过程使用亲本和人源化序列的三维模型来分析亲本序列和各种概念性人源化产物。三维免疫球蛋白模型是本领域技术人员普遍可得且熟悉的。有可用的计算机程序来图解和显示选定的候选免疫球蛋白序列的可能三维构象结构。检查这些显示容许分析残基在候选免疫球蛋白序列的功能发挥中的可能作用，即分析影响候选免疫球蛋白与其抗原结合的能力的残基。这样，可以选择 FR残基，并与受体和输入序列组合，从而实现期望的抗体特征，诸如对靶抗原的增加的亲和力。一般地说，高变区残基直接且最实质性地参与影响抗原结合。
(iv)人抗体 作为人源化的替代方式，可生成人抗体。例如，现在有可能生成这样的转基因动物(例如小鼠)，它们当被免疫接种时能够产生人抗体的完整全集(r印ertoire)，而没有内源免疫球蛋白产生。例如，已有记载，在嵌合和种系突变小鼠中纯合删除抗体重链连接区(JH)基因导致内源抗体产生完全被抑制。将人种系免疫球蛋白基因阵列转移到此类种系突变小鼠中会导致在抗原攻击时产生人抗体。例如参见Jakobovits A，et al. , Proc Natl Acad Sci U S A. 1993 Mar 15 ；90 (6) :2551-5 ；Nature. 1993 Mar 18 ；362 (6417) 255-8 ；BruggemannM, et al.，Year Immunol. 1993 ；7 :33-40 ；及美国专利 No. 5，591，669 ； 5，589，369 和 5，545，807。
或者，可使用噬菌体展示技术(McCaffertyJ, et al.，Nature. 1990 Dec6 ；348(6301) 552-4)在体外从来自未经免疫的供体的免疫球蛋白可变(V)域基因全集(repertoire)产生人抗体和抗体片段。依照这种技术，将抗体V域基因符合读框地 (in-frame)克隆入丝状噬菌体(诸如M13或fd)的主要或次要外壳蛋白基因中，并作为功能性抗体片段在噬菌体颗粒的表面上展示。因为丝状颗粒含有噬菌体基因组的单链DNA拷贝，所以基于抗体的功能特性进行的选择也导致编码展现那些特性的抗体的基因被选出。 如此，噬菌体模拟B细胞的一些特性。噬菌体展示可以用多种形式实施，关于它们的综述参见例如 Johnson KS & Chiswell DJ. Curr Opin Struct Biol. 1993 ;3 :564_71。有 V 基因区段的数种来源可用于噬菌体展示。
Clackson T, et al. , Nature. 1991 Aug 15 ；352(6336) :624-8 从自经免疫小鼠的脾衍生的V基因小型随机组合文库分离了一系列多样的抗噁唑酮抗体。可以构建来自未免疫人供体的V基因全集，并可以基本上遵循下列文献中记载的技术分离针对一系列多样抗原(包括自身抗原)的抗体:Marks JD, et al.，J Mol Biol. 1991Dec 5 ；222 (3) :581_97，或 Griffiths AD, et al.，EMBO J. 1993Feb ； 12 (2) :725_34。还可参见美国专利 No. 5，565，332 和 5，573，905。
人抗体也可以由体外活化的B细胞来产生(参见美国专利No. 205，567，610和 5，229，275)。在共有的共同未决申请中记载了使用SCID小鼠产生人抗体的一种优选手段。
(ν)抗体片段 已经开发了多种技术用于产生抗体片段。传统上，这些片段是通过蛋白水解消化完整抗体而衍生的(参见例如Morimoto K & Inouye K. J Biochem Biophys Methods. 1992 Mar ；24 (1-2) :107-17 ；Brennan M, et al.，Science. 1985Jul 5 ；229 (4708) :81-3)。然而，现在这些片段也可以由重组宿主细胞直接产生。例如，可以从上文讨论的抗体噬菌体文库分离抗体片段。或者，可以直接从大肠杆菌回收Fab' -SH片段，并化学偶联以形成 F(ab' ) 2 片段(Carter P，et al. , Biotechnology (N Y). 1992 Feb ； 10 (2) :163-7)。依照另一种办法，F(ab' ) 2片段可以直接从重组宿主细胞培养物分离。其它用于产生抗体片段的技术对熟练从业人员会是显然的。在其它实施方案中，选择的抗体是单链Fv片段(scFv)。 参见WO 93/16185 ；美国专利No. 5，571，894和5，587，458。抗体片段亦可为“线性抗体”，例如如例如美国专利No. 5，641，870中记载的。此类线性抗体片段可以是单特异性的或双特异性的。
(vi)非抗体结合蛋白 术语“非抗体结合蛋白，，或“非抗体配体”或“抗原结合蛋白，，可互换使用，指使用非免疫球蛋白骨架的抗体模拟物，包括adnectins、avimers、单链多肽结合分子、和抗体样结合肽模拟物，如下文中更详细讨论的。
已经开发出了其它以与抗体相似的方式靶定和结合靶物的化合物。某些这些“抗体模拟物”使用非免疫球蛋白骨架作为抗体可变区的替代蛋白框架。
例如，Ladner et al.(美国专利No. 5，260，203)记载了单多肽链结合分子，其具有与抗体的轻链和重链可变区——它们聚集在一起但在分子水平上是分开的——相似的结合特异性。单链结合分子同时含有抗体重链和轻链可变区的抗原结合位点，它们通过肽接头连接，并会折叠成与双肽抗体相似的结构。单链结合分子与传统的抗体相比展示多种优势，包括尺寸更小、稳定性更高和更容易被修饰。
Ku 等(Proc Natl Acad Sci USA 92(14) :6552-6556(1995))记载了一种基于细胞色素1^562的抗体替代物。Ku等(19卯)制成了一个文库，其中细胞色素1^562的两个环被随机化，并从中选择针对牛血清清蛋白的结合。发现各突变体以与抗BSA抗体相似的方式选择性结合BSA。
Lipovsek等(美国专利No. 6，818，418和7，115，396)记载了一种抗体模拟物，其特征是具有纤连蛋白或纤连蛋白样蛋白骨架和至少一个可变环。这些基于纤连蛋白的抗体模拟物称作Adnectins，它们展现出许多与天然或工程化抗体相同的特征，包括对任何靶配体的高亲和力和特异性。任何用于发展新的或改良的结合蛋白的技术均可用于这些抗体模拟物。
这些基于纤连蛋白的抗体模拟物的结构与IgG重链可变区的结构相似。因此，这些模拟物展示在性质和亲和力方面与天然抗体相似的抗原结合特性。另外，这些基于纤连蛋白的抗体模拟物还展现出胜过抗体和抗体片段的某些优点。例如，这些抗体模拟物的天然折叠稳定性不依赖于二硫键，因此在通常会破坏抗体的条件下是稳定的。此外，因为这些基于纤连蛋白的抗体模拟物的结构与IgG重链的结构相似，所以可以在体外采用类似于抗体的体内亲和力成熟过程的环随机化和改组过程。
Beste 等(Proc Natl Acad Sci USA 96(5) :1898-1903(1999))记载了一种基于脂笼蛋白骨架的抗体模拟物(Anticalin(注册商标))。脂笼蛋白包括蛋白末端具有4个超变环的β-桶。BeSte(1999)对环进行随机诱变，并选择与例如荧光素的结合。三种变体展现与荧光素的特异性结合，其中一种变体显示与抗荧光素抗体相似的结合。进一步的分析揭示，所有随机化位置均是可变的，表明Anticalin(注册商标)会适合于用作抗体的替代物。
Anticalin (注册商标)是小型单链肽，通常在160和180个残基之间，这提供了胜过抗体的若干优势，包括降低生成成本，提高储藏稳定性及降低免疫学反应。
Hamilton等(美国专利No. 5，770，380)记载了一种合成抗体模拟物，其使用杯芳烃(calixarene)刚性非肽有机骨架，骨架上附着有多个可变肽环用作结合位点。肽环相对于彼此均从杯芳烃的几何学上的同一侧突出。由于这种几何学构象，所有的环均可供结合， 从而提高与配体的结合亲和力。然而，与其它抗体模拟物相比，基于杯芳烃的抗体模拟物不是纯粹由肽构成的，因此对蛋白酶攻击的敏感性降低。骨架也不是纯粹由肽、DNA或RNA构成，这意味着此抗体模拟物在极端环境条件中相对稳定，而且寿命较长。另外，因为基于杯芳烃的抗体模拟物相对较小，其产生免疫原性应答的可能性降低。
Murali 等(Cell Mol Biol. 49 O) :209-216 Q003))记载了一种用于将抗体减小为更小的模拟肽的方法，它们称为“抗体样结合模拟肽(antibody like binding peptidomemetics) ” (ABiP)，也可以用作抗体的替代物。
Silverman 等(Nat Biotechnol. (2005) ,23 :1556-1561)记载了一些融合蛋白，它们是包含多个域的单链多肽，称作“avimers”。avimers是通过体外外显子改组和噬菌体展示从人细胞外受体域发展而来的，是一类在它们对各种靶分子的亲和力和特异性方面与抗体有些相似的结合蛋白。所得的多域蛋白可以包括多个独立的结合域，它们能展现与单表位结合蛋白相比改良的亲和性(在某些情况中是亚纳摩尔级的)和特异性。关于avimers 构建和使用方法的更多细节披露于例如美国专利申请公开No. 20040175756,20050048512,20050053973,20050089932 和 20050221384。
除了非免疫球蛋白蛋白框架之外，还在包括但不限于RNA分子和非天然寡聚物 (例如蛋白酶抑制剂、苯并二氮卓、嘌呤衍生物和转角模拟物)的化合物中模拟抗体特性，它们都适用于本发明。
(Vii)药物配制剂 可通过将具有期望纯度的抗SYNGR4抗体与任选的药学可接受的载体、赋形剂或禾急定齐Ll (Remington :The Science and Practice of Pharmacy, 21st Ed. , Lippincott, Williams and ffilkins, 2005)混合，以冻干剂型或水溶液的形式，制备抗体的治疗用配制剂供贮存。可接受的载体、赋形剂或稳定剂在所采用的剂量和浓度对接受者是无毒的，包括缓冲剂，诸如磷酸盐、柠檬酸盐和其它有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂(诸如氯化十八烷基二甲基苄基铵；氯化己烷双胺；苯扎氯铵、苯索氯铵；苯酚、丁醇或苯甲醇；对羟基苯甲酸烷基酯，诸如对羟基苯甲酸甲酯或丙酯；邻苯二酚；间苯二酚；环己醇； 3-戊醇；和间甲酚)；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白质，诸如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，诸如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，诸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其它碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精； 螯合剂，诸如EDTA ；糖类，诸如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇；成盐反荷离子，诸如钠；金属复合物(例如Zn-蛋白质复合物)；和/或非离子表面活性剂，诸如TWEENtm、PLURONICS 或聚乙二醇(PEG)。
W097/04801中记载了适于皮下施用的冻干配制剂。此类冻干配制剂可用合适的稀释剂重建至高蛋白质浓度且重建的配制剂可皮下施用于本文中待治疗的哺乳动物。
根据需治疗的特定病症需要，本文所述配制剂亦可包含多于一种活性化合物，优选那些具有互补活性且不会互相有负面影响的。举例而言，可以进一步提供化疗剂、细胞因子或免疫抑制剂。这样的其它药剂的有效量依赖于配制剂中存在的抗体量，病症或疾病或治疗的类型，以及其它上述讨论的因素。这些药剂通常使用与前述所用相同的剂量和给药途径，或前述所用的剂量的大约1到99%。
活性成分还可包埋于例如通过凝聚技术或通过界面聚合制备的微囊中(例如分别是羟甲基纤维素或明胶微胶囊和聚(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊)、在胶体药物投递系统中(例如脂质体、白蛋白微球体、微乳剂、纳米颗粒和纳米胶囊)、或在粗滴乳状液 (macroemulsions)中。此类技术公幵于例如 Remington :The Science and Practice of Pharmacy,21st Ed. , Lippincott, Williams and Wilkins，2005。
可制备持续释放制剂。持续释放制剂的合适例子包括含有药剂的固体疏水性聚合物半透性基质，该基质是成型产品的形式，例如薄膜或微胶囊。持续释放基质的例子包括聚酯、水凝胶(例如聚(2-羟乙基-甲基丙烯酸酯)或聚(乙烯醇))、聚交酯(美国专利第 3，773，919号)、L-谷氨酸和L-谷氨酸、乙酯的共聚物、不可降解的乙烯-乙酸乙烯共聚物、可降解的乳酸-乙醇酸共聚物诸如LUPRON DEPOT (由乳酸-乙醇酸共聚物和醋酸亮丙瑞林构成的可注射微球体)及聚-D-(-)-3-羟基丁酸。用于体内施用的配制剂必须是无菌的。这可容易的通过使用无菌滤膜过滤来实现。
(χ)用抗体治疗 包含抗SYNGR4抗体的组合物可以按照符合良好医疗实践的形式配制、确定剂量和施用。本抗体优选为人类、嵌合或人源化抗体scFv，或抗体片段。在此背景下供考虑的因素包括所治疗的特定肺癌、所治疗的特定哺乳动物、个体患者的临床情况、病症或疾病的原因、药剂需投递的位置、施用方法、施用时程以及其它医疗从业者所知的因素。治疗上有效的施用抗体量将由这些考虑因素所决定。
作为一般性的建议，非消化道施用的抗体治疗上有效的量应在每剂大约每日0. 1 到20mg/kg患者体重的范围内，且典型的抗体起始用量范围为大约2到10mg/kg。
然而，如上所述，这些建议的抗体量在很大程度上受治疗学上考量的左右。在合适剂量与时程的选择中最重要的因素，如上所述，是所得的结果。
例如，对治疗正在进行的以及急性的疾病，可能开始需要相对较高的剂量。为获取最有效的结果，根据疾病或病症，所述抗体可能应尽可能在接近疾病或病症的初兆、诊断、 出现或发生时施用，或在疾病或病症复发的过程中施用。
所述抗体可用任何合适的方法施用，包括非消化道、皮下、腹膜内、肺内、吸入以及鼻内施用，还有如果期望局部免疫抑制治疗，在病变内施用。非消化道输注包括肌肉内、静脉内、动脉内、腹膜内与皮下施用。
另外，通过脉冲输注(pulse infusion)施用所述抗体可能为合适的，例如，用递减剂量的抗体。所述给药优选通过注射，最优选通过静脉内或皮下注射，这部分取决于所述施用是短期的还是长期的。
另外，还可以与本文所述抗体一起施用其它化合物，例如细胞毒剂、化疗剂、免疫抑制剂和/或细胞因子。组合施用包括使用不同配制剂或单一药物配制剂同时施用，以及任何顺序的相继施用，其中优选存在这样的一段时间，其中两种(或所有)活性药剂同时发挥其生物学活性。
除施用所述抗体于患者外，本发明还构思了用基因疗法施用所述抗体。上述施用编码抗体的核酸的方法涵盖于“施用治疗有效量的抗体”这一表述中。例如，关于使用基因疗法产生胞内抗体，参见公布于1996年3月14日的W096/07321。
有两种主要方法使核酸(任选包含在载体中)进入患者的细胞，即体内和回体 (ex vivo) 0对于体内投递，通常在需要抗体的部位将核酸直接注射到患者体内。对于回体治疗，取出患者的细胞，将核酸导入这些分离的细胞，并将经过修饰的细胞或是直接施用于患者，或是例如包埋入多孔膜内并植入患者体内(参见例如美国专利第4，892，538号和第 5，观3，187号)。有多种技术可用于将核酸导入活细胞。这些技术根据是将核酸转移至体外培养细胞还是目的宿主的体内细胞而有所变化。适于在体外将核酸转移到哺乳动物细胞中的技术包括使用脂质体、电穿孔、显微注射、细胞融合、DEAE-右旋糖酐、磷酸钙沉淀法等。 常用于回体投递基因的载体是逆转录病毒。
目前优选的体内核酸转移技术包括用病毒载体(诸如腺病毒、I型单纯疱疹病毒或腺伴随病毒)和基于脂质的系统(可用于脂质介导的基因转移的脂质有例如D0TMA、D0PE 和DC-Choi)进行的转染。在有些情况中，希望将核酸源与靶向靶细胞的试剂，诸如对细胞表面膜蛋白或靶细胞特异的抗体、靶细胞上受体的配体等一起提供。在采用脂质体时，与胞吞作用相关细胞表面膜蛋白结合的蛋白质可用于靶向和/或促进摄入，例如对特定细胞类型具有向性的衣壳蛋白或其片段、在循环中进行内在化的蛋白质的抗体、和靶向细胞内定位和增加细胞内半衰期的蛋白质。例如Wu et al.，J.Biol. Chem. 262 :4429-4432(1987)和Wagner et al. ,Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87 :3410-3414(1990)中记载了受体介导的胞吞技术。关于目前已知的基因标记和基因治疗方案的综述参见Anderson et al. ,Science 256:808-813(1992)。还可参见WO 93/25673及其引用的参考文献。
双链分子 本文中使用的术语“双链分子”指抑制靶基因表达的核酸分子，包括，例如，小干扰RNA(siRNA，例如双链核糖核酸(dsRNA)或小发夹RNA (shRNA))与小干扰DNA/RNA (siD/ R-NA,例如DNA与RNA的双链嵌合体(dsD/R-NA)或DNA与RNA的小发夹嵌合体(shD/ R-NA))。在一些实施方案中，双链分子是分离的或重组的。
本文中使用的术语“siRNA “指阻止靶mRNA翻译的双链RNA分子。使用将siRNA 导入细胞的标准技术，包括其中以DNA为模板转录RNA的那些。所述siRNA包括SYNGR4有义核酸序列(亦用“有义链”指代)、SYNGR4反义核酸序列(亦用“反义链”指代)或两者。 所述siRNA可如此构建使得单个转录物具有靶基因的有义核酸序列与其互补的反义核酸序列，例如，发夹结构。所述siRNA可为dsRNA或shRNA。
本文中使用的术语“dsRNA”指包含相互互补序列的两个RNA分子的构建体，所述两个RNA分子通过所述互补序列退火以形成双链RNA分子。所述两条链的核苷酸序列可不仅包含选自靶基因序列中蛋白质编码序列的“有义”或“反义” RNA，亦可包括具有选自所述靶基因非编码区域的核苷酸序列的RNA分子。
在本说明书中使用的术语“shRNA”是指具有茎-环结构的siRNA，其包含彼此互补的第一区和第二区(即有义链和反义链)。两个区的互补程度和方向足以使两个区之间发生碱基配对，所述第一区和第二区通过环区连接在一起，而所述环是因为环区内的核苷酸(或核苷酸类似物)之间缺乏碱基配对而形成的。shRNA的环区是介于有义链和反义链之间的单链区，也可以称作“间插单链(intervening single-strand)” 在本说明书中使用的术语“siD/R-NA”是指包含RNA和DNA 二者的双链多核苷酸分子，包括RNA和DNA的杂合体和嵌合体，其阻止靶mRNA的翻译。在本说明书中，杂合体表示这样的分子，其中由DNA组成的多核苷酸和由RNA组成的多核苷酸相互杂交形成双链分子；而嵌合体表示组成所述双链分子的链中的一条或两条可以同时含有RNA和DNA。使用将siD/R-NA导入细胞的常规技术。所述siD/R-NA包括SYNGR4有义核酸序列(亦用“有义链”指代)、SYNGR4反义核酸序列(亦用“反义链”指代)或两者。siD/R-NA可以这样构建， 使单个转录物同时具有来自靶基因的有义核酸序列和互补反义核酸序列，例如发夹。siD/ R-NA 可以是 dsD/R-NA 或 shD/R-NA。
在本文中使用的术语“dsD/R-NA”是指这样两个分子的构建体，所述两个分子包含彼此互补的序列并且已经藉由所述互补序列退火在一起而形成双链多核苷酸分子。两条链的核苷酸序列可以不仅仅包含选自靶基因序列的蛋白编码序列的“有义”或“反义”多核苷酸序列，还可以包含具有选自靶基因非编码区的核苷酸序列的多核苷酸。组成dsD/R-NA的两个分子中的一个或两个由RNA和DNA 二者组成(嵌合体分子)，或者一个分子由RNA组成而另一个由DNA组成(杂合双链)。
在本文中使用的术语“shD/R-NA”是指具有茎-环结构的siD/R-NA，其包含彼此互补的第一区和第二区，即有义链和反义链。所述区的互补程度和方向足以使它们之间发生碱基配对，第一区和第二区通过环区连接，所述环是因为在环区内的核苷酸(或核苷酸类似物)之间缺乏碱基配对而形成的。shD/R-NA的环区是介于有义链和反义链之间的单链区，也可以称作“间插单链”。
本说明书中使用的“分离的核酸”是指从本来的环境(例如自然出现时的自然环境)中被取出，与其自然状态相比发生了合成性的改变的核酸。在本发明中，分离的核酸包括DNA、RNA和它们的衍生物。
针对SYNGR4的双链分子与靶mRNA杂交，通过与正常单链mRNA基因转录物结合， 干扰其翻译，抑制蛋白质表达，来降低或抑制由SYNGR4基因编码的SYNGR4蛋白的产生。如本文中证明的，在肺癌细胞系中SYNGR4的表达被与SYNGR4编码基因特异性退火的dsRNA 抑制(图3A)。因此本发明提供了有能力在导入表达SYNGR4基因的细胞后抑制SYNGR4基因表达的分离双链分子。所述双链分子的靶序列可通过siRNA设计算法来设计，例如下述的。
