专利名称：一种诊断α－地中海贫血病的试剂及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种疾病诊断试剂及其应用，特别是涉及一种诊断α-地中海贫血病的试剂及其应用。
成人血红蛋白(HbA)由2条α-珠蛋白链和2条β-珠蛋白链与一个原子Fe结合而成，即α2β2，具有很好的输送氧气的功能。胎儿早期血红蛋白由2条ξ链和2条γ链组成(ξ2γ2)，后期ξ珠蛋白的基因表达逐渐关闭，α-珠蛋白基因开始表达，故胎儿血红蛋白(HbF)组成为α2γ2。出生后，γ-珠蛋白的链又逐渐被β-珠蛋白链取代，故HbA由α2β2组成。
α-地中海贫血患者α链和β链失去平衡，相对过多的β链自己聚合成β4聚体，但β4不稳定，容易解聚形成H包涵体沉积在红细胞内，附着在红细胞膜上，使红细胞变形性降低，易遭破坏产生溶血，患者表现为红细胞不均(又称为异型红细胞症)中度或严重贫血，肝脾肿大。从分子病理学的角度来看，编码α-珠蛋白链的α-珠蛋白基因是位于人类16号染色体上的一个基因簇，从5’至3’依次为ξ-ψξ(假ξ)-ψα2-ψα1-α2-α1-θ1，其中ξ产生胎儿血红蛋白的组成成分ξ珠蛋白链，在胎儿早期表达。后期至出生后，逐渐被α2，α1所代替。α2，α1是两个重要的功能基因，虽然二者的序列99.99％都完全相同，但研究表明，α2基因的表达要比α1强。由于α1与α2之间的高度同源性，故两条染色体上的4个α基因之间很可能发生不等交换，造成例如一条染色体上三个α基因串联，而另一条染色体上只剩下一个α基因(-α3.7或-α4.2)等α基因的多种大片段缺失。导致我国α-地中海贫血的α基因的缺失，除-α37和-α4.2外，还有一种缺失范围长达20Kb的包括α2，α1在内的严重缺失，称为东南亚型缺失(--SEA)。α-地中海贫血在临床上划分为4型静止型，轻型，标准型(血红蛋白病，HbH病)，以及Bart’s水肿胎儿(巴氏水肿胎儿)。静止型又称为地中海贫血2或α+-地中海贫血，基本无症状，是缺失一个α-基因的携带者。轻型α-地中海贫血又称为α-地中海贫血1或α0-地中海贫血，有轻微贫血症状，多是因缺失2个α基因所致。HbH病是临床上最常见的α-地中海贫血类型，有明显甚至严重的贫血症状。患儿从1岁左右即出现贫血，严重者肝脾肿大及黄疸，面黄肌瘦并伴骨骼变化，靠输血维持生命，HbH病患者共缺失或相当于缺失三个α基因。其基因型为-α3.7/--SEA或-α4.2/--SEA或αTα/--SEA(αTα为非缺失型，在我国只发现二种点突变，其功能相当于缺失一个α基因，比缺失型少见得多)。巴氏水肿胎儿是最严重的一种，胎儿4个有功能的α基因全部缺失(--SEA/--SEA)，生下来就是死胎或很快就死亡。
迄今为止，医学上对于α-地中海贫血尚无有效的根治方法，因此开展基因诊断、携带者检查及产前诊断，是预防新生患儿出生，阻断有害基因下传，提高人口素质的唯一有效措施。1980年起国际上开始应用限制性内切酶加Southern印迹杂交技术诊断缺失型α-地中海贫血，用放射性同位素标记的α、ξ珠蛋白基因探针进行杂交，根据显带图谱，可鉴别诊断α-地中海贫血1、α-地中海贫血2、HbH病和Bart’s水肿胎等。早期对非缺失型α-地中海贫血的基因诊断主要利用限制性内切酶酶切片段长度多态性(RFLP)连锁分析来作出的，有9个多态性位点能提供较好的多态信息。自1984年PCR技术问世后，该技术即被迅速广泛用于多种遗传病的基因诊断。1990年Lebo等应用PCR检测α-地中海贫血1，Dode和Baysal等则应用PCR检测α-地中海贫血2，虽然PCR的基本操作技术已有许多报道，但目前用PCR技术检测α-地中海贫血仍然存在着一些亟待解决的技术难题，例如不易区别缺失纯合子与杂合子，重复性较差，不能同时针对多种缺失进行检测等。
