专利名称：基因诊断的微流控芯片电泳无胶筛分体系及其制备方法
技术领域：
本发明涉及微流控芯片电泳技术，尤其涉及一种基因诊断的微流控芯片电泳无胶
筛分体系及其制备方法。
背景技术：
毛细管电泳法已经可以实现对蛋白质、DNA片段的分离。凝胶是毛细管电泳中常用 的电泳介质，由于凝胶的粘度非常大，抗对流，能够减小分离物质的扩散，能够很好地限制 谱带的展宽，分离效果很好，分离度高，柱效极高，广泛应用在科研及医学疾病诊断中，特别 是在基因诊断中的PCR产物检测以及DNA的序列测定中。然而毛细管电泳消耗样品量大使 得PCR过程变长，分离时间长使得结果分析不迅速，灵敏度也不够高，分析一次样品需要30 分钟以上。而且凝胶的粘度很大使得凝胶的填充很困难。凝胶电泳时容易造成柱内气泡， 从而使得毛细管寿命较短。 随着微全分析系统的建立以及芯片实验室的发展，根据毛细管中的电泳理论及技 术发展了一种微流控芯片电泳技术，同样包括样品的上样与电泳分离。微流控芯片由于其 样品消耗量小、反应快、灵敏度高、成本低和制作周期短而得到广泛应用。针对微流控芯片 所具有的优点及毛细管凝胶电泳所存在的缺点，希望能有一种适合于微流控芯片电泳的快 速基因诊断的无胶筛分体系。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术存在的缺点和不足，提供一种基因诊断的微流控
芯片电泳无胶筛分体系及其制备方法。 本发明的目的是这样实现的 1、体系 以水为溶剂； 以MES-Tris为背景电解质； 以羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羟乙基纤维素、聚乙烯醇或聚环氧乙稀及其 2 5种的混合物为筛分介质； 以葡萄糖、甘油、甘露醇或壳聚糖及其2 4种的混合物为添加剂；MES-Tris的浓度范围为10 300mmol/L的MES， 10 300mmol/L的Tris， pH为
5. 5 9. 0 ; 筛分介质的浓度(筛分介质的质量/体系的体积)为0. 1% 5% ;
添加剂的浓度(添加剂的质量/体系的体积)为0. 1 % 10% 。
其工作原理是MES(2-[N-吗啉代]甲磺酸)和Tris(三羟甲基氨基甲烷)是一种很好的生物缓 冲液体系，pH范围广，可以从5. 5到9. O，具有很好的生物相容性。 与凝胶相比，羟丙基甲基纤维素(HPMC)等纤维素衍生物在低浓度下，O. 1% 5%
3范围内具有较低的粘度，特别是HPMC-5， 25t:下在2%的水溶液中，其粘度只有5cP，和水的
粘度在一个数量级上。高分子聚合物溶于水中后，分子相互缠绕，形成孔径大小一致的网状
结构，孔径的大小和聚合物的种类、分子的大小以及聚合物的浓度有关。在一定电场下，DNA
分子按照大小不同，在筛分介质中运行的速度不一样，DNA分子小的运动速度快，DNA分子
大的运动速度慢，据此可以分离大小不一的PCR扩增样品。由于DNA分子在芯片电泳中的
迁移速度只与其分子大小有关，所以可根据其迁移时间来确定DNA片段的大小，从而实现
对PCR产物分析，以便确定对疾病的诊断。然而，仅仅只有纤维素衍生物等高分子聚合物充
当筛分介质时，缓冲液体系的筛分能力，也即可分辨出两个相差最小的DNA片段的能力有
限，所以在此基础上添加一些低分子的多羟基有机物，比如葡萄糖、甘油、甘露醇等，可以提
高筛分介质的分离效率。纤维素衍生物具有很好的生物相容性，葡萄糖等多羟基有机物也
没有毒性，对于PCR产物的分析检测没有毒性影响。 2、制备方法 本制备方法包括下列步骤 ①配制背景电解质 称量MES和TRIS，加入去离子水中，搅拌均匀，使得MES的浓度为10 300mmo1/ L， TRIS的浓度的浓度为10 300mmol/L ;利用pH计调节背景电解质的pH，使其在5. 5
9. 0 ; ②加入筛分介质 加入称量好的筛分介质，使筛分介质的质量/体系的体积为0. 1% 5% ; ③加入添加剂 根据需要加入添加剂，使添加剂的质量/体系的体积为0. 1 % 10% 。 3、用途 本发明所提供的基因诊断的微流控芯片电泳无胶筛分体系，适合于分离临床疾病 的PCR产物，从而对诊断疾病做出参考。 本发明具有下列优点和积极效果 使用操作方便，筛分效果好，分离效率高。
图1为分离100bp ladder DNA marker标准片段的微流控芯片无胶筛分电泳图；
图2为分离①X174-HaelIIDNA标准片段的微流控芯片无胶筛分电泳图；