SYNGR4靶序列包括例如核苷酸 SEQ ID NO 11(位于 SEQ ID NO 13 的 389_407nt) SEQ ID NO :12(位于 SEQ ID NO 13 的 754_772nt) 具体地，本发明提供了下列双链分子[1]至[18] [1] 一种分离的双链分子，它当被导入细胞后，特异性抑制SYNGR4的表达，所述分子包含有义链以及与之互补的反义链，二者彼此杂交形成所述双链分子； [2] [1]中所述的双链分子，其中所述双链分子对SYNGR4mRNA作用，所述mRNA与选自下组的靶序列匹配SEQ ID NO 11(位于 SEQ ID NO 13 的 389_407nt)，SEQ ID NO 12 (位于 SEQ ID NO :13 的 754-772nt)； [3] [2]中所述的双链分子，其中所述有义链包括对应于选自下组的靶序列的序列=SEQ ID NO :11,12，19 和 20 ； [4] [3]中所述的双链分子，具有少于约100个核苷酸的长度； [5] [4]中所述的双链分子，具有少于约75个核苷酸的长度； [6] [5]中所述的双链分子，具有少于约50个核苷酸的长度； [7] [6]中所述的双链分子，具有少于约25个核苷酸的长度； [8] [7]中所述的双链分子，具有约19到约25个核苷酸的长度； [9] [1]中所述的双链分子，其由单一多核苷酸构成，所述多核苷酸包含通过间插单链连接在一起的有义链和反义链； [10] [9]中所述的双链分子，其具有通式5' _[A]-[B]-[A' ]_3'，其中，[Α]为包含与选自SEQ ID NO 11,12，19和20中的靶序列对应的序列的有义链，[B]为由3个 23个核苷酸构成的间插单链，[A']为包含与[A]互补的序列的反义链； [11] [1]中所述的双链分子，其由RNA构成； [12] [1]中所述的双链分子，其由DNA和RNA构成； [13] [12]中所述的双链分子，其中所述分子是DNA多核苷酸与RNA多核苷酸的杂合体； [14] [13]中所述的双链分子，其中所述有义链与反义链分别由DNA与RNA构成； [15] [12]中所述的双链分子，其中所述分子为DNA与RNA的嵌合体； [16] [15]中所述的双链分子，其中反义链3’端侧翼的区域为RNA，或者有义链5’端侧翼的区域与反义链3’端侧翼的区域均为RNA ； [17] [16]中所述的双链分子，其中所述侧翼区域由9到13个核苷酸组成； [18] [2]中所述的双链分子，其中所述分子包含3’突出端； 本发明所述的双链分子将在下面更详细描述。
设计具有抑制细胞内靶基因表达能力的双链分子的方法是已知的(见例如，美国专利No. 6，506，559，本文通过提述并入其全部内容)。例如，可以从Ambion网站(在万维网上 ambion. com/techlib/misc/siRNA finder, html)访问用于设计 siRNA 的计算机程序。
该计算机程序可以根据如下的规程选择双链分子的靶核苷酸序列。
靶点的诜择 1.从转录物的AUG起始密码子开始向下游扫描搜寻AA双核苷酸序列。记录每个 AA的出现及其3’侧相邻的19个核苷酸作为潜在siRNA靴点。Tuschl等建议避免针对5’ 和3’非翻译区(UTR)以及邻近起始密码子的区域(75个碱基之内)设计siRNA，因为这些区域可能更富含调节蛋白质的结合位点，而UTR结合蛋白和/或翻译起始复合物可能干扰 siRNA核酸内切酶复合物的结合。
2.将潜在靶点与合适的基因组数据库(人、小鼠、大鼠等)进行比较，将任何与其他编码序列具有显著同源性的靶序列排除在考虑之外。主要使用BLAST(Altschul SF 等，Nucleic Acids Res 1997Sep 1,25(17) :3389-402)，其可见于 NCBI 服务器:ncbi. nlm. nih.gov/BLAST/0 3.选择合格的靶序列用于合成。通常沿着待评估的基因的长度选择几个靶序列。
使用上述规程，设计本发明中分离双链分子的靶序列为下述 对SYNGR4 基因，SEQ ID NO :11、12、19 和 20， 分别对以上述靶序列为目标的双链分子检查其阻抑表达靶基因细胞生长的能力。 因此，本发明提供以选自下组的任何序列为靶标的双链分子 对于SYNGR4 基因，SEQ ID NO 11(位于 SEQ ID NO 13 的 389_407nt)，12 (位于 SEQ ID NO :13 的 754-772nt)，19(位于 SEQ ID NO 13 的 519_537nt)和 20(位于 SEQ ID NO 13 的 520-538nt)。
本发明的双链分子可以靶向单个SYNGR4基因序列，或可以靶向多个SYNGR4基因序列。
以上述靶序列SYNGR4基因为靶标的本发明的双链分子包括含有靶序列和/或靶序列之互补序列的任何核酸序列的分离多核苷酸。以SYNGR4基因为靶的多核苷酸例子包括那些含有序列SEQ ID NO 11,12，19或20和/或这些核苷酸的互补序列的多核苷酸 ’然而，本发明并不仅限于这些例子，且上述核酸序列中次要修饰是可以接受的，只要所述经修饰分子保留阻抑SYNGR4基因表达的能力。本文中，短语“次要修饰”当用于和核酸序列相关时表示对所述序列替换、缺失、添加或插入一个、两个或数个核酸。
在本发明的语境下，术语“数个”当用于核酸替换、缺失、添加和/或插入时可意指 3-7个，优选3-5个，更优选3-4个，进一步更优选是3个核苷酸残基。
根据本发明，本发明的双链分子可用实施例中使用的方法检测其能力。在本文中下述的实施例中，在体外对包含SYNGR4基因的mRNA不同部分的有义链或其互补的反义链的双链分子测验其在肺癌细胞系中(例如使用A549和SBC-幻降低SYNGR4基因产物产生的能力。进一步，例如，较之在没有候选分子情况下培养的细胞，在与候选双链分子接触的细胞中SYNGR4基因产物的减少可由，例如，使用在实施例1 “半定量RT-PCR”项中针对 SYNGR4mRNA的引物的RT-PCR来加以检测。然后，可对在体外基于细胞的分析中减少SYNGR4 基因产物的序列检测其针对肺癌细胞生长的抑制作用。然后可对在体外基于细胞的分析中抑制肺癌细胞生长的序列使用患肺癌动物检测其体内的相应能力，以证实SYNGR4产物的产生降低与肺癌细胞生长降低，所述动物的例子包括裸小鼠异种移植模型。
当所述分离多核苷酸是RNA及其衍生物时，核苷酸序列中的“t”应替换为“U”。本文中使用的术语“互补”指多核苷酸中核苷酸单元之间的Watson-Crick或Hoogsteen碱基配对，且术语结合意指两个多核苷酸间物理的或化学的相互作用。当所述多核苷酸包含修饰的核苷酸和/或非磷酸二酯酶联接时，这些多核苷酸亦可以同样地发生相互结合。一般而言，互补多核苷酸序列在合适条件下杂交以形成包含很少或没有错配的稳定双链体。进一步，本发明中所述分离多核苷酸的有义链与反义链可通过杂交形成双链分子或发夹环结构。在优选实施方案中，上述双链体在每10个匹配中包含不超过一个错配。在特别优选的实施方案中，双链体的链完全互补，这样的双链体不包含错配。
对SYNGR4所述多核苷酸长度优选少于1000个核苷酸。举例而言，对所述的所有基因，多核苷酸长度小于500、200、100、75、50或25个核苷酸。本发明中所述分离多核苷酸对形成针对SYNGR4基因的双链分子，或制备编码双链分子的模板DNA是有用的。当所述多核苷酸用于形成双链分子时，所述多核苷酸的有义链可长于19个核苷酸，优选长于21个核苷酸，且更加优选长度在约19与25个核苷酸之间。因而，本发明提供了包含有义链和反义链的双链分子，其中有义链包括与靶序列对应的核苷酸序列。在优选的实施方案中，有义链与反义链在靶序列处杂交以形成长度为19至25个核苷酸对的双链分子。
本发明中所述双链分子可包含一个或更多修饰核苷酸和/或非磷酸二酯连接。本领域众所周知的化学修饰具有增加所述双链分子的稳定性、可用性和/或细胞摄入的能力。一般技术人员明白本发明分子可包含的其它类型的化学修饰(W003/070744 ； W02005/045037)。在一个实施方案中，可使用修饰以提供改善的抗降解性或改善的摄入。 上述修饰的例子包括但不仅限于，硫代磷酸酯联接、2’-0_甲基核糖核苷酸(特别是在双链分子的有义链上)、2’ -脱氧-氟代核糖核苷酸、2’ -脱氧核糖核苷酸、“通用碱基”核苷酸、 5’ -C-甲基核苷酸以及倒转脱氧脱碱基残基的掺入(US20060122137)。
另一个实施方案中，可以使用修饰来增强双链分子的稳定性或增加寻靶效率。这样的修饰包括但不限于双链分子两条互补链之间的化学交联、双链分子一条链的3’或5’ 末端的化学修饰、糖修饰、核碱基修饰和/或骨架修饰、2-氟代修饰的核糖核苷酸和2’-脱氧核糖核苷酸(W02004/(^9212)。在另一个实施方案中，修饰可以用于增加或减少针对靶 mRNA中和/或互补双链分子链中互补核苷酸的亲和力(W02005/044976)。例如，未修饰的嘧啶核苷酸可以用2-硫、5-炔基(5-alkynyl)、5-甲基或5-丙炔基(5-propynyl)嘧啶替代。另外，未修饰的嘌呤可以用7-脱氮(7-deZa)、7-烷基或7-烯基嘌呤取代。在另一个实施方案中，当双链分子是具有3’突出端的双链分子时，可以把3’ -末端核苷酸的突出核苷酸替换成脱氧核糖核苷酸(Elbashir SM 等，Genes Dev 2001 Jan 15,15(2) :188-200)。 关于进一步的细节，可以利用公开文献如US20060234970。本发明不限于这些实例，可以将任何已知化学修饰应用于本发明的双链分子，只要所得分子保留抑制靶基因表达的能力。
此外，本发明的双链分子可以包含DNA和RNA 二者，例如dsD/R-NA或shD/R-NA。 具体而言，由DNA链与RNA链形成的杂合多核苷酸或DNA-RNA嵌合体多核苷酸表现出提高的稳定性。可以形成DNA和RNA的混合，即由DNA链(多核苷酸)和RNA链(多核苷酸) 组成的杂合型双链分子、或在任一单链(多核苷酸)或两条单链(多核苷酸)上同时包含 DNA和RNA的嵌合型双链分子，诸如此类，来增强所述双链分子的稳定性。
DNA链和RNA链的杂合体可以是这样的杂合体，其中有义链是DNA而反义链是 RNA,或者相反，只要它在导入表达靶基因的细胞中后能够抑制该基因表达。优选地，有义链多核苷酸是DNA而反义链多核苷酸是RNA。同样，嵌合型双链分子可以是其中的有义链和反义链均由DNA和RNA组成，或者有义链或反义链中的任一条由DNA和RNA组成，只要在导入表达靶基因的细胞中时，所述双链分子具有抑制该基因表达的活性即可。为了提高双链分子的稳定性，分子中优选包含尽可能多的DNA ；而为了诱导靶基因的表达抑制，要求分子在一定范围内是RNA，以充分地诱导表达抑制。
作为嵌合型双链分子的一个优选实例，双链分子的上游部分区域(即位于有义链或反义链内的靶序列或其互补序列之侧翼的区域)为RNA。优选地，所述上游部分区表示有义链的5’侧(5’端)和反义链的3’侧(3’端)。或者，将位于有义链5’末端侧翼或者反义链3’末端侧翼的区域称为上游部分区域。就是说，在优选实施方案中，反义链3’末端侧翼的区域由RNA组成，或者有义链5’末端侧翼的区域和反义链3’末端侧翼的区域均由 RNA组成。例如，本发明的嵌合型或杂合型双链分子包含以下组合。
有义链 5，_[—DNA—]_3， 3，-(RNA)-[DNA]-5， 反义链， 有义链 5，-(RNA)-[DNA]-3， 3，-(RNA)-[DNA]-5， 反义链，和 有义链 5，-(RNA)-[DNA]-3， 3，_(—RNA)_5， 反义链。
上游部分区优选是由9-13个核苷酸组成的域，从双链分子的有义链或反义链内的靶序列或其互补序列的末端算起。此外，这种嵌合型双链分子的优选实例包括这样的实例链长为19-21个核苷酸，其中多核苷酸的至少上游的半区(对于有义链为5’侧区域而对于反义链为3’侧区域)是RNA，而另一半是DNA。在这样的嵌合型双链分子中，抑制靶基因表达的效果比反义链整体为RNA时强得多(US20050004064)。
在本发明的语境中，双链分子可以形成发夹结构，例如短发夹RNA(ShRNA)以及由 DNA与RNA组成的短发夹(shD/R-NA)。shRNA或shD/R-NA是RNA序列或RNA和DNA的混合序列，其形成紧密的发夹转弯，可以用来通过RNA干扰来沉默基因表达。shRNA或shD/R-NA 在单一链上包含有义靶标序列和反义靶标序列，其中所述序列被环序列隔开。通常，发夹结构被细胞机制切割成dsRNA或dsD/R-NA，所述dsRNA或dsD/R-NA进一步与RNA诱导的沉默复合物(RNA-induced silencing complex, RISC)结合。这种复合物结合并切割与所述 dsRNA或dsD/R-NA的靶标序列匹配的mRNA。
为了形成发夹环结构，可以在有义序列与反义序列之间设置由任意核苷酸序列构成的环序列。因此，本发明还提供具有通式5’ -[A]-[B]-[A’ ]-3’的双链分子。式中，[A] 为有义链，包含与靶序列对应的序列；[B]为间插单链；[A']为反义链，包含与[A]互补的序列。靶序列例如可以选自以下的组对SYNGR4基因，SEQ ID NO :11，12，19和20。
本发明不限于这些实例，在双链分子保持抑制作为靶标的SYNGR4基因的表达的能力的前提下，[A]中的靶序列可以是在这些实例的基础上修饰而得到的序列。区域[A]与 [A']杂交而形成由区域[B]构成的环。间插单链部分[B]、即环序列，长度优选可以为3 23个核苷酸。例如，环序列可以选自由以下的序列组成的组(www. ambion. com/techlib/ tb/tb 506. html) ο此外，由23个核苷酸组成的环序列也提供活性siRNA(Jacque JM et al. , Nature 2002 Jul25,418(6896) :435-8, Epub 2002Jun 26) CCC、CCACC 或 CCACACC Jacque JM et al. , Nature 2002 Jul 25,418(6896) 435-8，Epub 2002 Jun 26 ； UUCG :Lee NS et al.，Nat Biotechnol 2002 May, 20 (5) :500-5 ；Fruscoloni P et al. , Proc Natl Acad Sci USA 2003 Feb 18,100(4) : 1639-44，Epub 2003 FeblO ； UUCAAGAGA =Dykxhoorn DM et al.，Nat Rev Mol Cell Biol 2003 Jun，4(6) 457-67。
优选的具有本发明的发夹环结构的双链分子实例如下所示。在下面的结构中，环序列可以选自由 AUG、CCC、UUCG、CCACC、CTCGAG、AAGCUU、CCACACC 和 UUCAAGAGA 组成的组； 但本发明不限于此 CAAGAUGGAGUCUCCGCAG-[B]-CUGCGGAGACUCCAUCUUG (对靶序列 SEQ ID NO 11)； AUGAUGCUCCA⑶CCCUUA-[B]-UAAGGGACUGGAGCAUCAU (对靶序列 SEQ ID NO 12)； CGCAUUGCCGGCACCCGCU-[B]-AGCGGGTGCCGGCAATGCG (对靶序列 SEQ ID NO 19)； GCAUUGCCGGCACCCGCUU-[B]-AAGCGGGTGCCGGCAATGC (对靶序列 SEQ ID NO 20)； 此外，为了增强双链分子的抑制活性，可以将核苷酸“U”添加到靶序列的反义链的 3’末端，作为3’突出端。添加的“U”的数目为至少2个，通常为2-10个，优选为2-5个。 添加的“U”在双链分子的反义链的3’末端形成单链。
对于双链分子的制备方法没有特殊限制，但优选采用本技术领域公知的化学合成方法。根据化学合成方法，分别合成有义和反义单链多核苷酸，然后采用适当的方法使它们退火到一起，来获得双链分子。退火的具体例子包括其中将合成的单链多核苷酸以优选至少约3 7、更优选约4 6、最优选基本上等摩尔量(即约5 5的摩尔比)的摩尔比混合。然后，将混合物加热到双链分子解离的温度，再缓慢冷却。经退火的双链多核苷酸可以采用本技术领域公知的常用方法来纯化。纯化方法的例子包括利用琼脂糖凝胶电泳的方法，或者其中任选地除去剩余的单链多核苷酸(例如利用适当的酶进行降解)的方法。
所述位于SYNGR4序列侧翼的调控序列可为相同或不同的，以使得它们的表达能够独立地，或者以时间性或空间性方式被调控。所述双链分子可通过将SYNGR4基因模板克隆入载体(例如含有来自小核RNA(snRNA)U6的RNA多聚酶III转录单元或人类HlRNA启动子的载体)以在胞内进行转录。
含有本发明双链分子的载体 本发明还包括含有一种或多种本文所述的双链分子的载体、以及包含该载体的细胞。
具体地，本发明提供了下列载体[1]至[10]。
[1] 一种载体，它编码当被导入细胞后，特异性抑制SYNGR4的表达的双链分子，所述分子包含有义链以及与之互补的反义链，二者彼此杂交形成所述双链分子。
[2] [1]中所述的载体，它编码对mRNA作用的双链分子，所述mRNA与选自下组的靶序列匹配:SEQ ID NO 11(位于 SEQ ID NO 13 的 389_407nt)，SEQ ID NO :12(位于 SEQ ID NO 13 的 754-772nt) ,SEQ ID NO :19(位于 SEQID NO 13 的 519_537nt)和 SEQ ID NO 20(位于 SEQ ID NO 13 的 520_538nt)； [3] [1]中所述的载体，其中有义链包括对应于选自下组的靶序列的序列SEQ ID NO :11,12，19 和 20 ； [4] [3]中所述的载体，它编码双链分子，其中双链分子的有义链与反义链在靶序列处杂交以形成长度小于约100个核苷酸的双链分子； [5] [4]中所述的载体，它编码双链分子，其中双链分子的有义链与反义链在靶序列处杂交以形成长度小于约75个核苷酸的双链分子； [6] [5]中所述的载体，它编码双链分子，其中双链分子的有义链与反义链在靶序列处杂交以形成长度小于约50个核苷酸的双链分子； [7] [6]中所述的载体，它编码双链分子，其中双链分子的有义链与反义链在靶序列处杂交以形成长度小于约25个核苷酸的双链分子； [8] [7]中所述的载体，它编码双链分子，其中双链分子的有义链与反义链在靶序列处杂交以形成长度为约19个至约25个核苷酸的双链分子； [9] [1]中所述的载体，其中所述双链分子由单一多核苷酸构成，所述多核苷酸包含通过间插单链连接在一起的有义链和反义链； [10] [9]中所述的载体，它编码具有通式5' -[A]-[B]-[A' ]_3'的双链分子，其中，[A]为包含与选自SEQ ID NO 11，12，19和20中的靶序列对应的序列的有义链，[B]为由3个至23个核苷酸构成的间插单链，[A']为包含与[A]互补的序列的反义链； 本发明的载体优选编码处于可表达的形式的本发明的双链分子。在本说明书中， 术语“处于可表达的形式”，是指该载体当被导入细胞中时，将表达该分子。在优选的实施方案中，载体包含双链分子表达所必需的调节元件。本发明的这种载体可以用于产生本发明的双链分子，也可以直接用作癌症治疗的活性成分。
或者，本发明提供了如下的载体，其包含包括有义链核酸和反义链核酸的多核苷酸组合中的任一，其中所述有义链核酸包括SEQ ID NO :11，12，19和20的核苷酸序列， 而所述反义链核酸由与有义链互补的序列，其中所述有义链和所述反义链的转录物彼此杂交以形成双链分子，且其中所述载体在导入表达SYNGR4基因的细胞中时抑制所述基因的表达。优选地，多核苷酸是长度为约19个至25个核苷酸的寡核苷酸(例如来自SEQ ID NO 13核苷酸序列的连续核苷酸)。更优选地，多核苷酸组合包括单一核苷酸转录物， 其包括经单链核苷酸序列相连接的有义链和反义链。更优选地，多核苷酸组合具有通式5' -[A]-[B]-[A' ]-3'，其中[A]是包括 SEQ ID NO :11，12，19 和 20 的核苷酸序列；[B] 是由约3个至约23个核苷酸组成的核苷酸序列；而[A']是与[A]互补的核苷酸序列。
本发明的载体可通过下述方法生成例如，将SYNGR4序列克隆入表达载体中，使调控序列可操作性地连接于SYNGR4序列，以允许两条链的表达(通过DNA分子的转录) (Lee NS et al.，Nat Biotechnol 2002 May, 20 (5) :500-5)。例如，与 mRNA 反义的 RNA 分子由第一启动子(例如位于克隆DNA的3’末端侧翼的启动子序列)转录，对mRNA而言为有义链RNA分子由第二启动子(例如位于克隆DNA的5’末端侧翼的启动子序列)转录。有义和反义链在体内杂交，产生用于沉默该基因的双链分子构建体。或者，使用分别编码双链分子之有义链和反义链的两个载体构建体来分别表达有义链和反义链，随后形成双链分子构建体。而且，克隆的序列可编码具有二级结构(例如发夹)的构建体，即，载体的单一转录物同时包含靶基因的有义序列和互补反义序列二者。
也可以配置本发明的载体使得其实现在靶细胞的基因组中的稳定插入(关于同源重组盒载体的说明，参见Thomas KR & Capecchi MR5Cell 1987,51 :503-12)。可以参考例如Wolff 等，Science 1990,247 :1465-8 ；美国专利第 5，580，859 号、第 5，589，466 号、 第 5，804，566 号、第 5，739，118 号、第 5，736，524 号、第 5，679，647 号和 WO 98/04720。基于DNA的输送技术的例子包括“裸DNA”、辅助(布比卡因(bupivicaine)、聚合物、肽介导型)输送、阳离子脂质复合体、和粒子介导型投递(“基因枪”)或压力介导型输送(例如参照美国专利第5，922，687号)。
本发明的载体包括，例如，病毒性载体或细菌性载体。表达载体的例子包括牛痘或鸡痘等减毒病毒宿主(参照美国专利第4，722，848号)。该策略涉及例如使用牛痘病毒作为载体来表达编码双链分子的核苷酸序列。重组牛痘病毒在被导入表达靶基因的细胞时即表达该分子并由此抑制细胞的增殖。可使用的载体的其它例子包括卡介苗(BCG)。BCG载体在Mover等，Naturel991，351 :456-60中有记载。其它多种多样的载体可用于双链分子的治疗性施用与生产，例子包括腺病毒载体和腺随伴病毒载体、逆转录病毒载体、伤寒沙门氏菌(Salmonella typhi)载体、脱毒的炭疽毒素载体等。可以参照例如Shata等，Mol Med Today 2000，6 :66-71 ;Shedlock 等，J Leukoc Biol 2000，68 :793-806 ；以及 Hipp 等，In Vivo 2000，14 :571-85。