为实现上述目的，本发明采用以下技术方案一种诊断α-地中海贫血病的试剂，它基本上是由引物、(NH4)2SO4、dATP、dCTP、dTTP、dGTP、deaza-dGTP、二甲基亚砜、β-巯基乙醇、小牛血清白蛋白和TaqDNA聚合酶组成的。
所述引物为7条，7条引物的核苷酸序列分别是1、5’ctt tcc cta ccc aga gcc agg 3’2、5’gcc caa ggg gca aga agc atg 3’3、5’cag cac ctt ctc ttg agc agg c 3’4、5’ttt gaa tga agt ccg agt agg cag 3’5、5’ccc tgg gtg tcc agg agc aag cc 3’
6、5’gta tcc tct gtc ctg acc gag aa 3’7、5’aga tat atg ggt ctg gaa gtg tat c 3’所述7种引物的用量在每25μl的反应液中依次为0.04-0.08μg，0.08-0.14μg，0.08-0.14μg，0.04-0.10μg，0.02-0.06μg，0.08-0.15μg，0.08-0.15μg。
本发明试剂优选的各组分含量分别为引物0.42-0.82μg/25μl反应液(NH4)2SO420-50mmole/LdATP、dCTP、dTTP0.1-0.3mmole/LdGTP、deaza-dGTP0.05-0.15mmole/L二甲基亚砜 3-7μl/25μl反应液β-巯基乙醇 0.01-0.05μl/25μl反应液小牛血清白蛋白 0.1-0.5μl/25μl反应液TaqDNA聚合酶1-2单位/25μl反应液本发明中优选的DNA聚合酶为Taq DNA聚合酶。
聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction，PCR)，又称基因体外扩增，是美国科学家Mullis于1984年发明的，能够在一个简单的试管反应中，从极少量基因组DNA合成上百万拷贝数的靶DNA片段。PCR扩增DNA片段的特异性是由两个人工合成的寡核苷酸引物的序列决定的。后者分别与待扩增的DNA片段的两条链3’末端的DNA序列互补。
本发明基于PCR技术，巧妙地设计了能够进行α-地中海贫血诊断的多重基因扩增的试剂，利用该试剂，可以对待检测全DNA进行4重PCR扩增，扩增产物经琼脂糖凝胶电泳会得到4条电泳带，但每份标本只可能出现1至2条带，籍此可以准确诊断多种缺失型和非缺失型的α-地中海贫血病，重复性及准确率均达到99.9％以上。
检测东南亚型缺失的两个引物6、7，分别特异于20Kb缺失片段上游断点的5’端和下游断点的3’端。存在东南亚型缺失时，可扩增得到一条0.8Kb的扩增带，但从没有该缺失的染色体得不到扩增产物，因为二者相距太远，因此，只要出现0.8Kb带，即可诊断为有东南亚型缺失。
检测-α3.7缺失的二条引物1和2，分别特异于上游断点的5’端特异区内和下游断点的3’端，两个位点相距约5Kb之遥，只有存在-α3.7Kb缺失时，二者可以扩增得到一条1.6Kb带。换言之，得到1.6Kb带，即诊断为有-α3.7Kb缺失。
检测-α4.2缺失的二条引物是4和5。引物4设计在-α4.2缺失上游断点的5’端，引物5在下游断点的3’端。引物4和5从-α4.2缺失的α基因将扩增出一条1.5Kb带，从无此缺失的α基因得不到扩增带。只要电泳图谱中出现1.5Kb带，就表示有-α4.2缺失。
引物1还可以和特异于α2基因3’的引物3配对，从正常或非缺失型的α基因扩增出一条1.9Kb带，这条1.9Kb带能起到区分缺失杂合子与纯合子的作用，还可以用来进一步查证2种点突变。
用本发明试剂检测包括正常人DNA、α-地中海贫血病患者和携带者在内的各种DNA标本，每个标本至少应出现一条带，如果一条带也没有，就表示实验失败，需查找原因。