图3为假肥大肌营养不良所对应基因的阴性样品的PCR扩增产物的微流控芯片无 胶筛分电泳图； 图4为假肥大肌营养不良所对应基因的阳性样品的PCR扩增产物的微流控芯片无
胶筛分电泳图。
英译汉 PCR : (Polymerase Chain Reaction)聚合酶链反应，是80年代中期发展起来的体 外核酸扩增技术。它具有特异、敏感、产率高、快速、简便、重复性好、易自动化等突出优点； 能在一个试管内将所要研究的目的基因或某一 DNA片段于数小时内扩增至十万乃至百万 倍，使肉眼能直接观察和判断；可从一根毛发、一滴血、甚至一个细胞中扩增出足量的DNA
4供分析研究和检测鉴定。过去几天几星期才能做到的事情，用PCR几小时便可完成。PCR技 术是生物医学领域中的一项革命性创举和里程碑。
具体实施方式
—、体系 1、筛分介质可以是一种高分子聚合物，也可以是多种高分子聚合物的混合物。
2、添加剂可以是一种低分子亲水有机物，也可以是多种低分子亲水有机物的混合 物。 二、实施例
1、实施例1 以MES-Tris(80mM MES，40mM Tris)为背景电解质，pH为6. 12，以2%的羟丙基甲 基纤维素(HPMC-50，25°C 2%的水溶液下，其粘度为50cP)为筛分介质构成筛分体系。
实用该筛分体系成功的分离了 100bp ladder DNA marker标准片段，marker中的
六个片段都得到了基线分离，分离效果很好(图1)。
2、实施例2 以MES-Tris(80mM MES， 40mMTris)为背景电解质，p朋.12，以3. 5%的羟丙基纤维 素(HPC)为筛分介质构成筛分体系。使用该筛分体系成功地分离了①X174-HaelIIDNA标 准片段，其中的271bp和281bP这两个带得到了很好的分离(图2)。同时，利用该体系对 假肥大型肌营养不良这种疾病的PCR扩增产物进行了微流控芯片无胶筛分电泳分离。图3 和图4分别是利用该筛分体系对人体假肥大肌营养不良阴性样品和阳性样品的电泳分离。 从图3中可以看出，正常人的外显子47含量比外显子6和外显子13的含量少，而从图4中 的阳性样品检测看出，外显子47的含量比外显子6和外显子13的含量多，据此，根据样品 电泳分离结果通过判断外显子47与外显子6和外显子13的含量多少就可以判断出是否患 病。应用这一无胶筛分体系进行假肥大型肌营养不良的基因诊断，对临床疾病诊断具有重 要意义。
权利要求
一种基因诊断的微流控芯片电泳无胶筛分体系，其特征在于以水为溶剂；以MES-Tris为背景电解质；以羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羟乙基纤维素、聚乙烯醇或聚环氧乙稀及其2～5种的混合物为筛分介质；以葡萄糖、甘油、甘露醇或壳聚糖及其2～4种的混合物为添加剂；MES-Tris的浓度范围为10～300mmol/L的MES，10～300mmol/L的Tris，pH为5.5～9.0；筛分介质的浓度为0.1％～5％；添加剂的浓度为0.1％～10％。
2. 按权利要求1所述体系的制备方法，其特征在于包括下列步骤① 配制背景电解质称量MES和TRIS，加入去离子水中，搅拌均匀，使得MES的浓度为10 300mmol/L， TRIS的浓度的浓度为10 300mmol/L ;利用pH计调节背景电解质的pH，使其在5. 5 9. 0 ;② 加入筛分介质加入称量好的筛分介质，使筛分介质的质量/体系的体积为0. 1% 5% ;③ 加入添加剂根据需要加入添加剂，使添加剂的质量/体系的体积为0. 1% 10%。
全文摘要
本发明公开了一种基因诊断的微流控芯片电泳无胶筛分体系及其制备方法，涉及微流控芯片电泳技术。本体系是以水为溶剂；以MES-Tris为背景电解质；以羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羟乙基纤维素、聚乙烯醇或聚环氧乙烯及其2～5种的混合物为筛分介质；以葡萄糖、甘油、甘露醇或壳聚糖及其2～4种的混合物为添加剂。本制备方法是①配制背景电解质；②加入筛分介质；③加入添加剂。本发明使用安全方便，分离效率高，效果好；适合于分离临床疾病的PCR产物，从而对诊断疾病做出参考。
文档编号G01N27/447GK101693925SQ20091027243
公开日2010年4月14日 申请日期2009年10月16日 优先权日2009年10月16日
发明者刘威, 翁毅 申请人:武汉普赛微流科技有限责任公司;