#用本发日月双链分子抑泡丨或降低癌细朐,牛长及治疗癌症的方法 某些siRNA抑制NSCLC的能力之前已描述于W02005/89735，以引用的方式将其包含于本文中。在本发明中，测试了针对SYNGR4的两种不同的dsRNA抑制肺癌细胞生长的能力。所述两种针对SYNGR4的dsRNA(图3A、3B)有效地敲低(knock down) 了肺癌细胞系中基因的表达，同时亦发生了细胞增殖的阻抑。
因此，本发明提供了抑制肺癌细胞生长的方法，所述方法通过抑制SYNGR4的表达。SYNGR4基因表达可通过任何本领域已知方法，包括使用特异性地靶定SYNGR4基因的前述双链分子或可表达特异性地靶定SYNGR4基因的前述双链分子的载体来抑制。
上述本发明双链分子及载体抑制肺癌细胞细胞生长的能力提示其可用于治疗和/ 或预防肺癌的方法。因此，发明提供通过施用针对SYNGR4基因的双链分子或表达所述分子的载体来治疗罹患肺癌患者而无不良作用的方法，因为正常组织中没有SYNGR4基因过表达(图1A、2A和B)。
具体而言，本发明提供下列[1]至[36]的方法 [1] 一种用于抑制癌细胞生长和/或治疗癌症的方法，其中所述癌细胞或所述癌症过表达SYNGR4基因，该方法包括使细胞接触至少一种在过表达SYNGR4基因的癌细胞中特异性抑制该基因表达的分离的双链分子的步骤，由此抑制肺癌细胞生长和/或治疗肺癌。
[2] [1]的方法，其中所述双链分子对SYNGR4mRNA作用，所述mRNA与选自下组的靶序列匹配:SEQ ID NO 11(位于 SEQ ID NO 13 的 389_407nt)，SEQ ID NO :12(位于 SEQ ID NO 13 的 754-772nt) ,SEQ ID NO :19(位于 SEQID NO 13 的 519_537nt)和 SEQ ID NO 20(位于 SEQ ID NO 13 的 520_538nt)； [3] [2]的方法，其中有义链包含与选自SEQ ID NO 11，12，19和20的靶序列对应的序列； [4] [1]的方法，其中治疗的癌症是肺癌； [5] [4]的方法，其中所述肺癌是NSCLC或SCLC ； [6] [1]的方法，其中施用多种特异性抑制SYNGR4表达的双链分子； [7] [3]的方法，其中所述双链分子的有义链长度小于大约100个核苷酸； [8] [7]的方法，其中所述双链分子的有义链长度小于大约75个核苷酸； [9] [8]的方法，其中所述双链分子的有义链长度小于大约50个核苷酸； [10] [9]的方法，其中所述双链分子的有义链长度小于大约25个核苷酸； [11] [10]的方法，其中所述双链分子的有义链长度为大约19个至大约25个核苷酸； [12] [1]的方法，其中所述双链分子由单一多核苷酸构成，所述多核苷酸包含通过间插单链连接在一起的有义链和反义链； [13] [12]的方法，其中所述双链分子具有通式5' -[A]-[B]-[A' ]_3'，其中， [A]为包含与选自SEQ ID NO 11,12，19和20中的靶序列对应的序列的有义链，[B]为由3 个 23个核苷酸构成的间插单链，[A']为包含与[A]互补的序列的反义链； [14] [1]的方法，其中所述双链分子是RNA ； [15] [1]的方法，其中所述双链分子包含DNA和RNA ； [16] [15]的方法，其中所述双链分子是DNA多核苷酸与RNA多核苷酸的杂合体； [17] [16]的方法，其中所述有义与反义链多核苷酸分别由DNA与RNA构成； [18] [15]的方法，其中所述双链分子是DNA与RNA的嵌合体； [19] [18]的方法，其中反义链3’端侧翼的区域由RNA构成，或者有义链5’端侧翼的区域与反义链3’端侧翼的区域均由RNA构成； [20] [19]的方法，其中所述侧翼区域由9到13个核苷酸组成； [21] [1]的方法，其中所述双链分子包含3’突出端； [22] [1]的方法，其中所述双链分子包含于组合物中，所述组合物除所述分子外还包括转染增强剂和药学上可接受的载体。
[23] [1]的方法，其中所述双链分子由载体编码； [24] [23]的方法，其中由所述载体编码的所述双链分子对mRNA作用，所述mRNA 与选自下组的靶序列匹配SEQ ID NO :11(位于SEQ ID NO 13的389_407nt)，SEQ ID NO:12 (位于 SEQ ID NO :13 的 754-77&it)，SEQ ID NO :19(位于 SEQ ID NO : 13 的 519_537nt) 和 SEQ ID NO :20(位于 SEQ ID NO :13 的 520_538nt)； [25] [24]的方法，其中由所述载体编码的所述双链分子的有义链包含与选自SEQ ID NO 11,12，19和20的靶序列对应的序列。
[26] [23]的方法，其中要治疗的癌症是肺癌； [27] [26]的方法，其中所述肺癌是NSCLC或SCLC ； [28] [23]的方法，其中施用多种双链分子； [29] [25]的方法，其中由所述载体编码的所述双链分子的有义链长度小于大约 100个核苷酸； [30] [29]的方法，其中由所述载体编码的所述双链分子的有义链长度小于大约 75个核苷酸； [31] [30]的方法，其中由所述载体编码的所述双链分子的有义链长度小于大约 50个核苷酸； [32] [31]的方法，其中由所述载体编码的所述双链分子的有义链长度小于大约 25个核苷酸； [33] [32]的方法，其中由所述载体编码的所述双链分子的有义链长度在大约19 个与大约25个核苷酸之间； [34] [23]的方法，其中由所述载体编码的所述双链分子由单一多核苷酸构成，所述多核苷酸包含通过间插单链连接在一起的有义链和反义链； [35] [34]的方法，其中由所述载体编码的所述双链分子具有通式 5' -[A]-[B]-[A' ]-3'，其中，[A]为包含与选自SEQ ID NO :11，12，19和20中的靶序列对应的序列的有义链，[B]为由3个至23个核苷酸构成的间插单链，[A']为包含与[A] 互补的序列的反义链；和 [36] [23]的方法，其中由所述载体编码的所述双链分子包含于组合物中，所述组合物除所述分子外还包括转染增强剂和药学上可接受的载体。
本发明方法将在下面更加详细的加以描述。
可通过将细胞与同SYNGR4基因特异性退火的双链分子、表达该分子的载体或包含同样分子的组合物接触来抑制表达SYNGR4基因的细胞的生长。可进一步将所述细胞与转染剂接触。合适的转染剂在本领域是已知的。短语“抑制细胞生长”表示所述细胞较之未暴露于所述分子的细胞，以较低速率增殖或具有降低的存活力。细胞生长可通过本领域已知技术测定，包括例如使用MTT细胞增殖测定。
任何种类的细胞的生长均可根据本方法进行阻抑，只要所述细胞表达或过表达 SYNGR4，即本发明所述双链分子的靶基因。可作为例子的细胞包括肺癌细胞，包括NSCLC和 SCLC ._‘者.ο 因此，对于正罹患或有风险发生部分地由SYNGR4过表达所引起或促进的疾病的患者，可通过施用至少一种本发明双链分子、表达至少一种所述分子的至少一种载体或包含至少一种所述分子的至少一种组合物进行治疗。举例而言，肺癌患者可根据本发明的方法进行治疗。癌症类型可通过根据所诊断的特定类型肿瘤的标准方法来进行鉴定。肺癌可通过，例如，癌胚抗原(CEA)、CYFRA、pro-GRP等等作为肺癌标志，或通过胸部X光和/或痰细胞学进行诊断。更优选地，用本发明所述方法治疗的患者是用这样的方法选出的在来自患者的活检物中通过RT-PCR或免疫测定法检测SYNGR4的表达。优选地，在本发明的治疗之前，对于来自受试者的所述活检标本通过本领域所知的方法，例如，免疫组织化学分析或 RT-PCR，证实SYNGR4基因的过表达。
根据本发明的方法，为抑制肺癌细胞生长并藉此治疗肺癌，当施用多种所述双链分子(或表达同样分子的载体或含有同样分子的组合物)时，每个所述分子可具有不同结构，但作用于与SYNGR4的相同靶序列匹配的mRNA。或者，多种双链分子可作用于与SYNGR4 基因内的不同靶序列匹配的mRNA，或作用于与不同基因的不同靶序列匹配的mRNA。举例而言，所述方法可使用针对SYNGR4的双链分子。或者，例如，本方法可利用针对SYNGR4编码序列内的一个，两个或更多靶序列的双链分子。
为抑制肺癌细胞生长，本发明的双链分子可直接以可实现该分子与对应mRNA转录物结合的形式导入细胞。另外，如上所述，编码双链分子的DNA可作为载体导入细胞。 为将双链分子和载体导入细胞，可使用转染增强剂，例如FuGENE(Roche diagnostics), Lipofectamine 2000 (Invitrogen)、Oligofectamine (Invitrogen)与 Nucleofector (Wako pure Chemical)。
术语“特异性抑制”在抑制性多核苷酸和多肽的语境中指与除SYNGR4以外的多核苷酸和多肽的表达或生物学功能相比，药剂或配体优先抑制SYNGR4表达或生物学功能的能力。特异性抑制通常导致相对于背景至少约2倍的抑制，优选大于约10倍且最优选大于 100倍的抑制10倍表达(例如转录或翻译)或测量到的生物学功能(例如细胞生长或增殖、抑制凋亡、来自SYNGR4的细胞内信号传导)。表达水平和/或生物学功能可以在比较经处理的与未处理的细胞，或处理之前的与之后的细胞群体的背景下测量。在一些实施方案中，SYNGR4的表达或生物学功能被完全抑制。通常，特异性抑制是使用适宜的统计学检验， 有统计学意义的SYNGR4表达或生物学功能降低(例如ρ < = 0. 05)。
当治疗导致临床效益，诸如受试者中SYNGR4基因表达的减少、癌症的尺寸、患病率(prevalence)、或转移潜力的降低，可以认为该治疗是“有效”的。当预防性地适用治疗时，“有效”是指其延迟或防止癌症形成，或者预防或缓解癌症的临床症状。有效性结合特定肿瘤类型的任何公知的诊断或治疗方法来加以确定。
应理解，本发明的所述双链分子降解亚化学计量的SYNGR4mRNA。虽不愿拘于任何理论，认为本发明的所述双链分子以催化方式造成靶mRNA的降解。因此，与常规的癌症疗法相比，为实施治疗效应而需要输送到癌症的位置或其附近的双链分子要少得多。
本领域技术人员在考虑了受试者的体重、年龄、性别、疾病类型、症状及其它条件、 施用途径、以及是局部施用还是全身施用等因素的基础上，能够容易地确定本发明的双链分子的有效量。一般而言，本发明双链分子的有效量是在癌症部位或其附近胞内浓度为大约1纳摩尔(nM)到约ΙΟΟηΜ，优选大约2nM到大约50nM,更优选大约2. 5nM到大约IOnM0 考虑可使用更多或更少量的双链分子。本领域一般技术人员可方便地及常规地确定特定情况下所需的确切剂量。
本发明的方法可用于抑制表达SYNGR4的癌症，例如肺癌，尤其是NSCLC或SCLC，的生长或转移。具体而言，含有SYNGR4(即SEQ ID NO :11，12，19或20)靶序列的双链分子特别优选用来治疗肺癌。
为了治疗癌症，还可以将本发明的双链分子与不同于所述双链分子的药剂组合来施用于受试者。或者，本发明的双链分子还可以与其它旨在用于癌症治疗的治疗方法组合来施用于受试者。举例而言，本发明所述双链分子可与现在用于治疗癌症或预防癌症转移的治疗方法(例如，放射疗法，外科手术，以及使用化疗剂，如顺钼、卡钼、环磷酰胺、5-氟尿嘧啶、阿霉素、柔红霉素(daunorubicin)或他莫昔芬(tamoxifen)等的治疗)组合施用。
在本发明的方法中，双链分子可以裸双链分子的形式、以与投递试剂相组合的形式，或者以表达双链分子的重组质粒或者病毒载体的形式施用于受试者。
用于与本发明的双链分子组合施用的合适的投递试剂包括Mirus Transit TKO脂溶性试剂、Lipofectin、Lipofectamine、Cellfectin、或聚阳离子(例如聚赖氨酸)、或脂质体。一种优选的投递试剂是脂质体。
脂质体能够帮助将双链分子投递至特定的组织如肺肿瘤组织中，还能够增加双链分子的血中半衰期。适合在本发明中使用的脂质体是由常规的囊泡形成性脂质 (vesile-forming lipids)形成的，囊泡形成性脂质通常包括中性或带负电荷的磷脂，以及甾醇，诸如胆固醇。对一些因素的考虑通常可以为脂质的选择提供指导，如期望的脂质体大小以及在血流中的脂质体的半衰期等。有多种制备脂质体的方法是公知的，例如Szoka 等，Ann Rev Biophys Bioengl980，9 :467 ；美国专利第 4，235，871 号；第 4，501，728 号；第 4，837，028号；第5，019，369号；将上述文献的全部内容援引并入本说明书。
优选地，包被本发明的双链分子的脂质体包含能够将脂质体输送至癌症部位的配体分子。优选的配体是与肿瘤或血管内皮细胞中常见的受体结合的配体，例如与肿瘤抗原或内皮细胞表面抗原结合的单克隆抗体 具体地，包被本发明的双链分子的脂质体经过了修饰以免被单核巨噬细胞和网状内皮系统清除，例如，由于其结构的表面结合有调理作用抑制部分(opsonization inhibition moities)。在一个实施方案中，本发明的脂质体可以同时包括调理作用抑制部分和配体。
用于制备本发明的脂质体的调理作用抑制部分通常是与脂质体膜结合的大型亲水性聚合物。如在本说明书中所使用的，例如，当调理作用抑制部分化学地或物理地搭接在脂质体膜上时，例如通过脂溶性锚(anchor)插入膜本身，或者通过与膜脂质的活性基团直接结合，则调理作用抑制部分与脂质体膜“结合”。这些调理作用抑制性亲水性聚合物形成保护性表层，该表层显著地减少巨噬-单核细胞系统(“MMS”)和网状内皮系统(”RES”) 对脂质体的摄入；在例如美国专利第4，920，016号中对此有记载，后者的全部公开内容援引并入本说明书。因此，与未修饰的脂质体相比，被调理作用抑制部分修饰过的脂质体能够保留在血液循环中的时间显著更长。出于以上理由，这样的脂质体有时也被称为“隐形，，(stealth)脂质体。
已知隐形脂质体蓄积在依靠多孔性或“渗漏性”微血管系统供给的组织中。因此， 在以这样的微血管系统缺损为特征的靶组织，例如实体瘤中，这些脂质体会高效率地蓄积。 参见 Gabizon 等，Proc Natl Acad Sci USA 1988,18:6949-53。此外，RES 的摄入的减少阻止隐形脂质体在肝脏和脾脏中的显著蓄积，从而降低隐形脂质体的毒性。因此，用调理作用抑制部分修饰的本发明的脂质体能够将本发明的双链分子输送至肿瘤细胞。
适用于修饰脂质体的调理作用抑制部分优选为分子量约500 约40，000道尔顿、更优选约2，000 约20，000道尔顿的水溶性聚合物。这样的聚合物中包括聚乙二醇(PEG)或聚丙二醇(PPG)衍生物；例如，甲氧基PEG或PPG、和PEG或PPG硬脂酸酯； 合成聚合物如聚丙烯酰胺或聚N-乙烯基吡咯烷酮；直链状、分枝状或者树状聚酰胺胺 (polyamidoamine)；聚丙烯酸；聚醇(polyalchohols)，诸如化学结合有羧基或氨基的聚乙烯醇和聚木糖醇，以及神经节苷脂，诸如神经节苷脂GM115 PEG、甲氧基PEG、或甲氧基PPG或其衍生物的共聚体也是适合的。此外，抑制调理作用的聚合物可以是PEG与聚氨基酸、多糖、聚酰胺胺、聚亚乙基胺或者多核苷酸中的任何一种的嵌段共聚物。抑制调理作用的聚合物也可以是含有氨基酸或羧酸的天然多糖，例如半乳糖醛酸、葡糖醛酸、甘露糖醛酸、透明质酸、果胶酸、神经氨酸、海藻酸、角叉胶；氨基化多糖类或寡糖(直链状或者分枝状)；或者羧基化的多糖或寡糖，例如，通过与碳酸的衍生物反应而生成了羧基结合的羧基化多糖类或寡糖。
优选地，调理作用抑制部分为PEG、PPG或其衍生物。用PEG或PEG衍生物修饰的脂质体有时称为“PEG化脂质体”。
调理作用抑制部分可以通过许多公知技术中的任何一种结合到脂质体膜上。例如，PEG的N-羟基琥珀酰亚胺酯能够与磷脂酰乙醇胺脂溶性锚(lipid-soluble anchor)结合，然后再结合到膜上。相似地，可以通过还原性氨基化，用硬脂酰胺脂溶性锚来将右旋糖酐聚合物衍生化，所述还原性氨基化中使用Na (CN) BH3和混合溶剂，如60°C的四氢呋喃与水的30 12比例混合物。
上文讨论了表达本发明的双链分子的载体。这样的表达至少一种本发明的双链分子的载体也可以直接施用或者与合适的投递试剂组合施用，所述合适的投递试剂包括 Mirus Transit LTl 亲脂性试剂、Lipofectin、Lipofectamine、Cellfectin、聚阳离子(例如聚赖氨酸)或脂质体。将表达本发明的双链分子的重组病毒载体输送到患者的癌症区域的方法在本技术领域的技术范围内。
本发明的双链分子可以通过适于将双链分子递送到癌症部位的任何手段来施用给受试者。例如，双链分子可以通过基因枪、电穿孔、或者其它合适的非消化道或肠内施用途径来施用。
合适的肠内施用途径包括口腔、直肠、吸入与鼻内递送。
合适的非消化道施用途径包括血管内施用(例如静脉内推注、静脉内输注、动脉内推注、动脉内输注和针对血管网络的导管滴注)，组织周围和组织内注射(例如肿瘤周围和肿瘤内注射)，皮下注射或沉积，包括皮下输注(例如利用浸透压泵)，直接施加到癌症部位或其附近的区域，例如借助导管或其它放置装置(例如，包含多孔性、非多孔性或明胶状材料的栓剂或植入物)，和吸入。优选通过注射或输注将双链分子或载体施用到癌症部位或其附近。
本发明的双链分子可以以单一剂量或分多个剂量来施用。当本发明的双链分子的施用为输注方式时，输注可以是单个持续剂量，或者通过多次输注来施用。优选的是将药剂直接注射到癌症部位或其附近的组织中。特别优选的是将药剂多次注射到癌症部位或其附近的组织中。
本领域技术人员可以容易地确定用于对给定受试者施用本发明双链分子的合适剂量方案。例如，双链分子可以一次性施用给受试者，例如以单次注射或者沉积的形式施用到癌症部位或其附近。或者，双链分子可以在约3 约观日、更优选约7 约10日的期间内每日一次或二次地施用给受试者。在优选的剂量方案中，双链分子可以在7日期间内一日一次地注射到癌症部位或其附近。当剂量方案包括多次施用时，应该理解的是，给受试者施用的双链分子的有效量，可以包含在整个剂量方案中施用的该双链分子的总量。
包含本发明双链分子的组合物 除上述外，本发明亦提供了包含至少一种本发明的双链分子或编码该分子的载体的药物组合物。具体而言，本发明提供下述[1]至[36]的组合物 [1] 一种用于抑制癌细胞生长并治疗癌症的组合物，其中所述癌细胞与癌症过表达SYNGR4基因，所述组合物包括至少一种分离的抑制SYNGR4表达以及细胞增殖的双链分子，该分子包括有义链和与其互补的反义链，二者相互杂交以形成双链分子。
[2][1]中的组合物，其中所述双链分子作用于mRNA，所述mRNA与选自下组的靶序列匹配SEQ ID NO :11(位于 SEQ ID NO 13 的 389_407nt)，SEQID NO :12(位于 SEQ ID NO: 13 的 754-772nt)，SEQ ID NO :19(位于 SEQ IDNO 13 的 519_537nt)和 SEQ ID NO :20(位于 SEQ ID NO 13 的 520_538nt)。
[3] [2]的组合物，其中所述双链分子，其中有义链包含与选自下组的靶序列相应的序列:SEQ ID NO :11,12，19 和 20。
[4] [1]的组合物，其中需治疗的癌症是肺癌； [5] [4]的组合物，其中所述肺癌是NSCLC或SCLC ； [6] [1]的组合物，其中所述组合物包含多种所述双链分子； [7] [3]的组合物，其中所述双链分子的有义链长度小于大约100个核苷酸； [8] [7]的组合物，其中所述双链分子的有义链长度小于大约75个核苷酸； [9] [8]的组合物，其中所述双链分子的有义链长度小于大约50个核苷酸； [10] [9]的组合物，其中所述双链分子的有义链长度小于大约25个核苷酸； [11] [10]的组合物，其中所述双链分子的有义链长度为大约19个到大约25个核苷酸； [12] [1]的组合物，其中所述双链分子由单一多核苷酸构成，所述多核苷酸包含通过间插单链连接在一起的有义链和反义链； [13] [12]的组合物，其中所述双链分子具有通式5' -[A]-[B]-[A' ]_3'，其中， [A]为包含与选自SEQ ID NO 11，12，19和20中的靶序列对应的序列的有义链序列，[B]为由3个 23个核苷酸构成的间插单链，[A']为包含与[A]互补的序列的反义链； [14] [1]的组合物，其中所述双链分子是RNA ； [15] [1]的组合物，其中所述双链分子是DNA和/或RNA ； [16] [15]的组合物，其中所述双链分子是DNA多核苷酸与RNA多核苷酸的杂合体； [17] [16]的组合物，其中所述有义链多核苷酸与反义链多核苷酸分别由DNA与 RNA组成； [18] [15]的组合物，其中所述双链分子是DNA与RNA的嵌合体； [19] [18]的组合物，其中反义链3’端侧翼的区域由RNA组成，或者有义链5’端侧翼的区域与反义链3’端侧翼的区域均由RNA组成； [20] [19]的组合物，其中所述侧翼区域由9到13个核苷酸组成； [21] [1]的组合物，其中所述双链分子包含3’突出端； [22] [1]的组合物，其中所述组合物包括转染增强剂和药学上可接受的载体。