α-地中海贫血在我国南方乃至世界范围内有很高的发病率，严重威胁着人们的健康和人口素质的提高，同时也是制约经济发展的一个不利因素。本发明的试剂使用方便，准确度高，对于α-地中海贫血病的诊断在我国及东南亚各国均适用，同时在α-地中海贫血病的基因芯片诊断中也将得到广泛应用，具有重大的社会效益及经济效益。
下面结合具体实施例对本发明做进一步说明。
7、5’aga tat atg ggt ctg gaa gtg tat c 3’7条引物在25μl的反应液中的量依次为0.06μg，0.11μg，0.11μg，0.07μg，0.04μg，0.12μg，0.12μg实施例2、用本发明的试剂诊断α-地中海贫血1、从外周血白细胞、绒毛或羊水细胞提取基因组DNA；2、将DNA加入到实施例1的试剂中，进行PCR反应，反应条件为予变性94℃，4分钟，然后热变性，94℃，60秒；退火，55℃，30秒；链延伸，72℃，60秒，循环32次，70℃，10分钟；3、将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，根据得到的谱带类型(如表1所示)判断是否患有α-地中海贫血，作出全面的分子遗传学诊断、检出携带者或对胎儿作出产前诊断。
表1PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳谱带结果与相应的患病情况
权利要求
1.一种诊断α-地中海贫血病的试剂，它基本上是由引物、(NH4)2SO4、dATP、dCTP、dTTP、dGTP、deaza-dGTP、二甲基亚砜、β-巯基乙醇、小牛血清白蛋白和TaqDNA聚合酶组成的。
2.根据权利要求1所述的诊断α-地中海贫血病的试剂，其特征在于所述引物为7条。
3.根据权利要求2所述的诊断α-地中海贫血病的试剂，其特征在于所述7条引物的核苷酸序列分别是1、5’ctt tcc cta ccc aga gcc agg 3’2、5’gcc caa ggg gca aga agc atg 3’3、5’cag cac ctt ctc ttg agc agg c 3’4、5’ttt gaa tga agt ccg agt agg cag 3’5、5’ccc tgg gtg tcc agg agc aag cc 3’6、5’gta tcc tct gtc ctg acc gag aa 3’7、5’aga tat atg ggt ctg gaa gtg tat c 3’
4.根据权利要求3所述的诊断α-地中海贫血病的试剂，其特征在于所述7种引物的用量在每25μl的反应液中依次为0.04-0.08μg，0.08-0.14μg，0.08-0.14μg，0.04-0.10μg，0.02-0.06μg，0.08-0.15μg，0.08-0.15μg。
5.根据权利要求1或2或3或4所述的诊断α-地中海贫血病的试剂，其特征在于所述各组分的含量分别为引物 0.42-0.82μg/25μl反应液(NH4)2SO420-50mmole/LdATP、dCTP、dTTP 0.1-0.3mmole/LdGTP、deaza-dGTP 0.05-0.15mmole/L二甲基亚砜 3-7μl/25μl反应液β-巯基乙醇 0.0-0.05μl/25μl反应液小牛血清白蛋白 0.1-0.5μl/25μl反应液TaqDNA聚合酶 1-2单位/25μl反应液
6.权利要求1的试剂在诊断α-地中海贫血病中的应用。
7.权利要求1的试剂在α-地中海贫血病基因芯片诊断中的应用。
全文摘要
本发明的名称是一种诊断α－地中海贫血病的试剂及其应用。涉及一种疾病诊断试剂及其应用。本发明的目的是提供一种诊断α－地中海贫血病的试剂，利用该试剂，可以方便准确地检测出缺失型与非缺失型的多种α－地中海贫血病。本发明的试剂基本上由引物、(NH
文档编号C12Q1/25GK1448514SQ02103839
公开日2003年10月15日 申请日期2002年3月29日 优先权日2002年3月29日
发明者王立荣 申请人:王立荣