专利名称：：一种猪呼吸系统疾病抗病育种方法及其专用试剂盒的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一种猪呼吸系统疾病抗病育种方法及其专用试剂盒。
背景技术：
：随着养猪业向规模化、集约化的方向发展，猪呼吸系统疾病成为养猪生产的主要问题。高密度的饲养方式，频繁的周转，常引起猪只应激反应增加，机体抵抗力下降；而且高密度的猪群造成猪舍内小气候环境恶劣，空气污浊、刺激性大，刺激上呼吸道粘膜发生炎症，猪只很容易感染呼吸系统疾病，规模化猪场的发病率通常为30%60%，死亡率为5%30%。猪呼吸系统疾病造成了猪生长速度缓慢、饲料报酬低、死亡率上升、推迟上市，管理上恶性循环等严重经济损失。呼吸系统疾病己成为阻碍猪发挥最大生长遗传潜能的重要因素之一，同时也是猪病中耗资最大的疾病，已成为目前影响全球养猪业的头号疾病。因此，研究抗呼吸系统疾病分子机理并通过育种手段提高猪抗呼吸系统疾病的能力，具有非常重大的经济意义和社会意义。猪呼吸系统疾病种类繁多，不同种群对呼吸系统疾病的抵抗力差异巨大，其抗病力遗传机制复杂，传统育种方法很难有效提高群体抗呼吸系统疾病的能力，随着分子生物学技术和猪基因组研究的飞快发展，育种更准确、进展更快的分子育种己经提上历史舞台，从分子生物学角度研究猪呼吸系统疾病抗病分子机理，研究候选基因和分子遗传标记，运用标记方法辅助选择可以快速、高效的达到育种的目的。目前，在分子水平上，人类医学研究领域已经发现了一些保护肺免受感染的关键基因如Scgblal、Hc、Lyz-M、Lyz-P、Marco、Chi311、Defb35、Daf1和SP-A等(Wan，etal.Foxa2isrequiredfortransitiontoairbreathingatbirth.PNAS，2004,101:14449-14454.)。在哺乳动物的肺泡表面覆盖着一层肺表面活性物质，它们由90%的脂质和10%的蛋白(SP)组成，能够降低肺泡的液-气界面表面张力，在低的肺容量时防止肺泡塌陷，维持肺泡的功能(王凤英.肺表面活性物质蛋白的功能及表达调节.中国临床康复.2004,8:2354-2355.)。肺表面活性物质的蛋白质SP分为SP-A、SP-B、SP-C和SP-D四种。SP-A是亲水蛋白质，与肺部的天然免疫和脂质稳定性有关(VanEijk，etal.PorcinelungsurfactantproteinD:complementaryDNAcloning,chromosomallocalization,andtissuedistribution.JImmunol.2000，164:1442-1450;王方勇等.SP-A、SP-D与肺部天然免疫防御.免疫学杂志，2002，6:S75-S77.)。Erpenbeck等研究发现，肺表面活性物质组成成分，尤其是SP-A通过肺泡的巨噬细胞来调整各种病原的吞噬作用，对病原的清除和吸入颗粒的清除都具有重要作用，并且可能解释SP-A在过敏性呼吸道炎症中的抗炎性作用(Erpenbeck,etal.SurfactantproteinDincreasesphagocytosisandaggregationofpollen—allergenstarchgranules.AmJPhysiolLungCellMolPhysiol.2005，288:L692-L698.)。Jack等证实，SP-A分泌不足，不仅会增加肺的易感染性，甚至产生自身免疫性疾病，这说明了SP-A同肺脏的防御功能密切相关(Jack,etal.Mannose-bindinglectin:targetingthemicrobialworldforcomplementattackandopsonophagocytosis.Immunol,2001，180:86-99.)。汪隽瑛等研究发现，哮喘组大鼠的BALF、肺及支气管中的SP-A较对照组表达量明显下降，这将使呼吸道易感性增加，也可能是哮喘患者易患呼吸道感染的原因之一(汪隽瑛等.哮喘大鼠肺表面活性物质结合蛋白A的变化及其意义.第二军医大学学报，2004，25:1255-1257.)。另外在急性肺损伤早期和高原RDS(呼吸窘迫综合征)中SP-A基因的表达水平降低(deMello，etal.ImmunogoldlocalizationofSP-Ainlungsofinfantsdyingfromrespiratorydistresssyndrome.AmJ"Pathol1993，142:1631-1640;肖燕，崔怀社.急性肺损伤肺表面活性蛋白A、B含量变化.第三军医大学学报，2001，23:154-156.)。有研究发现SP-A(-/-)小鼠容易受到呼吸道微生物的感染，而给予外源性SP-A可加强微生物的清除，抑制炎症(Harrod，etal.SP-Aenhancesviralclearanceandinhibitsinflammationafterpulmonaryadenoviralinfection.AmJPhysiol1999，277:L580-L588.)。鉴于在肺免疫防御中的作用，SP-A基因已经成为呼吸系统疾病抗病候选基因。