[23] [1]的组合物，其中所述双链分子由载体编码并包含于组合物中； [24] [23]中的组合物，其中由所述载体编码的所述双链分子作用于mRNA，所述 mRNA与选自下组的靶序列匹配=SEQ ID NO :11(位于SEQ IDNO 13的389_407nt)，SEQ ID NO :12(位于 SEQ ID NO 13 的 754_77&it)，SEQID NO :19(位于 SEQ ID NO 13 的 519_537nt) 和 SEQ ID NO :20(位于 SEQ IDNO 13 的 520_538nt)； [25] [24]的组合物，其中由所述载体编码的所述双链分子的有义链包含与选自下组的靶序列相应的序列=SEQ ID NO 11,12，19和20 ； [26] [23]的组合物，其中需治疗的癌症是肺癌； [27] [26]的组合物，其中所述肺癌是NSCLC或SCLC ； [28] [23]的组合物，其中施用多种所述双链分子； [29] [25]的组合物，其中由所述载体编码的所述双链分子的有义链长度小于大约 100个核苷酸； [30] [29]的组合物，其中由所述载体编码的所述双链分子的有义链长度小于大约 75个核苷酸； [31] [30]的组合物，其中由所述载体编码的所述双链分子的有义链长度小于大约 50个核苷酸； [32] [31]的组合物，其中由所述载体编码的所述双链分子的有义链长度小于大约 25个核苷酸； [33] [32]的组合物，其中由所述载体编码的所述双链分子的有义链长度为大约 19个至大约25个核苷酸； [34] [23]的组合物，其中由所述载体编码的所述双链分子由单一多核苷酸构成， 所述多核苷酸包含通过间插单链连接在一起的有义链和反义链二者； [35] [23]的组合物，其中所述双链分子具有通式5' -[A]-[B]-[A' ]_3'，其中， [A]为包含与选自SEQ ID NO 11,12，19和20中的靶序列对应的序列的有义链，[B]为由3 个 23个核苷酸构成的间插单链，[A']为包含与[A]互补的序列的反义链；和 [36] [23]的组合物，其中所述组合物包含转染增强剂和药学上可接受的载体。
本发明合适的组合物将在下面更加详述地加以描述。
本发明的所述双链分子优选在施用于受试者之前根据本领域众所周知的技术配制为药物组合物。本发明的药物组合物特征为至少是无菌且不含热原的。本文中所使用的 “药物配制剂”包括适用于人类与兽医用的配制剂。制备本发明药物组合物的方法属于本领域一般技术，例如，描述于 Remington :The Science and Practice of Pharmacy, 21st ed., Lippincott, Williams and ffilkins. (2005)，其全部公开内容通过引用包含于本文中。
本发明的药物配制剂包含至少一种本发明的双链分子或编码它们的载体(例如， 以重量计为0. 到90% )，或所述分子的生理学上可接受的盐，与生理上可接受的载体介质混合。生理学上可接受的载体介质优选水、缓冲水、生理盐水、0. 4%盐水、0. 3%甘氨酸、 透明质酸及类似物。
37 根据本发明，所述组合物可包含多种双链分子，其中每一个均可针对SYNGR4的相同或不同的靶序列。举例而言，所述组合物可包含针对SYNGR4的双链分子。或者，例如，所述组合物可包含针对选自SYNGR4 —种、两种或更多种靶序列的双链分子。
而且，本组合物可以包含编码1个或多个双链分子的载体。例如，所述载体可以编码1种、2种或数种本双链分子。或者，本组合物可以包含多种载体，而各载体编码不同的双链分子。
而且，本双链分子可以作为脂质体的形式包含在本组合物中。脂质体的详细内容可以参照“使用双链分子治疗癌症的方法”项。
本发明的药物组合物中还可以包含传统的药用赋形剂和/或添加剂。合适的药用赋形剂包括稳定化剂、抗氧化剂、浸透压调节剂、缓冲剂、和PH调节剂。合适的添加剂包括 生理学生物相容性的缓冲剂(例如氨基丁三醇盐酸盐)、补加螯合剂(例如DTPA或DTPA-双酰胺等)，或钙螯合剂复合物(例如、钙DTPA、CaNaDTPA-双酰胺)，或者，任选地，补加钙或钠盐(例如氯化钙、抗坏血酸酸钙、葡糖酸钙或乳酸钙)。本发明的药物组合物可以进行包装以便作为液体使用，或者也可以加以冷冻干燥。
对于固体组合物，可以使用常规的无毒固态载体；例如，药物级的甘露醇、乳酸、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、滑石、纤维素、葡萄糖、蔗糖、碳酸镁等。
例如，用于口服施用的固体药物组合物中可以包含上述列举的任意载体和赋形剂，以及10-95%，优选25-75%的本发明的一种或多种双链分子。用于气雾剂(吸入)施用的药物组合物可以包含0.01-20重量％、优选1-10重量％的包被于上述脂质体中的一种或多种本发明的双链分子，以及推进剂。还可以根据需要包含载体，例如用于鼻内投递的卵磷脂等。
除上述之外，本组合物中还可以包含其它药学活性成分，只要它们不抑制本双链分子的体内功能。例如，上述组合物中可以包含常规用于癌症治疗的化疗药物。
在其它实施方案中，本发明还提供本发明的双链核酸分子在制备用于治疗以过表达SYNGR4为特征的肺癌的药物组合物中的用途。例如，本发明涉及下述双链核酸分子在制备用于治疗过表达SYNGR4的肺癌的药物组合物中的用途该分子在细胞内抑制SYNGR4基因的表达，且该分子包含有义链和与之互补的反义链，二者彼此杂交而形成该双链核酸分子，且该分子以选自SEQ ID NO: 11，12，19和20的序列为靶标。
此外，本发明还提供生产用于治疗部分由过表达SYNGR4引起或促进的癌症，例如以过表达SYNGR4为特征的肺癌的药物组合物的方法或工艺。该方法或工艺包括将药学或者生理学可接受的载体与作为活性成分的下述双链核酸分子一起制剂化的步骤，其中所述双链核酸分子抑制细胞内SYNGR4的表达，且该分子包含有义链和与之互补的反义链，二者彼此杂交而形成该双链核酸分子，且该分子以选自SEQ ID NO :11，12，19和20的序列为靶标。
在另一个实施方案中，本发明还提供生产用于治疗部分由过表达SYNGR4引起或促进的癌症，例如以表达SYNGR4为特征的肺癌的药物组合物的方法或工艺，其中所述方法或工艺包括将活性成分与药学上或生理学上可接受的载体混合的步骤，其中所述活性成分是这样的双链核酸分子，其在过表达SYNGR4基因的细胞中抑制SYNGR4的表达，该分子包含有义链与与其互补的反义链，二者相互杂交以形成双链核酸分子，并以选自SEQ ID NO 11,12，19和20的序列为靶标。
诊断肺癌的方法 发现SYNGR4的表达在肺癌细胞中特异性的提高(图1)。因此，本文鉴定出的基因及其转录与翻译产物可以作为肺癌标志用于诊断，且通过测量肺组织样品中SYNGR4的表达可诊断肺癌。具体而言，本发明提供了通过确定受试者中SYNGR4表达水平诊断肺癌的方法。可用本方法诊断的肺癌包括NSCLC与SCLC。进一步地，NSCLC，包括肺腺癌与肺鳞状细胞癌(SCC)，亦可通过本发明诊断或检测出来。
根据本发明，可提供用于检查受试者状况的中间结果。所述中间结果可与其它信息结合起来以协助医生、护士或其它从业人员诊断患者罹患所述疾病。另外，本发明亦可用于来源于患者的组织中检测出癌性细胞，并为医生提供对诊断罹患所述疾病的患者有用的 fn息ο 或者，本发明提供了一种用于检测或鉴定源自受试者的肺组织样品中癌细胞的方法，所述方法包括测定源自受试者的生物样品中SYNGR4基因表达水平的步骤，其中所述表达水平与所述基因的正常对照水平相比的升高指示肺组织中存在或怀疑存在癌细胞。
此类结果可以与别的信息组合来帮助医生、护士、或其它保健从业人员诊断受试者患有疾病。换言之，本发明可以给医生提供有用信息来诊断受试者患有疾病。例如，依照本发明，当关于自受试者获得的组织中癌细胞的存在有疑问时，通过考虑SYNGR4基因的表达水平，加上疾病的其他不同方面，包括组织病理学、血液中的已知肿瘤标志物的水平、和受试者的临床过程等，能做出临床决策。例如，一些公知的血液中的诊断性肺肿瘤标志物为 IAP,ACT, BFP，CA19-9, CA50, CA72-4，CA130，CEA，KMO-1，NSE，SCC，SP1，Span-I，TPA，CSLEX， SLX, STN和CYFRA。就是说，在本发明的这个具体实施方案中，基因表达分析的结果作为中间结果，用于进一步诊断受试者的疾病状态。
在另一个实施方案中，本发明提供了一种用于检测癌症之诊断标志物的方法，所述方法包括检测源自受试者的生物样品中SYNGR4基因表达作为肺癌诊断标志物的步骤。 具体而言，本发明提供了下述[1]到[10]的方法 [1] 一种诊断肺癌的方法，所述方法包括下述步骤 (a)检测生物样品中编码SYNGR4氨基酸序列的基因的表达水平； (b)将检测出的表达水平较之该基因的正常对照水平的提高与疾病的存在相关联； [2] [1]的方法，其中所述表达水平比正常对照水平高至少10% ； [3] [1]的方法，其中所述表达水平通过选自下组的方法检测
(a)检测包含SYNGR4序列的mRNA ； (b)检测包含SYNGR4氨基酸序列的蛋白质； (c)检测包含SYNGR4氨基酸序列的蛋白质的生物学活性； [4] [1]的方法，其中所述肺癌为NSCLC或SCLC。
[5] [3]的方法，其中所述表达水平是通过检测探针与该基因的基因转录物杂交的方法确定的； [6] [3]的方法，其中所述表达水平是通过检测抗体与该基因编码的蛋白的结合作为所述基因的表达水平来确定的； [7] [1]的方法，其中所述生物样品包括活检物、痰或血液。
[8] [1]的方法，其中所述源自患者的生物样品包含上皮细胞。
[9] [1]的方法，其中所述源自患者的生物样品包含癌细胞。
[10] [1]的方法，其中所述源自患者的生物样品包含癌性上皮细胞。
诊断肺癌的方法将在下面更加详细的加以叙述。
用本方法诊断的受试者优选为哺乳动物。哺乳动物的例子包括但不仅限于，例如， 人类，非人灵长类、小鼠、大鼠、犬、猫、马以及牛。
为实施诊断，优选从要诊断的受试者采集生物样品。任何生物学材料均可作为生物样品用于测定，只要其包括目标的SYNGR4转录或翻译产物。所述生物样品包括，但不仅限于，想要诊断或怀疑患有癌症的身体组织与体液，例如活检，血液，血清，血浆，唾液，痰， 胸腔积液与尿液。生物样品优选含有这样的细胞群体，该群体包括上皮细胞，更优选癌性上皮细胞或源自怀疑为癌性的组织(例如肺组织)的上皮细胞。进一步，如果必要，可从所得的身体组织与体液中纯化所述细胞，并将其用为生物样品。
根据本发明，测定在所述源自患者的生物样品中SYNGR4的表达水平。表达水平可在转录产物(核酸)水平确定，使用本领域熟知的方法。举例而言，SYNGR4的mRNA可通过杂交方法(例如，Northern杂交)使用探针定量。可在芯片或阵列上实施所述检测。对检测多个基因(例如，多种癌症特异性基因)，包括SYNGR4，的表达水平而言，优选使用阵列。 本领域技术人员可利用SYNGR4(SEQ ID NO 13 ；GenBank登录号NM_012451)的序列信息制备上述探针。举例而言，SYNGR4的cDNA可用作探针。如需要，所述探针可用合适的标记物例如染料、荧光或同位素来标记，且所述基因的表达水平可以作为发生杂交的标记物的强度来加以检测。
进一步，SYNGR4的转录产物可通过基于扩增的检测技术(例如，RT-PCR)使用引物定量。上述引物亦可基于所述基因已知的序列信息制备。举例而言，用于实施例的引物 (SEQ ID N0:7和8)可用于通过RT-PCR或Northern印迹的检测，但本发明并不仅限于此。
具体而言，本方法所用的探针或引物在严格条件、中等严格条件与低严格条件下与SYNGR4的mRNA杂交。本文所用的短语“严格(杂交)条件”是指这样的条件，在该条件下，探针或引物将与其靶序列杂交，但不与其它序列杂交。严格条件是依赖于序列的，在不同的环境下会不同。较长序列的特异杂交与较短序列相比在较高温度下发生。一般地，严格条件的温度选择为比特定序列在限定的离子强度和PH下的热熔点(Tm)低大约5°C。Tm 是(在限定的离子强度、PH和核酸浓度下)平衡状态下有50%的与靶序列互补的探针与靶序列杂交的温度。因为靶序列一般过量存在，因此在Tm下，平衡时50%的探针被占据。典型地，严格条件是这样的其中盐浓度小于大约1. OM钠离子，典型地大约0. 01-1. OM钠离子 (或其它盐)，pH7. 0-8. 3，温度对于较短的探针或引物(例如10-50个核苷酸)是至少大约 30°C，用于较长的探针或引物是至少大约60°C。严格条件也可以通过添加去稳定剂例如甲酰胺来实现。
或者，本发明的诊断可以通过检测翻译产物来进行。例如，可以确定SYNGR4蛋白的量。测定作为翻译产物的蛋白量的方法包括免疫测定法，此类方法使用特异识别所述蛋白的抗体。抗体可以是单克隆或多克隆的。而且，抗体的任何片段或修饰(例如嵌合抗体、 scFv、Fab、F(ab' )2、Fv等)均可用于检测，只要该片段保留对SYNGR4蛋白的结合能力即可。制备这些类型的用于检测蛋白的抗体的方法是本领域众所周知的，并且在本发明中可以使用任何方法制备这些抗体和它们的等价物。
作为另一种基于SYNGR4的翻译产物检测其基因的方法，可利用针对SYNGR4蛋白的抗体通过免疫组织化学分析观察其染色的强度。即，观察到强染色表明所述蛋白质的存在增加，且同时表明SYNGR4的高表达水平。
另外，除SYNGR4基因的表达水平外，亦可确定其它癌症相关基因，例如已知在肺癌中有差异表达的基因的表达水平，以提高所述诊断的准确性。SYNGR4的表达水平还可以与细胞和/或组织的癌性或癌变前状态的病理学确定关联起来。
对于包括SYNGR4基因在内的癌症标志基因而言，如果其较之相应的癌症标志基因的对照水平增加了例如10^,25%或50%的话，或增加到超过1. 1倍，超过1.5倍，超过 2. 0倍，超过5. 0倍，超过10倍或者更多，则可认为其在生物样品中的表达水平是增加的。
对照水平可以与测试生物样品同时确定，使用先前从疾病状态(癌性或非癌性) 已知的受试者收集和保存的样品。或者，对照水平可以借助统计方法，根据通过分析先前测定的来自疾病状态已知的受试者的样品的SYNGR4基因表达水平获得的结果加以确定。进一步，对照水平可以是来自先前测试过的细胞的表达模式数据库。而且，根据本发明的一个方面，可以将生物样品中SYNGR4基因的表达水平与从多个参考样品确定的多个对照水平比较。优选地使用从来自与源自患者的样品组织类型相似的组织类型(例如肺组织)的参考样品确定的对照水平。而且，优选地，使用具有已知的疾病状态的群体中SYNGR4基因表达水平的标准值。标准值可以通过本领域已知的任何方法获得。例如，平均值+/-2S.D.或平均值+/-3S.D.的范围可以用作标准值。
在本发明的语境下，从已知非癌性的生物样品确定的对照水平称作“正常对照水平”。另一方面，如果对照水平从癌性生物样品确定，则称作“癌性对照水平”。
当SYNGR4基因的表达水平相比正常表达水平有所提高或与癌性对照水平相似， 则受试者可诊断为正罹患或有风险发生癌症。进一步，当比较多种癌症相关基因的表达水平时，样品与癌性参照之间基因表达模式的相似性表明受试者正罹患或有风险发生癌症。
测试生物样品的表达水平与对照水平间的差异，可以相对已知表达水平不会随着细胞的癌或非癌状态改变的对照核酸(例如管家基因)的表达水平加以标准化。示例对照基因包括，但不仅限于，β -肌动蛋白、甘油醛-3磷酸脱氢酶和核糖体蛋白Pl。
评价癌症预后的方法 本发明部分涉及下列发现，即SYNGR4表达与具有肺癌的患者较差预后显著相关。 因此，本发明提供确定或评价罹患部分由过表达SYNGR4引起或促进的癌症，尤其是肺癌患者预后的方法，所述方法在患者生物样品中检测SYNGR4表达水平；将测得的表达水平与对照水平比较；并确定与正常对照水平相比升高的SYNGR4表达水平为不良预后(不良的存活率)的指示。在其它实施方案中，测得与癌性对照水平相比相似或升高的SYNGR4表达水平为不良预后的指示。
在此，术语“预后“指根据病例的性质与症状表明的关于所述疾病的可能结果以及从疾病中恢复的前景。相应地，不利的、负面的、或不良的预后定义为较低的治疗后存活期间与存活率。相反，正面的、有利的、或良好的预后定义为治疗后存活期间或存活率提高。
术语“评价预后”指预测、预告或将给定检测或测量与患者癌症的将来结果(例如，恶性，治愈癌症的可能性、存活率等)相联系。举例而言，确定SYNGR4经时的表达水平使预测患者结果(例如，恶性的增加或减少，癌症等级的增加或减少，治愈癌症的可能性、 存活率等)成为可能。
在本发明的语境下，短语“评价(或确定)预后”意欲涵盖癌症的预测与可能性分析、进展、特别是癌症复发、转移扩散与疾病复发。目前评价预后的方法意欲用于临床以对关于治疗方法作出决定，包括治疗介入、诊断标准例如疾病的分期，以及针对肿瘤疾病的转移与复发的疾病监视和监测。
本方法所用源自患者的生物样品可为任何源自要评价的受试者的样品，只要 SYNGR4可在样品中检测出来。源自患者的生物样品可以是源自受试者，例如已知具有或怀疑具有肺癌的患者的任何样品。所述生物样品优选肺细胞(从肺获得的细胞)。进一步，所述生物样品可包括体液例如痰、血液、血清或血浆。另外，所述样品可为从组织纯化的细胞。 生物样品可在不同的时点自患者获取，包括治疗前，治疗中和/或治疗后。
根据本发明，显示在源自患者的生物样品中SYNGR4基因的表达水平越高，治疗后病情缓和、恢复和/或存活的预后就越为不良，且不良临床后果的可能性就越高。因此，根据本方法，用作比较的“对照水平”可为，例如，在治疗后显示良好或积极的癌症预后的个体或个体组成的群体中的任何SYNGR4基因的表达水平，在此称之为“良好预后对照水平”。此外，所述“对照水平”可为，例如，在治疗后显示不良或消极的癌症预后个体或个体组成的群体中的任何SYNGR4基因的表达水平，在此称之为“不良预后对照水平”。所述“对照水平” 是源自自单一参照群体的单一表达模式，或者是多种表达模式。因此，所述对照水平可基于在其疾病状态(良好或不良预后)已知的癌症患者中，或癌症患者的群体中，在进行任何种类治疗之前的SYNGR4基因的表达水平。癌症优选为肺癌。优选使用在疾病状态已知的患者集合中的SYNGR4基因的表达水平的标准值。所述标准值可通过任何本领域已知的方法获得。举例而言，平均值+/-2倍标准偏差或平均值+/-3倍标准偏差的范围可用作标准值。
所述对照水平可以与所测试的生物样品同时确定，这通过使用先前从已知其疾病状态(良好或不良预后)的患者(对照或对照组)在接受任何种类的治疗之前采集并储藏的样品来实现。
或者，所述对照水平可通过统计学方法基于通过分析先前从对照组收集或储藏的样品中的SYNGR4基因表达水平来确定。进一步，所述对照水平可为源自先前测试的细胞的表达模式数据库。
另外，根据本发明的一个方面，可将生物样品中SYNGR4基因的表达水平与多种对照水平进行比较，所述对照水平是从多种参照样品确定的。优选使用从与源自患者的生物样品类似组织类型所得的参照样品确定的对照水平。
根据本发明，SYNGR4基因的表达水平与良好预后对照水平的相似性显示所述患者较理想的预后，而相对良好预后对照水平表达水平的增加显示较不理想的、较不良的治疗后病情缓和、恢复、存活和/或临床后果的预后。另一方面，相比于不良预后对照水平 SYNGR4表达水平的减少显示患者较理想的预后，而与不良预后对照水平相似的表达水平显示较不较理想的、较不良的治疗后病情缓和、恢复、存活和/或临床后果的预后。
当相对对照水平表达水平变化超过1. 0,1. 5,2. 0,5. 0,10. 0或更多倍时，生物样品中的SYNGR4基因表达水平可认为是改变了。
42 所试生物样品与对照水平间表达水平的差异可相对于对照，例如持家基因，加以标准化。举例而言，已知其表达水平在癌性与非癌性细胞中不变的多核苷酸，包括那些编码 β-肌动蛋白、甘油醛-3-磷酸脱氢酶与核糖体蛋白Pl的基因，可用于标准化SYNGR4基因表达水平。
表达水平可通过在源自患者的生物样品中利用本领域众所周知的技术检测基因转录物来确定。所述通过本方法检测的基因转录物既包括转录产物也包括翻译产物，例如 mRNA与蛋白质。
举例而言，SYNGR4基因的转录产物可通过使用针对基因转录物的SYNGR4基因探针进行杂交，例如Northern印迹杂交分析来加以检测。所述检测可在芯片或阵列上进行。 对检测多种基因包括SYNGR4基因的表达水平，优选使用阵列。作为另一个示例，基于扩增的检测方法，例如使用SYNGR4基因特异性的引物基于逆转录的聚合酶链式反应可用于检测(参见实施例)。SYNGR4基因特异性探针或引物可使用常规技术通参照SYNGR4基因的全序列(SEQ ID NO 1)设计和制备。举例而言，在实施例中使用的引物(SEQ ID N0:1和 2)可用于通过RT-PCR检测，但本方面并不仅限于此。
具体而言，本方法所用的探针或引物在严格条件、中等严格条件或低严格条件下与SYNGR4的mRNA杂交。如本文中所使用的，短语“严格(杂交)条件”指探针或载体会与其靶序列杂交，但不与其它序列杂交的条件。严格条件依赖于序列，且在不同情况下不同。 观察到长序列较之较短序列在更高温度下特异性杂交。一般而言，严格条件的温度选为大约比特定序列在给定离子强度与PH值下的热熔点温度(Tm)低大约5摄氏度。所述Tm是 50%互补于靶序列的探针与靶序列在平衡条件下杂交的温度(在给定离子强度、pH与核酸浓度下)。因为所述靶序列通常过量存在，在Tm时50%的探针在平衡时被占据。通常，严格条件是在该条件下盐浓度低于大约1. OM钠离子，通常为0. 01到1. OM钠离子(或其它盐)，？!17.0到8.3，且温度对短探针或引物(例如，10到50个核苷酸)为至少30摄氏度， 而对较长探针与引物为至少大约60摄氏度。严格条件亦可通过添加去稳定剂例如甲酰胺来达成。
或者，本发明的评价亦可通过检测翻译产物来进行。举例而言，可确定SYNGR4的量。确定作为翻译产物的蛋白质的量的方法包括使用特异性识别SYNGR4蛋白的抗体的免疫测定方法。所述抗体可为单克隆的或多克隆的。进一步，任何所述抗体的片段或修饰(例如，嵌合抗体、scFv、Fab、F(ab' )2、Fv等等)均可用于检测，只要所述片段保留与SYNGR4 蛋白的结合能力。制备此类用于检测蛋白的抗体的方法在本领域是众所周知的，本发明中可以使用任何方法制备这样的抗体及其等价物。
作为另一种基于SYNGR4翻译产物来检测其基因的表达水平的方法，可通过免疫组织化学分析利用针对SYNGR4蛋白质的抗体观察其染色的强度。即，观察到强染色表明 SYNGR4的存在量增加，且同时表明SYNGR4基因的高表达水平。
进一步，已知SYNGR4蛋白具有细胞增殖活性。因此，SYNGR4基因的表达水平可使用上述细胞增殖活性作为指标来确定。举例而言，在生物样品存在下制备并培养表达 SYNGR4的细胞，随后通过检测预定时间段中的增殖程度或测定细胞周期或集落形成能力， 可确定所述生物样品的细胞增殖活性。
另外，除SYNGR4基因的表达水平外，亦可确定其它肺癌相关基因，例如已知在肺癌中有差异表达的基因，的表达水平，以提高所述评价的准确性。上述其它的肺细胞相关基因的实例包括那些于本文中描述的和于W02004/031413和W02005/090603中描述的基因。 将它们的内容以引用方式纳入于本文中。
或者，根据本发明，除其它测试结果外，还可提供用于评价受试者预后的中间结果。所述中间结果可协助医生、护士或其它从业人员评价、确定或估计受试者的预后。可与本发明所得中间结果结合考虑的其它信息包括受试者的临床症状和身体状况。
需根据本方法评价癌症预后的患者优选为哺乳动物，包括人、非人灵长类、小鼠、 大鼠、犬、猫、马和牛。
诊断癌症或评价癌症预后的试剂盒 本发明提供了诊断癌症或评价癌症预后的试剂盒。所述癌症优选肺癌。具体而言，所述试剂盒包含至少一种在源自患者的生物样品中检测SYNGR4基因表达的试剂，所述试剂可选自下组 (a)检测SYNGR4基因的mRNA的试剂； (b)检测SYNGR4的蛋白质的试剂； (c)检测SYNGR4的蛋白质的生物学活性的试剂。
适于检测SYNGR4基因的mRNA的试剂包括特异性结合或识别SYNGR4mRNA的核酸，诸如具有与SYNGR4mRNA的一部分互补的序列的寡核苷酸。这类寡核苷酸的例子有对 SYNGR4mRNA为特异性的引物与探针。可基于本领域众所周知的方法制备这类寡核苷酸。如果需要，可将用于检测SYNGR4mRNA的试剂固定化在固体支持物，例如珠子、阵列芯片、多孔条等上。另外，在所述试剂盒中可包括多于一种检测SYNGR4mRNA的试剂。
适于检测SYNGR4蛋白质的试剂包括针对SYNGR4蛋白质的抗体。所述抗体可为单克隆的或多克隆的。进一步，任何所述抗体的片段或修饰(例如，嵌合抗体、scFv, Fab, F(ab' )2、Fv等等)均可用作所述试剂，只要所述片段保留与SYNGR4蛋白的结合能力。为检测蛋白制备此类抗体的方法在本领域是众所周知的，且在本发明中可使用任何方法制备上述抗体及其等价物。进一步，所述抗体可用能产生信号的分子通过直接连接或间接标记技术进行标记。标记物与标记抗体以及检测抗体与其靶的结合的方法在本领域是众所周知的，且本发明可使用任何标记物与方法。另外，在所述试剂盒中可包括多于一种检测SYNGR4 蛋白质的试剂。
进一步，所述生物学活性可通过，例如，测量所述生物样品中由于SYNGR4蛋白质表达而导致的细胞增殖活性来确定。举例而言，在源自患者的生物样品的存在下培养所述细胞，然后通过检测增殖的速度，或测量细胞周期或集落形成能力，可确定在有和无SYNGR4 蛋白表达的情况下所述生物样品的细胞增殖活性。如需要，可将用于检测SYNGR4mRNA的试剂固定化在固体支持物上。另外，在所述试剂盒中可包括多于一种检测SYNGR4蛋白质的生物学活性的试剂。
所述试剂盒可包含多于一种前述的试剂。进一步，所述试剂盒可包括固体支持物以及用于结合针对SYNGR4基因的探针或针对SYNGR4蛋白质的抗体的试剂，用于培养细胞的培养基与容器，阳性与阴性对照试剂，以及用于检测针对SYNGR4蛋白质的抗体的第二抗体。举例而言，从具有良好预后或不良预后的患者获取的组织样品可用作有用的对照试剂。 本发明的试剂盒可进一步包括其它从商业和用户角度而言期望的材料，包括缓冲液、稀释液、滤器、针头、注射器和带有使用说明的装箱单(例如，书面的、磁带、CD-ROM等等)。这些试剂之类的包含在带有标签的容器中。合适的容器包括瓶、管状瓶(vials)和试管。所述容器可从多种材料制得，例如玻璃或塑料。
作为本发明的一个实施方案，当所述试剂是针对SYNGR4mRNA的探针时，所述试剂可固定化于固体支持物例如多孔条上，以形成至少一个检测位点。所述多孔条的测量或检测区域可包含多个位点，每个都包含核酸(探针)。测试条亦可包含阴性和/或阳性对照的位点。或者，对照位点可位于与测试条不同的条上。任选地，不同的检测位点可包含不同量的固定化核酸，即，在第一个检测位点上量较大而在接下来的位点上量较小。在加入测试样品之后，显示可检测信号的位点的数量提供了在样品中存在的SYNGR4mRNA量的定量指征。 所述检测位点可配置为具有任何合适地可检测的形状，通常是横跨测试条宽度的条状或点状。
本发明的试剂盒可进一步包括阳性对照或SYNGR4标准样品。本发明的的阳性对照样品可通过收集SYNGR4阳性血液样品，随后测定其SYNGR4水平来制备。或者，可将纯化的SYNGR4蛋白或多核苷酸添加到不含SYNGR4的血清中以形成所述阳性样品或SYNGR4标准品。
抗肺癌化合物的筛选 在本发明的语境中，待通过本筛选方法鉴定的药剂可以是任何化合物或包含数种化合物的组合物。而且，根据本发明筛选方法暴露于细胞或蛋白的测试剂可以是单个化合物或多个化合物的组合。当在方法中使用化合物组合时，各化合物可以顺次或同时加以接触。
任何测试剂，例如，细胞提取物、细胞培养上清、发酵微生物产物、海洋生物提取物、植物提取物、纯化或粗蛋白质、肽、非肽化合物、合成微分子化合物(包括核酸构建体， 例如反义RNA、siRNA、核酶以及适体等等)以及天然化合物，均可用于本发明的筛选方法中。也可使用本领域熟知的很多组合文库方法中的任何途径来获得本发明的测试剂，包括 (1)生物文库，(2)空间可寻址平行固相或液相文库(spatially addressable parallel solid phase or solution phase libraries), (3)需要角军卷禾只(deconvolution)的合成文库法，⑷“一珠一化合物”(“one-bead one-compound")文库法，以及(5)使用亲和色谱选择的合成文库法。使用亲和色谱选择的生物文库法限于肽文库，而其它四种途径适用于肽、非肽寡聚物或化合物小分子文库(Lam(1997)Anticancer Drug Des. 12 :145-67)。合成分子文库方法的例子可在现有技术中找到(DeWitt et al.，Proc Natl Acad Sci USA 1993,90 :6909-13 ；Erb et al.，Proc Natl Acad Sci USA 1994,91 :11422-6 ；Zuckermann et al.，J Med Chem 37 :2678-85,1994；Cho et al.，Science 1993，261 :1303-5 ；Carell et al. ,Angew Chem Int Ed Engl 1994,33 :2059 ；Carell et al. ,Angew Chem Int Ed Engl 1994,33 2061 ；Gallop et al.，J Med Chem 1994,37 1233-51)。化合物文库可提供于溶液中(参见 Houghten，Bio/techniques 1992,13 :412-21)或珠子上(Lam, Nature 1991,354 82-4)、芯片上(Fodor, Nature 1993，364 :555-6)、细菌上(美国专利 5，223，409)、孢子上 (美国专利 5，571，698 ；5，403，484 与 5，223，409)、质粒上(Cull et al.，Proc Natl Acad Sci USA 1992，89 :1865-9)或噬菌体上(Scott and Smith, Science 1990，249 :386-90 ； Devlin, Science 1990,249 :404-6 ；Cwirla et al. , Proc Natl Acad Sci USA 1990,87 6378-82 ；Felici, J Mol Biol 1991，222 :301-10 ；美国专利申请 2002103360)。
通过本发明任何筛选方法筛选到的化合物的一部分结构通过添加、删除、和/或置换方式被转换而得到的化合物，包括在通过本发明筛选方法鉴定的药剂之内。
此外，当所筛选的测试剂是蛋白质时，为了获得编码该蛋白的DNA，可以确定蛋白的全部氨基酸序列，以此推定该编码蛋白的核酸序列，或者可以分析所得蛋白的部分氨基酸序列，根据该序列制备寡DNA作为探针，并用该探针筛选cDNA文库，以获得编码该蛋白的 DNA。对所得的DNA确认其在制备治疗或预防癌症的候选物测试剂中的有用性。
对本文描述筛选为有用的测试样品亦可为特异性结合SYNGR4蛋白或其缺乏原蛋白的体内生物学活性的部分肽的抗体。
尽管测试剂文库的构建是本领域众所周知的，在下文中还是进一步提供了鉴定测试剂和构建用于本筛选方法的这些测试剂的文库的指导。
( )分子津樽 对具有目标性质的化合物的分子结构和/或对SYNGR4的分子结构的知识为人们构建测试剂文库提供了便利。预筛选适于进一步评估的受试药剂的方法之一，是对受试药剂与其靶标的相互作用进行计算机建模。
计算机建模技术为选定分子的三维原子结构的可视化以及会与该分子相互作用的新化合物的合理设计提供了可能。三维构建典型地依赖于来源于选定分子的χ-射线晶体分析或NMR成像的数据。分子动力学需要力场数据。计算机图形系统为预测新化合物如何连接靶分子，以及实验操作化合物和靶分子的结构以完善结合特异性提供了可能。为了预测当分子和化合物之一或二者都发生细小改变时分子-化合物相互作用是什么样的，需要分子力学软件和计算密集型计算机，它们通常耦联着分子设计程序和用户之间的用户友好的、菜单驱动的界面。
上文一般性描述的分子建模系统的一个实例包括CHARMm和QUANTA程序，Polygen Corporation, ffaltham, Mass。CHARMm执行能量最小化和分子动力学功能。QUANTA执行构建、图形建模和分子结构分析。利用QUANTA可进行分子相互行为的互动性构建、修饰、可视化和分析。
有多篇文献综述了与特异蛋白相互作用的药物的计算机建模，例如Rotivinen et al.Acta Pharmaceutica Fennica 1988,97 :159-66 ；Ripka, New Scientist 1988,54—8; McKinlay & Rossmann,Annu Rev Pharmacol Toxiciol1989, 29 :111-22 ；Perry & Davies, Prog Clin Biol Res 1989，291 :189—93 ;Lewis& Dean， Proc R Soc Lond 1989,236 125-40,141-62 ；以及关于核酸组分模型受体的 Askew et al.，JAm Chem Soc 1989, 111 1082-90。
其它可筛选并图形描述化学物质的计算机程序可以从例如Mississauga， Ontario, Canada 的 BioDesign, Inc.，Pasadena, Calif.，Allelix, Inc &司、Cambridge, Ontario 的Hypercube，Inc.等公司获取。见例如 DesJarlais et al.，J Med Cheml988，31 722-9 ；Meng et al.，J Computer Chem 1992,13 :505-24；Meng et al.，Proteins 1993， 17 :266-78 ；Shoichet et al.，Science 1993,259 1445-50 一旦鉴定出推定的抑制剂，可使用组合化学技术基于鉴定出的推定抑制剂的化学结构构建任何数量的变体，如下所述。所得的推定抑制剂，或“测试剂”文库，可使用本发明
46的方法筛选，以鉴定治疗或预防肺癌的测试剂。
(ii)组合化学合成 测试剂的组合文库可以作为合理药物设计程序的一部分来制备，合理药物设计程序涉及有关已知抑制剂中存在的核心结构的知识。这种策略使得文库可以保持合理的规模，便于进行高通量筛选。或者，可通过简单地合成构成文库的分子家族的所有排列，来构建简单的，特别是短的、聚合物性的分子文库。后一种方法的一个实例是由所有长度为6个氨基酸组成的肽文库。这种肽文库包含所有6氨基酸序列排列。这种类型的文库称作线性组合化学文库。
组合化学文库的制备是本领域技术人员所熟知的，可以通过化学或生物合成来产生。组合化学文库包括，但不仅限于，肽文库(见例如美国专利5，010，175 ；Furka, Int J Pept Prot Res 1991,37 :487-93 ；Houghten et al.，Naturel991，354 :84_6)。也可以使用其它用于产生化学多样性文库的化学。这些化学包括，但不仅限于，肽(例如PCT公布WO 91/19735)，被编码的肽(例如W093/20242)，随机生物寡聚体(例如WO 92/00091)， 苯并二氮卓(benzodiaz印ines)(例如美国专利5，观8，514)，diversomer如乙内酰脲、苯并二氮卓和二肽(DeWitt et al. , Proc Natl Acad Sci USA 1993，90 :6909-13)，插烯化 (vinylogous)多肽(Hagihara et al.，J Amer Chem Soc 1992，114 :6568)，具有葡萄糖骨架(scaffolding)的非肽类肽模拟物(Hirschmann et al.，J Amer Chem Soc 1992， 114 :9217-8)，小化合物文库的模拟物有机合成(analogous organic synthese) (Chen et al. , J. Amer Chem Soc 1994，116 :2661)，寡聚氨基甲酸盐(Cho et al.，Sciencel993， 261 1303)，和 / 或Jft酰膦酸酯(ρ印tidylphosphonates) (Campbell et al.，JOrg Chem 1994,59 658),核酸文库(见 Ausubel, Current Protocols in Molecular Biology 1995-2009ffiley Interscience ；Sambrook et al. , Molecular Cloning :A Laboratory Manual, 3rd Ed, 2001, Cold Spring Harbor Laboratory, New York，USA)，肽核酸文库(见例如美国专利 5，539，083)，抗体文库(见例如 Vaughan et al.，Nature Biotechnology 1996,14(3) :309-14和PCT/US96/10287)，碳水化合物文库(见例如Liang et al. ,Science 1996,274 =1520-22 ；美国专利5，593，85 ，和有机小分子文库(见例如苯并二氮卓，Gordon EM. Curr Opin Biotechnol. 1995Dec 1 ；6 (6) :624-31 ；类异戊二烯(isoprenoids)，美国专利5，569，588 ；噻唑烧酮(thiazolidinones)和偏硫杂氮杂环己烧(metathiazanone)，美国专利5，549，974 ；吡咯烷(pyrrolidines)，美国专利5，525，735和5，519，134 ；吗啉代化合物，美国专利5，506，337 ；苯并二氮卓，5，288，514 ；等)。
用于制备组合文库的设备是可商购的(见例如357MPS，390MPS，Advanced Chem Tech, Louisville KY, Symphony, Rainin, Woburn, ΜΑ,433A Applied Biosystems, Foster City, CA, 9050Plus, Millipore, Bedford, MA)。此外，有多种组合文库本身也是商业可得的 (见例如 ComGenex, Princeton, N. J. , Tripos, Inc. , St. Louis, M0, 3D Pharmaceuticals, Exton, PA, Martek Biosciences, Columbia, MD,等等)。
(iii)其它候选物 另一种手段是使用重组细菌噬菌体来产生文库。使用“噬菌体方法”(Scott & Smith, Science 1990,249 :386-90 ；Cwirla et al. , Proc Natl Acad Sci USA 1990, 87 :6378-82 ；Devlin et al.，Science 1990，249 :404-6)，可以构建非常大的文库(例如106-108个化学实体)。再一种手段主要使用化学方法，其实例包括Geysen方法(Geysen et al.,Molecular Immunology 1986,23 :709-15 ；Geysen et al. ,J Immunologic Method 1987,102 :259-74)和 Fodor 等的方法(Science 1991,251 :767-73)。Furka 等(14th International Congress of Biochemistry 1988, Volume#5, Abstract FR :013 ；Furka, Int J P印tide Protein Resl991，37 :487-93)，Houghten (美国专利 4，631，211)和 Rutter 等(美国专利5，010，175)记载了产生肽混合物的方法，可以将这些肽作为激动剂或拮抗剂加以测试。
适体是由紧密结合特定分子靶的核酸构成的大分子。Tuerk和GolcKScience. 249 505-510(1990))披露了 SELEX(通过指数式富集进行的配体系统性进化)方法来选择适体。 在SELEX方法中，核酸分子的大型文库(例如1015种不同分子)可用于筛选。
SYNGR4结合化合物的筛选 在本发明中，在肺癌中检测出SYNGR4的过表达，而SYNGR4在正常器官中未观察到表达(图1与2)。因此，本发明提供了使用SYNGR4基因、该基因编码的蛋白，来筛选结合的 SYNGR4化合物的方法。由于肺癌中SYNGR4的表达，与SYNGR4结合的化合物期待可阻抑肺癌细胞的增殖，并因此对治疗或预防肺癌是有用的。因此，本发明亦提供了使用SYNGR4多肽筛选阻抑肺癌细胞增殖的化合物的方法，以及筛选治疗或预防肺癌的化合物的方法。具体而言，该筛选方法的一个实施方案包括以下步骤 (a)将测试化合物与由SYNGR4的多核苷酸所编码的多肽接触； (b)检测所述多肽与所述测试化合物之间的结合活性；和 (c)选择结合所述多肽的测试化合物。
在本发明中，揭示了阻抑SYNGR4表达可降低肺癌细胞生长。因此，通过筛选结合 SYNGR4多肽的候选化合物，可鉴定出可用于治疗或预防肺癌的候选化合物。候选化合物治疗或预防肺癌的有用性可通过二次和/或更进一步筛选来评估以鉴定用于肺癌的治疗剂。
依照本发明，可评估测试药剂或化合物抑制肺癌细胞生长或者候选药剂或化合物治疗或预防部分由SYNGR4表达引起或促进的疾病(“SYNGR4相关疾病”)的治疗效果。因此，本发明亦提供了使用SYNGR4多肽或其片段来筛选用于抑制细胞生长的候选药剂或化合物或者用于治疗或预防SYNGR4相关疾病的候选药剂或化合物的方法，其包括以下步骤 a)将测试药剂或化合物与SYNGR4多肽或其功能性片段接触； b)检测所述多肽或其功能性片段与所述测试化合物之间的结合活性；并 c)将b)的结合活性与所述测试药剂或化合物的治疗效果关联起来。
在本发明中，治疗效果可以与对SYNGR4多肽或其功能性片段的结合活性关联起来。例如，当某种测试药剂或化合物结合SYNGR4多肽或其功能性片段时，可将所述测试药剂或化合物鉴定或选择为具有治疗效果的候选药剂或化合物。或者，当某种测试药剂或化合物不结合SYNGR4多肽或其功能性片段时，可将所述测试药剂或化合物鉴定为没有显著治疗效果的药剂或化合物。
本发明的筛选方法将在下面更加详细的加以描述。
需用于筛选的SYNGR4多肽可为重组多肽，或者是来自自然界的蛋白质，或其部分肽。与测试化合物接触的多肽可以是，例如，纯化的多肽、可溶蛋白质、与载体结合的形式、 或者与其它多肽融合的融合蛋白。
作为使用SYNGR4多肽来筛选蛋白质，例如与SYNGR4多肽结合的蛋白质的方法， 可使用本领域已知的任何方法。上述筛选可通过，例如，免疫沉淀方法，尤其是如下述的方式进行。通过将编码SYNGR4多肽的基因插入外源基因表达载体，例如pSV2ne0、pcDNAI、 pcDNA3. UpCAGGS与ρ⑶8，在宿主(例如，动物)细胞等中表达该基因。
为此表达所用的启动子可为任何通常可使用的启动子，包括，例如，SV40早期启动子(Rigby in Williamson(ed. ), Genetic Engineering, vol.3. Academic Press, London, 83-141 (1982))、EF-alpha启动子(Kim et al. ,Gene 91 :217-23 (1990))、CAG启动子(Niwa et al.，Gene 108 :193(1991)), RSV LTR 启动子(Cullen，Methods in Enzymology 152 684-704(1987))、SR alpha 启动子(Takebe et al. ,Mol Cell Biol 8 :466 (1988))、CMV 立即早期启动子(Seed and Aruffo, Proc Natl Acad Sci USA 84:3365-9(1987))、SV40 晚期启动子(Gheysen and Fiers, J Mol Appl Genet 1 :385-94(1982))、腺病毒晚期启动子 (Kaufman et al.，Mol Cell Biol 9 :946 (1989))、HSV TK 启动子等等。