发明内容本发明的目的是提供一种猪呼吸系统疾病抗病育种方法及其专用试剂盒。本发明提供的培育猪的方法，是检测待测猪的GenBankAccessionNumberDQ985806的第2848位脱氧核糖核苷酸是G还是A,确定待测猪的基因型是GG、GA还是AA，采用GG基因型的猪进行育种；所述GG基因型为GenBankAccessionNumberDQ985806的自5'末端第2848位脱氧核糖核苷酸为G的纯合体；所述AA基因型为GenBankAccessionNumberDQ985806的自5'末端第2848位脱氧核糖核苷酸为A的纯合体；所述GA基因型为它们的杂合体。所述确定待测猪的GenBankAccessionNumberDQ985806的自5'末端第2848位脱氧核糖核苷酸是G还是A的方法可采用任何现有方法，如基因测序、PCR-SSCP法等。所述确定待测猪的GenBankAccessionNumberDQ985806的自5'末端第2848位脱氧核糖核苷酸是G还是A的方法具体可为单链构象多态性分析。所述单链构象多态性分析包括PCR和对所得到的PCR产物进行电泳的步骤。所述PCR的引物对需要满足如下条件以猪的基因组DNA为模板进行PCR扩增的产物含有GenBankAccessionNumberDQ985806的自5'末端第2848位脱氧核糖核苷酸。所述PCR的引物对具体可为具有序列表中序列1所示序列的核苷酸和具有序列表中序列2所示序列的核苷酸。所述电泳具体可为聚丙烯酰胺凝胶电泳，如12%的聚丙烯酰胺凝胶电泳。用所述引物对进行PCR，然后进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，电泳结果中，GA基因型的待测猪的PCR产物显示4条电泳条带；GG基因型的待测猪的PCR产物显示两条电泳条带，且该两条电泳条带与所述GA基因型按电泳方向的第一条电泳带和第三条电泳带的电泳迁移率相同；AA基因型的待测猪的PCR产物显示两条电泳条带，且该两条电泳条带与所述GA基因型按电泳方向的第二条电泳带和第四条电泳带的电泳迁移率相同。本发明还提供了一种辅助检测猪呼吸系统疾病抗病性的试剂盒，含有满足如下条件的引物对以猪的基因组DNA为模板进行PCR扩增的产物含有GenBankAccessionNumberDQ985806的自5'末端第2848位脱氧核糖核苷酸。所述引物对具体可为具有序列表中序列1所示序列的核苷酸和具有序列表中序列2所示序列的核苷酸。当采用引物1和引物2进行PCR扩增时，根据待测猪的基因组DNA的不同，GG基因型的待测猪扩增得到的DNA片段为序列3所示的核苷酸序列；AA基因型的待测猪扩增得到的DNA片段为序列4所示的核苷酸序列；GA基因型的待测猪扩增得到的DNA片段为序列3所示的核苷酸序列和序列4所示的核苷酸序列的混合物。所述试剂盒还可包括进行PCR的试剂和进行电泳的试剂。所述试剂盒可应用于猪的育种中。猪GenBankAccessionNumberDQ985806自5'末端第2848位脱氧核糖核苷酸存在一个脱氧核糖核苷酸的差异(G/A)，导致SP-A(pulmonarysurfactantproteinA)蛋白序列(GenBankAccessionNumberEU622632)第147位氨基酸残基自Ala到Thr的变化，将该单核苷酸多态命名为A147T。GG纯合基因型群体发病率比AA纯合基因型群体发病率低约10%以上，所以该A147T可作为猪呼吸系统疾病抗病分子育种标记。本发明使用PCR-SSCP方法检测A147T，只需进行PCR反应和聚丙烯酰胺凝胶电泳，根据电泳条带位置及条带数即可判别个体的基因型，不出现杂带，基因型判型非常准确，耗时较短(约1012个小时)，检测费用很低，具有很高的育种实践应用价值。用本发明的方法对猪呼吸系统疾病抗病性进行选择，可使猪群呼吸系统发病率降低约10%，从而获得可观的经济效益。应用本发明提供的方法对猪进行育种，可对待选猪进行早期筛选，有效地缓解实际生产中的呼吸系统疾病问题，提高经济效益。本发明的检测方法操作简单、费用低廉、准确度高，并可实现自动化的直接检测。本发明将在猪的育种工作中发挥巨大作用。以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。图1为猪SP-A基因A147T位点PCR-SSCP多态性图。图2为序列Ml和序列M2的测序结果图。