将所述导入宿主细胞以表达外源基因可根据任何方法实施，例如电穿孔方法 ((Chu et al. ,Nucleic Acids Res 15 131116 (1987))、磷酸钙方法(Chen and Okayama, Mol Cell Biol 7 :2745-52 (1987))、DEAE 葡聚糖方法(Lopata et al.，Nucleic Acids Res 12 :5707-17(1984) ；Sussman and MiIman, Mol Cell Biol 4 1641-3(1984)), Lipofectin 方法(Deri jard B. , Cell 76 :1025-37 (1994) ；Lamb et al. , Nature Genetics 5 :22-30(1993) =Rabindran et al.，Science 259 :230-4(1993))等等。
对于由SYNGR4基因编码的多肽，可以把特异性已知的单克隆抗体的识别位点(表位)导入该多肽的N或C端，从而将该多肽表达为包含该表位的融合蛋白。可以使用商品化的表位-抗体系统(Experimental Medicine 13 :85-90 (1995)) 能够利用其多克隆位点表达与例如半乳糖苷酶、麦芽糖结合蛋白、谷胱甘肽S转移酶和绿色荧光蛋白(GFP) 形成的融合蛋白的载体是可商购的。另外，还报道了如下的融合蛋白，其通过导入仅由数个到十二个(a dozen)氨基酸构成的小型表位加以制备，使融合不会改变SYNGR4多肽的性质。可以使用例如多组氨酸(His-标签)、流感凝集素HA、人c-myc、FLAG、水泡性口炎病毒糖蛋白(VSV-GP)、T7基因10蛋白(Τ7-标签)、人单纯疱疹病毒糖蛋白(HSV-标签)、Ε_标签(单克隆噬菌体上的表位)等表位，和识别它们的单克隆抗体作为筛选与SYNGR4多肽结合的蛋白质的表位-抗体系统(Experimental Medicine 13 :85-90(1995)) 在免疫沉淀中，将这些抗体添加到用合适去垢剂制备的细胞裂解物中而形成免疫复合体。免疫复合体由SYNGR4多肽、包含与该多肽结合的能力的多肽、和抗体组成。除了使用针对上述表位的抗体之外，还可以使用针对SYNGR4多肽的抗体进行免疫沉淀，这样的抗体可以如上文所述制备。免疫复合体可以被沉淀，例如当抗体是小鼠IgG抗体时，可以通过蛋白A sepharose或蛋白G sepharose将其沉淀。如果将由SYNGR4基因编码的多肽制备成与表位(例如GST)的融合蛋白，则可以使用特异结合这些表位的物质，例如谷胱甘肽-sepharose 4B，按照与使用针对SYNGR4多肽的抗体的相同的方式来形成免疫复合体。
可遵循或根据，例如，文献中的方法来实施免疫沉淀(Harlow and Lane, Antibodies, 511-52, Cold Spring Harbor Laboratory publications, New York(1988))。
普遍使用SDS-PAGE分析经免疫沉淀的蛋白，使用合适浓度的凝胶，可以利用结合蛋白的分子量来分析该蛋白。由于与SYNGR4多肽结合的蛋白难以通过考马斯兰染色或银染色等普通染色方法检测到，可以通过如下的方法提高蛋白的检测灵敏度在含有放射性同位素35S-甲硫氨酸或35S-半胱氨酸的培养基中培养细胞，标记细胞中的蛋白，并检测该蛋白。当蛋白的分子量已知时，可以直接从SDS-聚丙烯酰胺凝胶上纯化出靶蛋白并测定其序列。
作为利用SYNGR4多肽来筛选结合该多肽的蛋白的方法，可以使用例如 West-Western 印迹分析法(Skolnik et al. ,Cell 65 :83-90 (1991))。具体地，与 SYNGR4多肽结合的蛋白可以通过如下方法获得，从预期表达结合SYNGR4多肽的蛋白质的培养细胞 (例如 LC176、LC319、A549、NCI-H23、NCI-H226、NCI-H522、PC3、PC9、PC14、SK-LU-1、EBC-1、 RERF-LC-AI, SK-MES-U SW900与SW1573)利用噬菌体载体(例如ZAP)制备cDNA文库，在 LB琼脂糖上表达蛋白，将表达出的蛋白固定在滤膜上，使纯化并且标记的SYNGR4多肽与上述滤膜反应，并依照标记物来检测表达与SYNGR4多肽结合的蛋白的噬菌斑。本发明的多肽可以利用生物素与抗生物素蛋白间的结合，或者利用特异结合SYNGR4多肽或与SYNGR4多肽融合的肽或多肽(例如GST)的抗体，来进行标记。也可以使用利用放射性同位素或荧光等的方法。
或者，在本发明筛选方法的另一个实施方案中，可以使用利用细胞的双杂交系统(“MATCHMAKER Two-Hybrid system”，“Mammalian MATCHMAKER Two-Hybrid Assay Kit”，“MATCHMAKER one-Hybrid system" (Clontech) ；"HybriZAP Two-Hybrid Vector System”(Stratagene)；参考文献见“Dalton and Treisman，Cell 68:597-612(1992)”， "Fields and Sternglanz，Trends Genet 10:286-92(1994)，，)。
在双杂交系统中，使SYNGR4多肽与SRF结合区或GAL4结合区融合，并在酵母细胞中表达。从预期表达与本发明多肽结合的蛋白的细胞制备cDNA文库，使该文库在被表达时与VP16或GAL4转录激活区融合。然后，将cDNA文库导入到上述酵母细胞中，并从检测到的阳性克隆(当酵母细胞中表达出可与本发明多肽结合的蛋白时，两者的结合激活报告基因，使阳性克隆可检测)分离源自该文库的cDNA。通过将上面分离的cDNA导入到大肠杆菌中并表达该蛋白，可制备由该cDNA编码的蛋白。作为报告基因，除了 HIS3基因之外，还可以使用例如Ade2基因、IacZ基因、CAT基因、萤光素酶基因等。
也可以用亲和色谱来筛选与SYNGR4基因编码的多肽结合的化合物。例如，可以把本发明多肽固定在亲和柱的载体上，而将含有能够结合本发明多肽的蛋白的测试化合物施加到该柱上。这里的测试化合物可以是例如细胞提取物、细胞裂解物等。在加载测试化合物之后，冲洗柱子，从而可以制备得到结合于本发明多肽的化合物。当测试化合物是蛋白质时，对所得蛋白质的氨基酸序列进行分析，根据该序列合成寡DNA，并用该寡DNA作为探针筛选cDNA文库，从而获得编码该蛋白的DNA。
利用表面等离子体共振现象的生物传感器可以在本发明中用作检测或定量结合化合物的装置。当使用这种生物传感器时，可以仅使用微量并且没有标记的多肽(例如 BIAcore, Pharmacia)，以表面等离子体共振信号的形式对本发明多肽与测试化合物间的相互作用进行实时的观察。因此，使用生物传感器，例如BIAcore，人们就有可能对本发明多肽与测试化合物间的结合进行评估。
用于筛选当固定的SYNGR4多肽暴露于合成化合物或天然物质文库或随机噬菌体肽展示文库时发生结合的分子的方法，以及使用基于组合化学技术的高通量筛选方法(ffrighton et al. , Science 273 :458-64(1996) ；Verdine, Nature 384 :11-13(1996)； Hogan, Nature 384 17-9 (1996))，以不仅分离与SYNGR4蛋白结合的蛋白质，而且分离与 SYNGR4蛋白结合的化合物(包括激动剂和拮抗剂)的方法，是本领域技术人员众所周知的。
阻抑SYNGR4牛物学活件的化合物的筛诜 在本发明中，SYNGR4蛋白具有促进肺癌细胞的细胞增殖(图3B)和细胞侵袭活性 (图4A)的活性。使用这些生物学活性，本发明提供了筛选可阻抑肺癌细胞增殖的化合物的方法，以及筛选用于治疗或预防肺癌的化合物的方法。因此，本发明提供了使用由SYNGR4 基因编码的多肽来筛选治疗或预防肺癌的化合物的方法，其包括下列步骤 (a)将测试化合物与由SYNGR4的多核苷酸编码的多肽接触； (b)检测步骤(a)所述多肽的生物学活性； (c)选择较之测试化合物不存在时该多肽的生物学活性，阻抑由SYNGR4基因编码的多肽的生物学活性的测试化合物。
在本发明中，揭示了阻抑SYNGR4表达降低肺癌细胞生长。如此，通过筛选抑制 SYNGR4多肽生物学活性的候选化合物，可鉴定出可用于治疗或预防肺癌的候选化合物。这些候选化合物治疗或预防癌症的潜力可通过二次和/或更进一步筛选来评估以鉴定可用于治疗或预防肺癌的治疗剂。例如，当结合SYNGR4蛋白的化合物抑制肺癌细胞的例如增殖或侵袭活性时，可得出结论所述化合物具有SYNGR4特异性治疗效果。
依照本发明，可评估测试药剂或化合物抑制细胞生长或者候选药剂或化合物治疗或预防SYNGR4相关疾病的治疗效果。因此，本发明亦提供了使用SYNGR4多肽或其片段筛选用于抑制细胞生长的候选药剂或化合物或者用于治疗或预防SYNGR4相关疾病的候选药剂或化合物的方法，其包括以下步骤 a)将测试药剂或化合物与SYNGR4多肽或其功能性片段接触；并 b)检测步骤a)的所述多肽或片段的生物学活性；并 c)将b)的生物学活性与所述测试药剂或化合物的治疗效果关联起来。
在本发明中，治疗效果可以与SYNGR4多肽或其功能性片段的生物学活性关联起来。例如，当与某种测试药剂或化合物不存在下检测到的水平相比该测试药剂或化合物阻抑或抑制SYNGR4多肽或其功能性片段的生物学活性时，可将所述测试药剂或化合物鉴定或选择为具有治疗效果的候选药剂或化合物。或者，当与某种测试药剂或化合物不存在下检测到的水平相比该测试药剂或化合物不阻抑或抑制SYNGR4多肽或其功能性片段的生物学活性时，可将所述测试药剂或化合物鉴定为没有显著治疗效果的药剂或化合物。
本发明所述方法将在下面更加详细的加以描述。
任何SYNGR4多肽均可用于筛选，只要它们包含SYNGR4蛋白的生物学活性即可。这样的生物学活性包括SYNGR4蛋白的细胞增殖活性或侵袭活性。举例而言，可使用SYNGR4 蛋白，亦可使用与这些蛋白功能上等价的多肽。上述多肽可由细胞内源或外源地表达。别的SYNGR4蛋白具有与GRB2相互作用的活性，而且SYNGR4的酪氨酸-46残基是该活性不可缺少的。SYNGR4可发挥致癌功能，可能是凭借GRB2-PAK1和后续MAPK信号激活。
通过本筛选分离的化合物是SYNGR4基因编码的多肽的拮抗剂的候选者。术语“拮抗剂”是指通过结合多肽而抑制多肽功能的分子。所述术语还指可降低或抑制编码SYNGR4 的基因的表达的分子。而且，通过本筛选分离的化合物是如下化合物的候选物，所述化合物抑制SYNGR4多肽与分子(包括DNA和蛋白)的体内相互作用。
当本方法中要检测的生物学活性是细胞增殖时，可以通过例如如下方法进行检测制备表达SYNGR4多肽的细胞，在测试化合物的存在下培养细胞，确定细胞增殖速度， 测量细胞周期等，以及通过测量存活细胞或集落形成能力，例如图3所示。选择降低表达 SYNGR4的细胞的增殖速度的化合物作为治疗或预防肺癌的候选化合物。
更具体而言，该方法包括以下步骤 (a)使测试化合物与过表达SYNGR4的细胞接触； (b)测量细胞增殖活性；并 (c)选择与测试化合物不存在下的细胞增殖活性相比降低细胞增殖活性的测试化合物。
在优选的实施方案中，本发明的方法可进一步包括以下步骤 (d)选择对很少或不表达SYNGR4的细胞没有影响的测试化合物。
当本发明所述方法所检测的生物学活性是侵袭活性时，其可通过下述方法来检测，例如，制备表达SYNGR4多肽的细胞，使用本领域已知的任何方法例如使用基质胶(基质胶)侵袭分析对侵袭性细胞的数目计数，例如，示于图4A。选择减少侵袭性细胞数目的化合物作为治疗或预防肺癌的候选化合物。
更具体而言，该方法包括以下步骤 (a)使测试化合物与过表达SYNGR4的细胞接触； (b)测量细胞侵袭活性；并 (c)选择与测试化合物不存在下的细胞侵袭活性相比降低细胞侵袭活性的测试化合物。
在优选的实施方案中，本发明的方法可进一步包括以下步骤 (d)选择对很少或不表达SYNGR4的细胞没有影响的测试化合物。
在本发明中，揭示了阻抑SYNGR4表达降低肺癌细胞侵袭。如此，通过筛选降低侵袭活性的候选化合物，可鉴定出可用于治疗或预防肺癌细胞侵袭的候选化合物。这些候选化合物治疗或预防肺癌细胞侵袭的潜力可通过二次和/或更进一步筛选来评估以鉴定用于癌症侵袭的治疗剂。
依照本发明，可评估测试药剂或化合物抑制癌细胞侵袭或者候选药剂或化合物治疗或预防肺癌细胞侵袭的治疗效果。因此，本发明亦提供了使用SYNGR4多肽或其片段筛选用于抑制肺癌细胞侵袭的候选药剂或化合物或者用于治疗或预防肺癌细胞侵袭的候选药剂或化合物的方法，其包括以下步骤 a)使测试药剂或化合物与表达SYNGR4多肽或其功能性片段的细胞接触； b)测量细胞侵袭活性；并 c)将b)的所述细胞的侵袭活性与所述测试药剂或化合物的治疗效果关联起来。
在本发明中，治疗效果可以与侵袭活性关联起来。例如，当与某种测试药剂或化合物不存在下检测到的水平相比该测试药剂或化合物阻抑或抑制侵袭活性时，可将所述测试药剂或化合物鉴定或选择为具有治疗效果的候选药剂或化合物。或者，当与某种测试药剂或化合物不存在下检测到的水平相比该测试药剂或化合物不阻抑或抑制侵袭活性时，可将所述测试药剂或化合物鉴定为没有显著治疗效果的药剂或化合物。
“阻抑生物学活性”在此定义为较之不存在所述化合物时，对SYNGR4生物学活性的优选至少10 %的阻抑，更优选至少25 %、50 %或75 %的阻抑，且最优选至少90 %的阻抑。
改变SYNGR4表达的化合物的筛选 在本发明中，通过SiRNA减少SYNGR4表达可抑制肺癌细胞增殖(图3A)。因此，本发明提供了筛选抑制SYNGR4表达的化合物的方法。抑制SYNGR4表达的化合物可望能够阻抑肺癌细胞增殖，并因此对治疗或预防肺癌有用。因此，本发明亦提供了筛选阻抑肺癌细胞增殖的化合物的方法，以及筛选治疗或预防肺癌的化合物的方法。在本发明的语境下，上述筛选可包括，例如，下列步骤 (a)将候选化合物与表达SYNGR4的细胞接触；并 (b)选择与对照相比减少SYNGR4表达水平的候选化合物。
在本发明中，揭示了阻抑SYNGR4表达降低肺癌细胞生长。因此，通过筛选抑制 SYNGR4表达水平的候选化合物，可鉴定出可用于治疗或预防部分由SYNGR4过表达引起或促进的癌症的候选化合物。这些候选化合物治疗或预防癌症的潜力可通过二次和/或更进一步筛选来评估以鉴定用于SYNGR4相关癌症的治疗剂。
依照本发明，可评估测试药剂或化合物抑制细胞生长或者候选药剂或化合物治疗或预防SYNGR4相关疾病的治疗效果。因此，本发明亦提供了筛选用于阻抑癌细胞增殖的候选药剂或化合物的方法和筛选用于治疗或预防SYNGR4相关疾病的候选药剂或化合物的方法。
在本发明的语境中，此类筛选可包括例如以下步骤 a)使测试药剂化合物与表达SYNGR4基因的细胞接触； b)检测SYNGR4基因表达水平；并 c)将b)的表达水平与所述测试药剂或化合物的治疗效果关联起来。
在本发明中，治疗效果可以与SYNGR4基因表达水平关联起来。例如，当与某种测试药剂或化合物不存在下检测到的水平相比该测试药剂或化合物降低SYNGR4基因的表达水平时，可将所述测试药剂或化合物鉴定或选择为具有治疗效果的候选药剂或化合物。或者，当与某种测试药剂或化合物不存在下检测到的水平相比该测试药剂或化合物不降低 SYNGR4基因表达水平时，可将所述测试药剂或化合物鉴定为没有显著治疗效果的药剂或化合物。
下面将更加详细地描述本发明的方法。
表达SYNGR4的细胞包括，例如，自肺癌建立的细胞系；这样的细胞可用于上述本发明的筛选(例如 A427，A549, LC319, PC14, PC3, PC9, NCI-H1373，NCI-H1781，NCI-H358, NCI-H226, NCI-H520, NCI-H1703，NCI-H2170，EBC-I，RERF-LC-AI, LXl，DMSl14，DMS273, SBC-3，SBC-5, NCI-H196, NCI-H446)。可用本领域技术人员众所周知的方法，例如，RT-PCR、 Northern印迹分析、Western印迹分析、免疫染色与流式细胞分析来估计表达水平。在此定义的“降低表达水平”优选为较之在所述化合物不存在时的表达水平，至少使SYNGR4表达水平降低至少10%，更优选降低至少25%、50%或75%，最优选降低至少95%的水平。在此使用的化合物包括化学化合物、双链核苷酸等等。在前面描述了双链核苷酸的制备。在筛选方法中，降低SYNGR4表达水平的化合物可选择用来治疗或预防肺癌的候选化合物。
或者，本发明的所述筛选方法可包括下列步骤
53 (a)将候选化合物与导入了包含SYNGR4转录调控区域与在该转录调控区域控制下表达的报道基因的载体的细胞接触； (b)测量所述报道基因的表达或活性；并 (c)选择降低所述报道基因表达或活性的候选化合物。
在本发明中，揭示了阻抑SYNGR4表达降低肺癌细胞生长。如此，通过筛选抑制所述报道基因表达或活性的候选化合物，可鉴定出可用于治疗或预防肺癌的候选化合物。这些候选化合物可通过二次和/或更进一步筛选来评估治疗或预防癌症的潜力以鉴定用于肺癌的治疗剂。
依照本发明，可评估测试药剂或化合物抑制肺癌细胞生长或者候选药剂或化合物治疗或预防SYNGR4相关疾病的治疗效果。因此，本发明亦提供了筛选用于阻抑肺癌细胞增殖的候选药剂或化合物的方法和筛选用于治疗或预防SYNGR4相关疾病的候选药剂或化合物的方法。
依照另一个方面，本发明提供了一种方法，其包括以下步骤 a)使测试药剂或化合物与其中导入了载体的细胞接触，该载体包含SYNGR4基因的转录调节区和在该转录调节区控制下表达的报道基因 b)检测所述报道基因的表达或活性；并 c)将b)的表达水平与所述测试药剂或化合物的治疗效果关联起来。
在本发明中，治疗效果可以与所述报道基因的表达或活性关联起来。例如，当与某种测试药剂或化合物不存在下检测到的水平相比该测试药剂或化合物降低所述报道基因的表达或活性时，可将所述测试药剂或化合物鉴定或选择为具有治疗效果的候选药剂或化合物。或者，当与某种测试药剂或化合物不存在下检测到的水平相比该测试药剂或化合物不降低所述报道基因的表达或活性时，可将所述测试药剂或化合物鉴定为没有显著治疗效果的药剂或化合物。
合适的报道基因和宿主细胞在本领域是众所周知的。举例而言，报道基因为萤光素酶、绿色荧光蛋白(GFP)、香菇珊瑚(Discosoma sp.)红色荧光蛋白(DsRed)、氯霉素乙酰基转移酶(CAT)、Laz与beta-葡萄糖醛酸糖苷酶(⑶幻，而宿主细胞为C0S7、HEK293、HeLa 等。所述筛选所需的报道构建体可通过将报道基因序列与SYNGR4转录调控区域连接来制备。本文所述的SYNGR4转录调控区域是从起始密码子开始至少500bp上游的区域，优选 IOOObp,更优选5000或IOOOObp上游。含有所述转录调控区域的核苷酸片段可从基因组文库中分离出来，或可通过PCR扩增。所述筛选所需的报道构建体可通过将报道基因序列与这些基因中任一的转录调控区域连接来制备。鉴别转录调控区域的方法，以及其测定法规程都是众所周知的(Molecular Cloning，第三版，第 17 章，2001，Cold Springs Harbor Laboratory Press)。
用含有所述报道构建体的载体感染宿主细胞，且用本领域众所周知的方法检测报道基因的表达或活性(例如，使用照度计(luminometer)、吸收光谱仪、流式细胞仪等等)。 在此定义的“降低表达或活性”优选较之在所述化合物不存在时，报道基因的表达或活性优选地被降低至少10%，更优选地，至少降低25%、50%或75%，最优选地，降低至少95%。
使用SYNGR4的磷酸化水平作为指标的筛选 另外，在本发明中，确认了 SYNGR4蛋白受到磷酸化。因此，可使用这样的修饰作为指标来筛选抑制SYNGR4蛋白磷酸化的化合物。因此，本发明亦提供筛选抑制SYNGR4蛋白磷酸化的化合物的方法。另外，本发明亦提供筛选用于治疗或预防癌症的化合物的方法。该方法特别适合于筛选可用于治疗或预防癌症的药剂。更具体地，该方法包括以下步骤 (a)使表达选自下组的多肽的细胞与测试化合物接触 (1)包括氨基酸序列SEQ ID NO 14的多肽， (2)包括其中替代、删除、插入、和/或添加了一个或多个氨基酸的氨基酸序列SEQ ID NO: 14且具有与由氨基酸序列SEQ ID NO :14组成的蛋白等同的生物学活性的多肽， C3)与包括氨基酸序列SEQ ID NO 14的多肽共享至少90 %、93 %、95 %、96 %、 97%、98%或99%序列同一性的多肽，其中该多肽具有与氨基酸序列SEQ ID N0:14的多肽等同的生物学活性，和 (4)由在严格条件下与由核苷酸序列SEQ ID NO :13组成的多核苷酸杂交的多核苷酸编码的多肽，其中该多肽具有与由氨基酸序列SEQ ID NO :14组成的多肽等同的生物学活性； (b)检测所述多肽的磷酸化水平； (c)比较所述多肽的磷酸化水平与在所述化合物不存在下检测到的所述多肽的磷酸化水平；并 (d)选择降低所述多肽磷酸化水平的化合物作为所述多肽磷酸化的抑制剂或用于治疗或预防癌症的化合物。
在本文中，可使用任何细胞，只要它表达SYNGR4多肽或其功能性等同物。本筛选中使用的细胞可以是天然表达SYNGR4多肽的细胞，包括例如自肺癌和睾丸衍生的细胞或建立的细胞系。可采用肺癌的细胞系，诸如A427、A549, LC319、PC-3、PC-9、PC-14、 NCI-H1373、NCI-H1781、NCI-H358、NCI-H226、EBC-U NCI-H520、NCI-H1703、NCI-H2170、 RERF-LC-AI、DMSl 14、DMS273、SBC-3、SBC-5、NCI-H196、和 NCI-H446。
或者，该筛选中使用的细胞可以是天然不表达SYNGR4多肽且经表达SYNGR4多肽或SYNGR4功能性等同物的载体转染的细胞。此类重组细胞可通过已知的遗传工程方法来获得(例如Morrison DA.，J Bacteriology 1977,132 :349-51 ；Clark-Curtiss & Curtiss， Methods in Enzymology (eds. Wu et al.) 1983，101 :347-62)，如上所述。