具体实施例方式下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。以下实施例中的引物均由上海英骏生物技术有限公司合成。实施例1、育种方法的建立一、A147T多态性位点的确定1、PCR扩增根据猪SP-A基因基因组DNA序列(GenBankAccessionNumberDQ985806)信息，设计一对引物如下U(上游引物):5，-TGAATGAGTAGAATGATGAGAA-3，(序列表的序列1);D(下游引物)5，-GGGCAGCGATGCGTCCACCTG-3，(序列表的序列2)。选择大白猪(5只)为实验材料。以大白猪基因组DNA为模板，使用引物U和D进行PCR扩增。扩增体系为猪基因组DNA200ng，10XPCR扩增缓冲液2.5W，dNTPs5mM，上、下游引物各50ng，TaqDNA聚合酶0.75U，Mg2+2.5mmol/L，用ddH20补充反应体系至25W。PCR反应条件为95。C变性5min;然后95。C变性20s，52.4。C退火30s，72°C延伸30s，共35个循环；最后72。C延伸10min。PCR产物经琼脂糖凝胶检测后于-2(TC保存。以5头大白猪的基因组DNA为模板进行扩增的产物分别命名为产物1，产物2、产物3、产物4和产物5。2、SSCP分析取步骤1得到的5种PCR产物各1.5W，分别与上样缓冲液(98%甲酰胺，0.09%溴酚兰，0.09%二甲苯氰，2%甘油，0.lmol/LEDTA)混合，置于PCR仪上98°C变性10min，迅速置冰上冷却10min，再进行12%聚丙烯酰胺凝胶电泳(12-14h，电压8V/cm),银染显色。结果如图l所示。图1中，1:产物l;2:产物2;3:产物3;4:产物4;5:产物5。5种PCR产物分别显示三种带型，产物1显示一种带型，产物2和产物3显示一种带型，产物4和产物5显示一种带型。产物1显示4条电泳条带，产物2和产物3显示与产物1按电泳方向(从上至下)第一条电泳带和第三条电泳带具有相同电泳迁移率的两条电泳条带，产物4和产物5显示与产物1按电泳方向(从上至下)第二条电泳带和第四条电泳带具有相同电泳迁移率的两条电泳条带。3、克隆测序及序列分析根据PCR-SSCP分析结果，分别将5种PCR产物用琼脂糖凝胶回收试剂盒(天根生化科技有限公司)回收纯化，回收的DNA片段连接载体pGEM-T(Promega公司)后，将连接产物转化大肠杆菌DH5a感受态细胞，根据载体上的羧卞青霉素抗性标记筛选阳性克隆，得到含有回收片段的重组质粒。以该重组质粒载体上的T7和SP6启动子序列为弓I物对其进行核苷酸序列测定(北京诺赛基因生物工程技术服务有限公司)。测序结果表明产物1为序列M1和序列M2的混合物，产物2和产物3均为序列Ml，产物4和产物5均为序列M2;序列Ml和序列M2的长度均为296bp，只存在一个脱氧核糖核苷酸的差异(G/A)(见图2)，此脱氧核糖核苷酸为GenBankAccessionNumberDQ985806的自5'末端第2848位脱氧核糖核苷酸，导致SP-A基因蛋白序列(GenBankAccessionNumberEU622632)第147位氨基酸残基自Ala到Thr的变化，将该单核苷酸多态命名为A147T。序列Ml的核苷酸序列见序列表的序列3，序列M2的核苷酸序列见序列表的序列4。将GenBankAccessionNumberDQ985806的自5'末端第2848位脱氧核糖核苷酸为G的纯合体基因型命名为GG，GenBankAccessionNumberDQ985806的自5'末端第2848位脱氧核糖核苷酸为A的纯合体基因型为AA，它们的杂合体基因型为GA。GA基因型的猪，通过SSCP分析，显示4条电泳条带；GG基因型的猪，通过SSCP分析，显示与所述GA基因型按电泳方向第一条电泳带和第三条电泳带具有相同电泳迁移率的两条电泳条带；AA基因型的猪，通过SSCP分析，显示与所述GA基因型按电泳方向第二条电泳带和第四条电泳带具有相同电泳迁移率的两条电泳条带。二、A147T多态与猪呼吸系统疾病发病率的相关性分析为确定A147T多态与猪呼吸系统疾病发病率是否相关，以493头大白猪为实验材料，进行如下试验提取基因组进行PCR-SSCP分析，方法同步骤一；同时观察和记录表型，鉴定大白猪是否患呼吸系统疾病，鉴定标准如下是否有咳嗽、打喷嚏、食欲不振和被毛粗糙、体温升高、呼吸困难，只要有大于四项以上上述症状出现就判定为发生呼吸系统疾病。结果见表1和表2。表l不同基因型大白猪呼吸系统疾病发病情况统计表<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>表2不同基因型大白猪呼吸系统发病率显著检验表<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>结果表明在493头大白猪中，GG基因型个体有144个，GA基因型个体有237个，AA基因型个体有112个；基因型不同时，经x2检验群体呼吸系统疾病发病率存在极显著差异(P<0.01)，其中GG基因型群体的呼吸系统疾病发病率比AA、GA基因型群体分别低9.53%和27.88%，差异达极显著水平(P〈0.01)。