任何上述测试化合物可用于本筛选。然而，优选选择能渗透入细胞的化合物。或者，当测试化合物是多肽时，本筛选中细胞与测试药剂的接触可通过用包括编码测试药剂的核苷酸序列的载体转化细胞并在细胞中表达测试药剂来实施。
在另一个实施方案中，适合于SYNGR4多肽或其功能性等同物磷酸化的条件可在体外提供。此筛选方法包括以下步骤 (a)使测试化合物与本发明的多肽或其片段(例如包括酪氨酸-46)接触； (b)检测步骤(a)的多肽的磷酸化；并 (c)选择与所述测试化合物不存在下检测到的生物学活性相比阻抑所述多肽磷酸化的化合物。
在本发明中，如上所述，SYNGR4蛋白的生物学活性优选磷酸化活性。熟练技术人员会评估磷酸化水平。
因而，在这些实施方案中，本发明提供了筛选用于抑制SYNGR4磷酸化或者预防或治疗癌症的药剂的方法，其包括以下步骤 (a)使选自下组的多肽或其包括磷酸化位点的片段与测试化合物在容许所述多肽磷酸化的条件下接触 (1)包含氨基酸序列SEQ ID NO 14的多肽， (2)包含其中替代、删除、插入、和/或添加一个或多个氨基酸的氨基酸序列SEQ ID NO: 14且具有与由氨基酸序列SEQ ID NO :14组成的蛋白等同的生物学活性的多肽， C3)与包含氨基酸序列SEQ ID NO 14的多肽共享至少90 %、93 %、95 %、96 %、 97%、98%或99%序列同一性的多肽，其中该多肽具有与氨基酸序列SEQ ID NO :14的多肽等同的生物学活性，和 (4)由在严格条件下与由核苷酸序列SEQ ID NO :13组成的多核苷酸杂交的多核苷酸编码的多肽，其中该多肽具有与由氨基酸序列SEQ ID NO :14组成的多肽等同的生物学活性； (b)检测所述多肽或其片段的磷酸化水平； (c)比较所述物质的磷酸化水平与所述测试化合物不存在下检测到的所述多肽的磷酸化水平；并 (d)选择降低所述多肽磷酸化水平的化合物作为用于抑制所述多肽磷酸化或者治疗或预防癌症的化合物。
在这些实施方案中，容许SYNGR4多肽磷酸化的条件可通过将多肽与适合于 SYNGR4多肽磷酸化的激酶和ATP —起温育来提供。在一些实施方案中，进一步将SYNGR4多肽与AURKB多肽接触。进一步地，在优选的实施方案中，可将增强SYNGR4多肽磷酸化的物质添加至筛选的反应混合物。当多肽的磷酸化通过添加所述物质得到增强时，可以以更高的灵敏度来测定磷酸化水平。
SYNGR4多肽或其功能等同物的磷酸化水平可依照本领域已知的任何方法(例如见实施例)来检测。
使用SYNGR4相互作用作为指标的筛选 另外，本发明人揭示了 SYNGR4与GRB2相互作用(图5)。因而，认为这两种多肽的相互作用在致癌作用或细胞增殖，特别是癌症的细胞增殖中发挥至关重要的作用。因此，意图筛选可用于治疗或预防癌症的化合物，其抑制SYNGR4多肽与GRB2多肽之间的相互作用或反之的相互作用。由此，本发明提供了筛选用于抑制SYNGR4多肽与GRB2多肽之间相互作用的化合物的方法。另外，本发明提供了筛选用于抑制SYNGR4多肽与GRB2多肽之间结合，或者治疗或预防癌症的化合物的方法。所述方法包括以下步骤 (a)使GRB2多肽或其功能性等同物与SYNGR4多肽或其功能性等同物在测试化合物存在下接触； (b)检测步骤(a)的所述多肽之间的结合；并 (c)选择抑制GRB2与SYNGR4多肽之间结合的测试化合物。
在本发明的语境中，SYNGR4或GRB2多肽的功能性等同物分别为具有与SYNGR4多肽(SEQ ID NO 14)或GRB2多肽(SEQ ID NO :23或25)等同的生物学活性的多肽(见定义)。
筛选阻抑PAKl、c-Raf、MEK1/2和ERK1/2磷酸化活性的化合物 在本发明的语境中，确认了PAKl (Thr423)、c_Raf (Ser338)、MEKl (Ser298)、 MEKl/2(Ser217/221)和 ERK1/2 CThr202/204)的磷酸化在 SYNGR4 敲低作用中降低。同时，磷酸化的 PAKl (Thr423)、c-Raf (Ser338)、MEKl (Ser 298)、MEK1/2 (Ser217/221)和 ERK1/2 (Thr202/204)在 SYNGR4 表达后升高(图 6)。这些发现指示 PAKU c-Raf、MEKU MEK1/2和ERK1/2是导致细胞增殖的SYNGR4多肽磷酸化信号传导的下游效应器分子。在本发明中，SYNGR4的下游效应器指被SYNGR4以直接或间接的方式磷酸化的分子。如此， SYNGR4的下游效应器包括在来自SYNGR4的信号传导途径中被磷酸化的分子。例如，依照本发明，SYNGR4提高PAKl的磷酸化水平，PAKl是SYNGR4的下游效应器之一。另外，c-Raf、 MEKUMEK1/2和ERK的磷酸化水平在SYNGR4磷酸化后升高。如此，这些分子也是SYNGR4的下游效应器。因此，通过使用此活性作为指标，本发明提供了筛选阻抑表达SYNGR4、GRB2和 ΡΑΚΙ、* C-RafMEKlA或ERKlA的癌细胞增殖的化合物的方法，和筛选用于治疗或预防癌症，特别是包括肺癌在内的癌症的化合物的方法。如此，本发明提供了使用由SYNGR4基因编码的多肽来筛选用于抑制SYNGR4磷酸化下游效应器的活性，或者治疗或预防癌症的化合物的方法，其包括以下步骤 (a)使测试化合物与由SYNGR4的多核苷酸编码的多肽在由GRB2和PAKl的多核苷酸编码的多肽存在下在选自PAK1、c-Raf、MEKU MEK1/2和ERK1/2的至少一种下游效应器磷酸化的条件下接触； (b)检测所述SYNGR4的下游效应器的磷酸化水平；并 (c)选择与测试化合物不存在下检测到的SYNGR4的下游效应器的磷酸化水平相比阻抑SYNGR4的下游效应器的磷酸化水平的测试化合物。
在优选的实施方案中，要检测的SYNGR4的下游效应器的磷酸化水平分别是 PAKl 的 Thr423、c-Raf 的 Ser338、MEKl 的 Ser 298、MEK1/2 的 Ser217/221、和 ERK1/2 的 Thr202/204的磷酸化水平。在本发明中，选自PAKl、c_Raf、MEKl、MEK1/2和ERK1/2的至少一种下游效应器磷酸化的条件可以通过培养表达SYNGR4和它的至少一种下游效应器的细胞来提供。例如，表达SYNGR4和所有这些下游效应器(包括GRB》的细胞是这些下游效应器磷酸化的优选条件。特别地，表达这些分子的肺癌细胞系可用于本发明。或者，任何经表达SYNGR4的载体转染的内源性表达下游效应器的细胞也可用于本发明。
依照本发明，可评估测试化合物阻抑PAKl、c-Raf、ΜΕΚ1/2或ERK1/2磷酸化活性或者候选化合物治疗或预防涉及SYNGR4的癌症(例如肺癌)的治疗效果。因此，本发明亦提供了使用SYNGR4多肽或其片段和PAK1、c-Raf、MEK1/2或ERK1/2多肽或其片段筛选用于阻抑磷酸化活性的候选化合物或者用于治疗或预防涉及SYNGR4的癌症的候选化合物的方法，其包括以下步骤 a)使测试化合物与SYNGR4多肽或其功能性片段在GRB2和PAKl、和C-RafMEKl/^ 或ERK1/2多肽或其功能性片段存在下在选自PAK1、c-Raf、MEK1、MEK1/2和ERK1/2的至少一种SYNGR4下游效应器的磷酸化条件下接触； b)检测所述SYNGR4下游效应器的磷酸化水平；并 c)将b)的磷酸化水平与测试药剂或化合物的治疗效果关联起来。
在本发明的语境中，治疗效果可以与SYNGR4增强的对PAK1、c-Raf、MEK1/2或 ERK1/2多肽或其功能性片段的磷酸化活性关联起来。例如，当与某种测试药剂或化合物不存在下检测到的水平相比该测试药剂或化合物阻抑或抑制PAK1、c-Raf, MEK1/2或ERK1/2 多肽或其功能性片段的磷酸化活性时，可将所述测试药剂或化合物鉴定或选择为具有治疗效果的候选药剂或化合物。或者，当与某种测试药剂或化合物不存在下检测到的水平相比该测试药剂或化合物不阻抑或降低PAKl、c-Raf、ΜΕΚ1/2或ERK1/2多肽或其功能性片段的磷酸化活性时，可将所述测试药剂或化合物鉴定为没有显著治疗效果的药剂或化合物。
下面将更加详细地描述本发明的方法。
任何多肽可用于筛选，只要它们阻抑PAKl、c-Raf、MEK1/2或ERK1/2的磷酸化活性。例如，可使用SYNGR4蛋白和GRB2、PAKl、c-I af、MEKl//2或ERKl//2蛋白，而且也可使用与这些蛋白功能等同的多肽。此类多肽可以由细胞内源或外源表达。
通过此筛选分离出的化合物是由SYNGR4基因编码的多肽的拮抗剂候选。术语“拮抗剂”指通过结合该多肽来抑制其功能的分子。此术语还指降低或抑制编码SYNGR4的基因表达的分子。此外，通过此筛选分离出的化合物是抑制SYNGR4多肽与GRB2体内相互作用的化合物候选。
当本方法中要检测的生物学活性是磷酸化时，可以通过例如如下方法进行检测 制备表达SYNGR4、GRB2和PAKlJP c-Raf、MEK1/2或ERK1/2多肽的细胞，在测试化合物存在下培养细胞，并测定PAKl、c-Raf、MEKl/2或ERK1/2的磷酸化，测量细胞周期等，以及通过测量存活细胞或集落形成能力。选择这样的化合物作为治疗或预防癌症，包括肺癌的候选化合物其降低表达SYNGR4的细胞的PAKUP c-Raf、MEK1/2或ERK1/2磷酸化。
在优选的实施方案中，使用不表达SYNGR4多肽的对照细胞。因而，本发明亦提供使用SYNGR4多肽或其片段筛选用于抑制细胞生长的候选物质或者用于治疗或预防SYNGR4 相关疾病的候选物质的方法，其包括以下步骤 (a)使测试化合物与过表达 SYNGR4、GRB2 和 PAKljP c_Raf、MEK1/2 或 ERK1/2 的细胞接触； (b)测量 PAKl (Thr423)、c_Raf (Ser338) ,MEKl (Ser 298)、MEKl/2 (Ser217/221)和 ERK1/2 (Thr202/204)的磷酸化活性；并 (c)选择与测试化合物不存在下的细胞增殖活性相比降低磷酸化活性的测试化合物。
在优选的实施方案中，本发明的方法可进一步包括以下步骤 (d)选择对很少或不表达SYNGR4的细胞没有影响的测试化合物。
或者，依照本发明，可对SYNGR4多肽的潜在拮抗剂评估抑制SYNGR4介导的SYNGR4 下游效应器分子磷酸化的能力。例如，任何结合SYNGR4多肽的化合物均可能是该多肽的潜在拮抗剂。此类化合物可通过包括以下步骤的方法来分离 i)使测试化合物与SYNGR4多肽接触； ii)检测测试化合物与SYNGR4多肽之间的结合；并 iii)选择结合SYNGR4多肽的测试化合物作为SYNGR4多肽的潜在拮抗剂。
短语“阻抑或降低磷酸化”在此定义为较之不存在所述化合物时，对SYNGR4生物学活性的优选至少10%的阻抑，更优选至少25%、50%或75%的阻抑，最优选至少90%的阻抑。本发明的样态在下述实施例中加以描述，它们并无意对权利要求中描述的本发明范围进行限定。
除非另行定义，在此使用的所有技术和科学术语均与本发明所属领域一般技术人员通常理解的意义相同。下面描述了合适的方法和材料，虽然与在此描述的相似或等同的方法和材料亦可用于实践或测试本发明。
本发明将于下列实施例中进一步加以描述，其并不对权利要求中描述的本发明范围进行限定。
实施例 实施例1 通用方法 1.细胞系与组织样品 本实施例使用的22个人类肺癌细胞系包括9个腺癌(ADC ；A427, A549, LC319， PC-3, PC-9, PC-14, NCI-H1373, NCI-H1781 与 NCI_H;358)、1 个腺鳞癌(ASC ；NCI-H226)、5 个鳞状细胞癌(SCC ；EBC-I，NCI-H520, NCI-H1703，NCI-H2170，与 RERF-LC-AI)、1 个大细胞癌 (LXl)与 6 个小细胞肺癌(SCLC ；DMS114, DMS273, SBC-3，SBC-5，NCI-H196，与 NCI-H446)。 人类支气管上皮细胞(BEAS-2B)与人类小气道上皮细胞(SAEC)用作对照。所有的细胞均于合适的补充有10% FCS的培养基中单层培养，且保持在37摄氏度下含5% CO2的湿润空气中。原代肺癌样品之前已获取。临床分期根据国际抗癌联盟(International UnionAgainst Cancer)的 TNM 分级法进行判断(Sobin L et al.，6th ed. New York 2002)。总共 339 个经福尔马林固定的原代NSCLCd-IIIA期)样品，包括203个ADCUOO个SCC,25个LCCUl 个ASC以及邻近的正常肺组织，事先与临床病理学资料一起从在琦玉癌症中心(Mitama， Japan)接受手术的病人获取。所述所有临床材料的使用已得到各机构伦理委员会批准。
2.半定量逆转录PCR 来自每个样品的总共3微克等份的mRNA使用随机引物(Roche Diagnostics, Basel, Switzerland)与 SuperScript II (Invitrogen, Carlsbad, CA)经逆转录为单链 cDNA。半定量逆转录PCR(RT-PCR)实验利用下列各组针对SYNGR4的特异性合成引物、或作为内部对照的β肌动蛋白(ACTB)特异性引物来实施。
SYNGR4，5' -CAACAGCCCTGTGAACATGC-3‘ (SEQ ID NO :1)与 5' -ACCCTTCTGGAGGGAGGATTC-3‘ (SEQ ID NO 2)； ACTB，5' -GAGGTGATAGCATTGCTTTCG-3‘ (SEQ ID NO :3)与 5' -CAAGTCAGTGTACAGGTAAGC-3‘ (SEQ ID NO :4)。
优化PCR的循环数以保证产物的强度在扩增的线性期内。
3. Northern 印迹分析 将覆盖了 16种组织的人类多组织印迹(BD Biosciences, Palo Alto, CA)与 [α -32P]-dCTP标记的406-bp的SYNGR4PCR产物杂交，所述PCR产物系使用下述引物制备， 作为探针 5' -CGGCTACCAGAACAAGATGG-3‘ (SEQ ID NO :5)与 5' -GAAGCGCTTGTAAGGGACTG-3‘ (SEQ ID NO :6)。
预杂交、杂交与漂洗遵循生产商的说明书进行。所述印迹通过在零下70摄氏度用增感屏放射自显影七天获得。
4. SYNGR4表达载体的构建 使用引物集(5‘ -GGAATTCCAGACCGTGCATCATGCACATCCCCAAAAGCCTCCAG-3 ‘ (SE Q ID N0:7)和 5' -CCGCTCGAGCGGGTTGTCAGGCATCATAGCAAGC-3 ‘ (SEQ ID NO :8)通过 RT-PCR扩增SYNGR4的整个编码区。将产物用EcoRI和BioI消化，并克隆入pcDNA3. 1-myc/ His A(+)载体(Invitrogen)的适宜位点，该载体在SYNGR4蛋白COOH端含有c-myc-His 表位序列(LDEESILKQEHHHHHH) (SEQ ID NO 15)。发明人还使用 pCAGGSn_3Fc 载体和 pCAGGSn-3FH载体构建了表达载体，它们在SYNGR4蛋白NH2端含有3 X Flag表位序列 (DYKDHDGDYKDHDIDYKDDDDK) (SEQ ID NO: 16)。通过标准诱变 PCR (Suzuki C，et al. Cancer Res 2005 ；65 :11314-25)实施了其中Tyr46用苯丙氨酸替换(Y46F)的突变体SYNGR4的生成。用于 SYNGR4-Y46F 的引物集如下正向，5 ‘ -CGACGGCTtCCAGAACAAG-3 ‘ (SEQ IDNO 17)和反向，5' -CTTGTTCTGGaAGCCGTCG-3‘ (SEQ ID NO 18)(小写字母指突变的核苷酸)。 简言之，使用正向克隆引物和反向W6F引物或者使用正向W6F引物和反向克隆引物通过 PCR扩增SYNGR4序列。将两种扩增PCR产物纯化并通过实施诱变PCR来融合。
5.免疫细胞化学分析 对于透化条件下的分析，将细胞铺于玻璃盖玻片(Becton Dickinson Labware, Franklin Lakes，NJ)上，用4%多聚甲醛固定，并用含有0. 1 % Triton X-100的PBS在室温下透化5分钟。非特异性结合用Casblock (ZYMED，San Francisco, CA)在室温下封闭10分钟。然后将细胞在室温下与稀释于含BSA的PBS中的1. 3ug/ml山羊多克隆抗人SYNGR4 抗体(Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz，CA)温育 60 分钟。在用 PBS 漂洗之后，用 Alexa488-结合的第二抗体(Invitrogen)将细胞在室温下染色60分钟。再一次用PBS漂洗后，每个样本使用含有4’7-二脒基-2-苯基吲哚的Vectashield(Vector Laboratories, Inc. , Burlingame, CA)封固，并用 Spectral Confocal Scanning Systems (TSC SP2 AOBS ； Leica Microsystems,ffetzlar,Germany)使其可视化。为了确定SYNGR4的亚细胞定位，将经过固定的细胞分入有或无透化的条件。在封闭及与第一抗体一起温育后，将细胞用酸性甘氨酸处理5分钟以除去结合于细胞表面的抗体。在酸性甘氨酸处理后，通过常规规程处理第二抗体和4'，6-二脒基-2-苯基吲哚。
6.流式细胞术分析 将肺癌细胞O X IO6个细胞)与用于检测细胞表面SYNGR4的山羊抗SYNGR4抗体(5ug/mL ；Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA)或对照山羊 IgG(5ug/mL Systems, he.) —起于4°C温育30分钟。将细胞在PBS中清洗，然后与AlexaFluor 488 缀合的抗山羊IgG(Invitrogen，Carlsbad, CA) 一起于4°C温育30分钟。将细胞在PBS中清洗，并在FAC^can流式细胞仪(Becton Dickinson Labware, Bedford, ΜΑ)上分析及通过 ModFit 软件(Verity Software House, Inc.，Topsham, ME)来分析。均值荧光强度计算为相对信号强度值，即用抗SYNGR4抗体处理的细胞/用对照山羊IgG处理的细胞。
7.免疫组织化学与组织微阵列 在本发明中，对已包埋在石蜡块中的临床样品中的SYNGR4蛋白，切片用下述方法染色。简言之，在封闭了内源过氧化物酶和蛋白后，将20ug/mL针对SYNGR4的第一抗体 (Santa Cruz Biotechnology)添加到每个载玻片上，并将切片与作为第二抗体的HRP标记抗山羊 IgG(Histofine Simple Stain MAX PO(G), Nichirei, Tokyo, Japan) 一起温育。添加底物-色原，并用苏木精复染样品。如下实施了抗原阻断测定法来检验抗体对SYNGR4的特异性。在免疫组织化学染色前，将20ug/mL抗SYNGR4抗体(批号sc_34968 ;Santa Cruz Biotechnology)与 SYNGR4 抗原Jft (批号 sc_34968P ；Santa Cruz Biotechnology) 一起于37°C温育60分钟，并将反应产物于4°C以12，000 X g离心15分钟以除去免疫复合物。 上清液用作供进一步分析的经过中和的抗体。抗SYNGR4抗体与其抗原肽的反应摩尔比为 1 8。
根据其它文献中的描述(ChinSF, et al.，Mol Pathol 2003,56 :275-9 ；Callagy G, et al.，Diagn Mol Pathol 2003,12 :27-34 ；CalIagy G, et al.，J Pathol 2005,205 388-96)用339个福尔马林固定的原代肺癌构建肿瘤组织微阵列。基于与在载玻片上对应的H&E染色切片目视对准，选取用于取样的组织区域。将三个、四个或五个取自供体肿瘤块的组织芯(直径0. 6mm;深度，3-4mm)用微阵列点样器(Beecher Instruments, Sun Prairie, WI)置入受体石蜡块中。从每个病例中打孔取出正常组织芯，将所得微阵列块的 5微米切片用于免疫组织化学分析。三个独立的调查者在事先不知晓临床病理学数据的情况下半定量地评估了 SYNGR4阳性。用下列标准评价SYNGR4染色的强度“强阳性”(计分为2+)，在大于50%肿瘤细胞中染成棕色使细胞质完全模糊；“弱阳性”(1+)，在肿瘤细胞细胞质中任何可见的程度更低的棕色染色；以及“无染色”(计分为0)，即在肿瘤细胞中无可见的染色。只有在评议者们独立地断定为强阳性时才可以认可该病例为强阳性。
8.统计分析 使用MatView统计程序(SAS，Cary, NC)进行统计分析。肿瘤特异生存曲线从手术之日到NSCLC相关的死亡之时，或到最后一次随访观察之时计算。对每个相关变量及SYNGR4表达计算Kaplan-Meier曲线。病人亚组之间存活时间的差异用时序检验(log rank test)进行分析。用Cox比例风险回归模型进行单变量和多变量分析以确定临床病理学变量与癌症相关死亡率之间的联系。首先，分析死亡与其它的预后因素，包括年龄、性别、病理学肿瘤分类以及病理学淋巴结分类，之间的关系，每次考虑一个因素。其次，将多变量Cox分析应用于反向(分步的)过程，其中总是将强SYNGR4表达，以及任何及所有满足卩值< 0.05准入水平的变量强制引入该模型。当所述模型继续增加因素时，独立因素未超过P < 0. 05的退出水平。
9. RNA干扰测定 本发明先前建立了基于载体的RNA干扰系统，psiHlBX3.0，其设计成在哺乳动物细胞中合成小干扰 RNA(siRNA) (Suzuki C et al.，Cancer Res 2003，63 :7038-41)。 使用30微升LipofectAMINE 2000 (Invitrogen)将10微克siRNA表达载体转染到肺癌细胞系SBC-5与A549中。在适宜浓度的遗传霉素(G418)存在下将转染后的细胞培养7日；通过吉姆萨染色对集落数目计数；并在处理后7天用3-(4，5- 二甲基噻唑-2-基)-2，5_ 二苯四唑溴化物测定法评价细胞的存活力。简言之，以1/10体积的浓度将细胞计数试剂盒-8溶液(Dojindo)添加至每个皿，并将板于37°C再温育1小时。然后用Microplate Reader 550 (Bio-Rad)测量490nm处和作为参照的630nm处的吸光度。为验证SYNGR4mRNA表达的阻抑，依照标准方案使用下列对SYNGR4具有特异性的合成引物进行半定量RT-PCR实验。用于RNA干扰的合成寡核苷酸的靶序列如下对照1(EGFP 增强型绿色荧光蛋白基因，维多利亚水母(Aequorea victoria)绿色荧光蛋白的一种突变体)，5 ‘ -GAAGCAGCACGACTTCTTC-3 ‘ (SEQ ID NO 9)；对照 2 (萤光素酶 /
61LUC 萤火虫(Photinus pyralis)萤光素酶基因)，5' -CGTACGCGGAATACTTCGA-3 ‘ (SEQ ID NO :10) ;siRNA-SYNGR4-#l，5 ‘ -CAAGATGGAGTCTCCGCAG-3 ‘ (SEQ ID NO: 11) ;siRNA-SYNGR4-#2，5 ‘ -ATGATGCTCCAGTCCCTTA-3 ‘ (SEQ ID NO 12), siRNA-SYNGR4-#3，5 ‘ -CGCAUUGCCGGCACCCGCU-3 ‘ (SEQ ID NO: 19)， siRNA-SYNGR4-#4,5 ‘ -GCAUUGCCGGCACCCGCUU-3 ‘ (SEQ ID NO 20), siRNA-PAKl, 5 ‘ -CAAACAUU⑶GAAUUACUU-3 ‘ (SEQ ID NO :21)。在 siRNA 构建物的有义链的 3 ‘添加 TT。
10.细胞生长测定 将经表达SYNGR4的质粒或模拟质粒转染的C0S-7细胞接种到六孔板上(5X IO4个细胞/孔)，并在含有10% FBS和0. 4mg/ml遗传霉素的培养基中维持。在72小时后，使用细胞计数试剂盒(Wako，Osaka, Japan)通过MTT测定评估细胞增殖。
11.基质胶(Matrigel)侵袭测定 用表达SYNGR4的质粒或用模拟质粒转染的C0S-7与NIH3T3细胞在含10% FBS 的DMEM中生长至接近汇合。通过胰蛋白酶消化收集细胞，用未添加血清或蛋白酶抑制剂的 DMEM清洗，并以2 χ 105/ml的浓度悬浮在DMEM中。在制备细胞悬液之前，将基质胶基质 (Becton Dickinson Labware)的干燥层用DMEM在室温下复水2小时。向M孔基质胶侵袭室的每个下部小室中添加含有10% FBS的DMEM(0. 75mL)，并向每个上部小室插片中添加 0. 5mL(lX105/细胞)细胞悬液。将插片的板于37°C温育22小时。温育后，处理室；侵袭通过基质胶的细胞如供应商(Becton Dickinson Labware)所指导地固定，并用吉姆萨染色。
12.阻抑SYNGR4细胞侵袭活性的抗体处理测定 为了评估抗SYNGR4抗体对过表达外源或内源SYNGR4的哺乳动物细胞的侵袭能力的抑制效果，在抗SYNGR4抗体(Santa Cruz Biotechnology)处理下实施基质胶侵袭测定。将经表达SYNGR4的质粒或模拟质粒转染的C0S-7细胞，或表达内源SYNGR4的肺癌细胞在含有10% FBS的DMEM中培养至接近汇合。通过胰蛋白酶消化来收获细胞，在没有FBS 的DMEM中清洗，并以IXlO5个细胞/室的数目收获入基质胶室中，其中对于表达C0S-7的 SYNGR4、经模拟转染的C0S-7、或内源表达SYNGR4的肺癌细胞有IOOnM或200nM抗SYNGR4 抗体。这些细胞还用200nM同种型山羊IgG或PBS处理作为对照测定。在下部小室中，将含有10% FBS的DMEM (0. 75mL)添加至M孔基质胶侵袭室的每个下部小室，并将与上部小室相同浓度的抗SYNGR4抗体、同种型IgG、或PBS添加至下部小室。将插片的板于37°C温育22小时，并在温育后处理室；将侵袭穿过基质胶的细胞固定并通过吉姆萨来染色，并对侵袭细胞数目计数。
13.抗体和试剂 抗SYNGR4 抗体(批号 sc-34968)、抗 myc、和抗 GAPDH 抗体购自 Santa Cruz Biotechnology ο 抗磷酸 ERK1/2 (Thr202/Tyr204)、抗 ERK1/2、抗磷酸 MEK1/2 (Ser217/221)、 抗磷酸 MEKl (Ser298)、抗 MEK1/2、抗磷酸 c-Raf (Ser338)、抗 c_Raf、抗磷酸 AKT (Thr308)、 抗磷酸 AKT6er473)、抗 AKT、抗 GRB2、抗 ΡΑΚΙ、和抗磷酸 PAKl/2(Thr423)抗体购自 Cell Signaling Biotechnology 抗Flag M2抗体获自Sigma-Aldrich。抗磷酸胰蛋白酶抗体来自Millipore。用于流式细胞术的同种型山羊IgG来自R&D Systems, Inc。Rac和Ras激活测定试剂盒购自Cell Biolabs, he，测定依照制造商的方案实施。
14. Western 印迹分析 对经si-SYNGR4_#l或si_EGFP转染的A549和SBC-3细胞，及经表达野生型或突变型SYNGR4-Y46F的质粒或模拟质粒转染的C0S-7细胞的溶胞物进行^iestern印迹。简言之，将细胞在 ImL 溶胞缓冲液(0. 5% NP-40，50mmol/L Tris-HCl, 150mmol NaCl)中在蛋白酶抑制剂(Protease Inhibitor Cocktail Set III ;Calbiochem)存在下温育。使用 ECL Western 印迹分析系统(GE Healthcare Bio-sciences)如先前所述(Suzuki C，et al. Cancer Res 2005 ；65 :11314-25)进行 Western 印迹。为了分析 SYNGR4 对 MAI3K 信号传导的激活，使用针对每一种MAI3K信号传导蛋白的特异性抗体(见上文)，而且山羊抗小鼠和家兔IgG-HRP抗体(GE Healthcare Bio-sciences)充当用于这些实验的第二抗体。
15.磷酸酶测定 将经表达SYNGR4的质粒转染的C0S-7细胞用溶胞缓冲液来裂解，并在含有 50mmol/L Tris-HCL(pH 7. 5)、0. lmmol/L N￡i2-EDTA、5mmol/L二硫苏糖醇、2mmol/L MgCl2禾口 0. 01% Brij-35的磷酸酶缓冲液中用400个单位的λ -磷酸酶(New England Biolabs)于 30°C处理1小时，接着如上所述进行Wfestern印迹。
16.免疫沉淀 对经表达SYNGR4的质粒或模拟质粒转染的C0S-7细胞的细胞溶胞物进行免疫沉淀和Wfestern印迹。简言之，将细胞在ImL溶胞缓冲液(0. 5% NP-40，50mmol/L Tris-HCl, 150mmol NaCl)中在蛋白酶抑制剂(Protease Inhibitor Cocktail Set III ；Calbiochem Darmstadt)存在下温育。通过在总体积Iml溶胞缓冲液中在蛋白酶抑制剂存在下与30mL 蛋白G-琼脂糖珠(Invitrogen) —起于4°C温育1小时，将细胞提取物预澄清。使用对外源 SYNGR4 (抗myc抗体或抗Flag抗体)和内源GRB2或磷酸化酪氨酸特异性的抗体进行免疫沉淀和后续Astern印迹。
实施例2 在肺癌与正常组织中的SYNGR4表达 为了鉴别可应用于基于癌细胞的生物学特征开发新生物标志与治疗手段的新分子，使用 cDNA 微阵列(Kikuchi T et al.，Oncogene 2003,22 :2192-205 ；Kakiuchi S et al. ， Mol Cancer Res 2003, 1 :485-99 ；Kakuichi S et al. ， Hum MolGenet 2004,13 3029-43 ；Kikuchi T et al.，Int J Oncol 2006,28 :799-805 ；Taniwaki M et al.，Int J Oncol 2006，四567-7 对101个肺癌进行了基因组范围表达谱分析。在被筛选的32256 个基因中，在大部分检查的肺癌样品的癌细胞中鉴别出EBI3转录物的表达提升(五倍或更高)。它的过表达通过半定量RT-PCR实验在15个肺癌组织中的10个，22个肺癌细胞系中的17个中得到了确证(图1A)。本发明人进行了免疫荧光分析以检查肺癌细胞中内源 SYNGR4的亚细胞定位。在通过半定量RT-PCR实验在其中检测到了 SYNGR4转录物的LC319、 NCI-H1373与A549细胞中，主要在肿瘤细胞的细胞质中和表面上检测到高水平的SYNGR4， 但在NCI-H1781细胞以及源自支气管上皮的BEAS-2B与SAEC细胞中则不然，这些未显示 SYNGR4基因表达(图1B)。结果还指示SYNGR4抗体的特异性。预测SYNGR4编码具有四个跨膜域的细胞表面蛋白，然而，没有报道表明SYNGR4的N端和C端是否对应于细胞内或外部分。因此，本发明人首先在有或无细胞透化剂(如Triton-Χ)的条件下实施了免疫细胞化学分析。构建了设计成表达在C端有myc/His标签(pcDNA3. l-SYNGR4_myc/His)的和在N 端有3XFlag标签(pCAGGSn3F-SYNGR4)的SYNGR4的质粒。然后，将所述质粒或模拟质粒转染入C0S-7细胞中，并使用用于检测带myc标签的SYNGR4的抗myc抗体和用于检测带Flag标签的SYNGR4的抗Flag抗体对细胞染色。通过经Triton-X预处理的细胞的免疫细胞化学染色确认了细胞表面上和胞质中的SYNGR4蛋白表达。在无Triton-X处理的情况中只观察到SYNGR4蛋白的细胞表面染色(图1C，左边顶部小图)，指示SYNGR4蛋白的C端可能是细胞外部分。还确认了经N端带标签的SYNGR4表达载体转染的C0S-7细胞的细胞表面上有SYNGR4染色(数据未显示)。由于抗SYNGR4抗体识别SYNGR4的C端，在无Triton-X处理的情况中对肺癌LC319细胞实施了免疫荧光分析，并确认了内源SYNGR4蛋白的C端位于细胞外(图1C，左边底部小图)。为了进一步确认SYNGR4的C端和N端都是细胞外部分， 通过在第一抗体反应后用酸性甘氨酸处理细胞实施了免疫荧光分析。正如预期的，SYNGR4 阳性C0S-7细胞LC319细胞的细胞表面上的SYNGR4染色因通过酸性甘氨酸处理来剥离抗体而消失(图1C，右边小图)。还使用识别SYNGR4C端的相同抗SYNGR4抗体通过流式细胞术测量了 SYNGR4阳性和阴性肺癌细胞的表面上的SYNGR4蛋白水平，而且确认了在细胞表面上检测到SYNGR4的C和N端二者，而且膜SYNGR4蛋白水平与通过半定量RT-PCR检测到的SYNGR4基因表达水平有关联(图1D)。
使用SYNGR4cDNA片段作为探针的Northern印迹分析鉴定出一条1. 2kb转录物， 只在睾丸中有，但是在任何其它正常组织中没有(图2A)。本发明还用对SYNGR4特异性的多克隆抗体对五种正常组织(肝、心、肾、肺、和睾丸)和肺癌组织(ADC、SCC、和SCLC)检验了 SYNGR4蛋白表达。SYNGR4染色主要在肺肿瘤细胞和睾丸的胞质中观察到，但是在其它四种正常组织中检测不到(图2B)。
实施例3 :SYNGR4表达与NSCLC患者的不良预后的关联 为调查在肺致癌作用中SYNGR4的生物学与临床病理学意义，对含有来自339个进行了治愈性手术切除的NSCLC病例组织切片的组织微阵列实施了免疫组织化学染色。通过针对SYNGR4特异性的多克隆抗体检测到的SYNGR4染色主要见于肿瘤细胞的膜和胞质， 但不在正常肺细胞中观察到(图2C，左边小图)。本发明在组织微阵列上将SYNGR4表达模式分为从无(计分为0)到弱/强阳性(计分为1+到2+)。在339个NSCLC中，SYNGR4 在127(37. 5%)个病例中呈现强染色(计分2+)，在157(46. 3%)个病例中弱染色(计分 1+)，在55(16. 2%)个病例中无染色(计分0)(表1A)。然后，检查SYNGR4的表达(强阳性-弱阳性/无)与多种临床病理参数的关联，而且发现它与性别(在男性中为高，根据 Fisher氏确然检验P = O. 0487)、组织学类型(在非ADC中为高，根据Fisher氏确然检验 P = 0.0116)、以及淋巴结转移(在pNl-2中为高，根据Fisher氏确然检验P = 0.0175)有显著相关性(表1A)。NSCLC患者的中位存活时间显著较短，与SYNGR4高表达水平一致(P =0. 0002 ；时序检验；图2C，右边小图)。本发明还应用单变量分析以评价患者预后与多种因素，包括年龄、性别、病理学肿瘤分期(肿瘤大小；Tl对T2-3)、病理学淋巴结分期(node stage)(淋巴结状态；NO对附_2)、组织学(ADC对其它组织学类型)以及SYNGR4状态(计分0、1+对2+)之间的关联。所有这些变量均与不良预后显著相关。使用Cox比例风险模型进行多变量分析，确定SYNGR4(P = 0.0078)以及其它三种因素(年龄、肿瘤大小与淋巴结转移)在经手术治疗的NSCLC患者中都是独立的预后因素(表1B)。
表 1 表IA =NSCLC组织中的SYNGR4阳性与患者的特征之间的关联(n = 339)
权利要求
1.一种用于诊断肺癌的方法，所述方法包括下列步骤(a)通过选自下组的任一方法测定源自受试者的生物样品中基因的表达水平(i)检测SYNGR4 的 mRNA，(ii)检测SYNGR4蛋白；(iii)检测SYNGR4蛋白的生物学活性；并(b)将步骤(a)中测得的表达水平与所述基因的正常对照水平相比的升高与肺癌的存在关联起来。
2.权利要求1的方法，其中步骤(a)中测得的表达水平比正常对照水平高至少10%。
3.权利要求1的方法，其中步骤(a)中测得的表达水平是通过检测针对SYNGR4蛋白的抗体的结合来测定的。
4.权利要求1的方法，其中源自受试者的生物样品包括活检物、痰或血液、胸腔积液或尿液。
5.一种用于评估或确定具有肺癌的患者的预后的方法，该方法包括下列步骤(a)检测源自患者的生物样品中基因的表达水平；(b)将检出的表达水平与对照水平比较；并(c)基于(b)的比较来确定患者的预后且其中所述基因是SYNGR4。
6.权利要求5的方法，其中对照水平为良好预后对照水平，且将表达水平与对照水平相比的升高确定为不良的预后。
7.权利要求5的方法，其中升高是比对照水平高至少10%。
8.权利要求5的方法，其中表达水平是通过选自下组的任一方法测定的(a)检测SYNGR4 的 mRNA ；(b)检测SYNGR4蛋白；禾口(c)检测SYNGR4蛋白的生物学活性。
9.权利要求5的方法，其中源自患者的生物样品包括活检物、痰、血液、胸腔积液或尿液。
10.一种用于诊断肺癌或评估或确定具有肺癌的患者的预后的试剂盒，其包括选自下组的试剂(a)用于检测基因的mRNA的试剂；(b)用于检测由所述基因编码的蛋白的试剂；和(c)用于检测所述蛋白的生物学活性的试剂， 其中基因是SYNGR4。
11.权利要求10的试剂盒，其中所述试剂是针对所述基因的基因转录物的探针。
12.权利要求10的试剂盒，其中所述试剂是针对所述由基因编码的蛋白的抗体。
13.—种在导入细胞中时抑制SYNGR4体内表达以及细胞增殖的分离的双链分子，所述分子包含有义链和与其互补的反义链，所述链彼此杂交以形成双链分子。
14.权利要求13的双链分子，其中有义链包含与选自下组的靶序列对应的序列SEQ ID NO :11,12，19 和 20。
15.权利要求14的双链分子，其中有义链与反义链在靶序列处杂交以形成长度为19至25个核苷酸对的双链分子。
16.权利要求13的双链分子，其由单一多核苷酸组成，所述单一多核苷酸包含通过间插单链连接的有义链和反义链。
17.权利要求16的双链分子，其具有通式5'-[A]-[B]-[A' ]-3'，其中[A]为包含与选自SEQ ID NO 11,12，19和20的靶序列对应的序列的有义链，M为由3至23个核苷酸组成的间插单链，而[A']为包含与[A]互补的序列的反义链。
18.—种编码权利要求13至17的双链分子的载体。
19.载体，其包含包括有义链核酸和反义链核酸的多核苷酸组合中的任一项，其中所述有义链核酸包含SEQ ID NO 11,12，19或20的核苷酸序列，而所述反义链核酸由与有义链互补的序列组成，其中所述有义链和所述反义链的转录物彼此杂交以形成双链分子，且其中所述载体在导入表达SYNGR4基因的细胞中时抑制所述基因的表达。
20.一种用于治疗表达至少一种选自SYNGR4基因的基因的癌症的方法，其中该方法包括施用至少一种权利要求13的分离的双链分子或权利要求18或19的载体的步骤。
21.权利要求20的方法，其中要治疗的癌症是肺癌。
22.一种用于治疗表达SYNGR4基因的癌症的组合物，其中组合物包含至少一种权利要求13的分离的双链分子或权利要求18或19的载体。
23.权利要求22的组合物，其中要治疗的癌症是肺癌。
24.一种筛选用于治疗或预防肺癌或抑制肺癌细胞生长的候选化合物的方法，所述方法包括下列步骤(a)使测试化合物与由SYNGR4的多核苷酸编码的多肽接触；(b)检测所述多肽与测试化合物之间的结合活性；并(c)选择结合所述多肽的化合物。
25.—种筛选用于治疗或预防肺癌或抑制肺癌细胞生长的候选化合物的方法，所述方法包括下列步骤(a)使测试化合物与由SYNGR4的多核苷酸编码的多肽接触；(b)检测步骤(a)的多肽的生物学活性；并(c)选择与在所述测试化合物不存在下检出的该多肽的生物学活性相比遏制由 SYNGR4的多核苷酸编码的多肽的生物学活性的测试化合物。
26.权利要求25的方法，其中生物学活性选自下组促进细胞增殖和细胞侵袭。
27.—种筛选用于治疗或预防肺癌或抑制肺癌细胞生长的候选化合物的方法，所述方法包括下列步骤(a)使候选化合物与表达SYNGR4的细胞接触；并(b)选择与在测试化合物不存在下检出的表达水平相比降低SYNGR4的表达水平的候选化合物。
28.—种筛选用于治疗或预防肺癌或抑制肺癌细胞生长的候选化合物的方法，所述方法包括下列步骤(a)使候选化合物与其中导入了载体的细胞接触，该载体包含SYNGR4的转录调节区和在该转录调节区控制下表达的报道基因；(b)测量所述报道基因的表达或活性；并(C)选择与对照相比降低所述报道基因的表达或活性水平的候选化合物。
29.一种用于治疗或预防肺癌的组合物，所述组合物包括药学有效量的抗SYNGR4抗体或其片段。
30.一种用于在受试者中治疗或预防肺癌的方法，包括对所述受试者施用抗SYNGR4抗体或其片段。
31.一种筛选用于抑制SYNGR4多肽与GRB2多肽之间的结合或治疗或预防癌症的候选化合物的方法，所述方法包括下列步骤(a)使SYNGR4多肽或其功能等同物与GRB2多肽或其功能等同物在测试化合物存在下接触；(b)检测所述多肽间的结合；(c)比较在步骤(b)中检出的结合水平与在所述测试化合物不存在下检出的结合水平；并(d)选择与步骤(c)中在测试化合物不存在下检出的结合水平相比降低或抑制结合水平的测试化合物。
32.权利要求31的方法，其中SYNGR4的功能等同物包含酪氨酸_46。
33.一种筛选用于抑制SYNGR4的磷酸化或治疗或预防癌症的候选化合物的方法，包括下列步骤(a)使SYNGR4多肽或其功能等同物与测试化合物在容许所述多肽磷酸化的条件下接触；(b)检测(a)中描述的多肽的酪氨酸-46残基处的磷酸化水平；(c)比较所述多肽中酪氨酸-46残基的磷酸化水平与在所述化合物不存在下检出的蛋白中酪氨酸-46残基的磷酸化水平；并(d)选择降低多肽酪氨酸-46残基磷酸化水平的化合物作为候选化合物。
34.一种筛选用于抑制SYNGR4磷酸化下游效应器的活性或治疗或预防癌症的候选化合物的方法，包括下列步骤(a)使测试化合物与由SYNGR4的多核苷酸编码的多肽在由多核苷酸GRB2和PAKl编码的多肽存在下，在选自PAK1，c-Raf，MEKl, MEK1/2和ERK1/2的至少一种SYNGR4下游效应器的磷酸化条件下接触；(b)检测所述SYNGR4下游效应器的磷酸化水平；并(c)选择与在测试化合物不存在下检出的该SYNGR4下游效应器的磷酸化水平相比遏制SYNGR4下游效应器的磷酸化水平的测试化合物。
35.权利要求34的方法，其中要检测的SYNGR4下游效应器的磷酸化水平分别是 PAKld 的 Thr423、c-Raf 的 Ser338、MEKl 的 Ser298、MEK1/2 的 Ser217/221、和 ERK1/2 的 Thr202/204的磷酸化水平。
36.权利要求31-35中任一项的方法，其中所述癌症为肺癌。
全文摘要
本发明涉及SYNGR4基因在肺癌致癌作用中发挥的作用，特征在于一种通过施用针对一种或多种SYNGR4基因的双链分子或含有此类双链分子的组合物、载体或细胞和抗体来治疗或预防肺癌的方法。本发明特征还在于使用一种或多种选自SYNGR4的过表达基因来诊断肺癌或评估/确定具有肺癌，尤其是NSCLC或SCLC的患者的预后的方法。为了该目的，SYNGR4可充当肺癌的新型血清学生物标志物。还公开了鉴定用于治疗和预防肺癌的化合物的方法，该方法使用化合物对肺癌中一种或多种SYNGR4的过表达的影响作为指标。
文档编号A61K31/713GK102203250SQ200980142749
公开日2011年9月28日 申请日期2009年8月24日 优先权日2008年8月27日
发明者中村佑辅, 醍醐弥太郎, 富樫亮 申请人:肿瘤疗法科学股份有限公司