所以，在实际的猪育种中，最好选择GG基因型的猪进行育种。实施例2、通过试剂盒检测不同品种猪的基因型分布情况对大白猪、长白猪、莱芜猪三个猪种进行等位基因分析与基因型分型(A147T)，结果如表3所示。_表3A147T多态在不同猪种中的分布情况_^"""基因型频率等位基因频率—GGGAAAGA结果表明在所检测的猪种中，大白猪、长白猪中A等位基因为优势等位基因，而中国地方猪种莱芜猪中呼吸系统疾病抗性相关基因(G等位基因)为优势等位基因。29966200113374o3351783533924o15g-29猪猪猪白白芜大长莱序列表<110〉中国农业科学院北京畜牧兽医研究所<120>—种猪呼吸系统疾病抗病育种方法及其专用试剂盒〈130〉CGGNARY81888<160〉4<210>1<211〉22<212>DNA<213〉人工序列<220〉〈223><400〉1tgaatgagtagaatgatgagaa22〈210〉2<211>21〈212〉DNA<213〉人工序列<220〉〈223〉〈400〉2gggcagcgatgcgtccacctg21<210〉3〈211〉296〈212〉DNA<213〉猪属猪(5"〃sscro/s)<400>3tgaatgagtagaatgatgaggaagacagagag卿ggca^gg33ggaaagggscttgg卿tttccaggagttcatgctggcgcttttgatgtcattagag〈210〉4<211>296〈212>DNA<213〉(5"〃sscro/"a)〈400〉4tgaatgagtagaatgatgagg肪gac3g3g3gagaiggc3ggaagg犯3gggscttgg柳tttccaggagttcatgctggcacttttgatgtcattagaga^C6lt6lgt3gggaattaagactagggttggaaaagggagg60agatgaaaaggttgg卿gaacagaaagacagcataaaag120caacattgcctgatctgatttctctgccctcagtcctcag180csgtgggagagaaggtcttctccaccaatgggcagtcagt240agttgtgtgcC柳gC3ggtggacgcatcgctgccc296aacatagtagggaattaagactagggttggaa犯gggagg603geitgaaasggttggetgag3acagaaagacagcataaaag120caacattgcctgatctgatttctctgccctcagtcctcag180C3gtggg卿gaaggtcttctccaccaatgggcagtcagt240agttgtgtgccagagcaggtggacgcatcgctgccc29权利要求1、一种培育猪的方法，是检测待测猪的GenBankAccessionNumberDQ985806的自5′末端第2848位脱氧核糖核苷酸是G还是A，确定待测猪的基因型是GG、GA还是AA，采用GG基因型的猪进行育种；所述GG基因型为GenBankAccessionNumberDQ985806的自5′末端第2848位脱氧核糖核苷酸为G的纯合体；所述AA基因型为GenBankAccessionNumberDQ985806的自5′末端第2848位脱氧核糖核苷酸为A的纯合体；所述GA基因型为它们的杂合体。2、根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述确定待测猪的GenBankAccessionNumberDQ985806的自5'末端第2848位脱氧核糖核苷酸是G还是A的方法为单链构象多态性分析，所述单链构象多态性分析包括PCR和对所得到的PCR产物进行电泳的步骤。3、根据权利要求2所述的方法，其特征在于所述PCR的引物对满足如下条件以猪的基因组DNA为模板进行PCR扩增的产物含有GenBankAccessionNumberDQ985806的自5'末端第2848位脱氧核糖核苷酸。4、根据权利要求3所述的方法，其特征在于所述PCR的引物对为序列表中序列1所示序列的核苷酸和序列表中序列2所示序列的核苷酸。5、根据权利要求4所述的方法，其特征在于所述电泳为聚丙烯酰胺凝胶电泳。6、根据权利要求5所述的方法，其特征在于所述电泳结果中，GA基因型的待测猪的PCR产物显示4条电泳条带;GG基因型的待测猪的PCR产物显示两条电泳条带，且该两条电泳条带与所述GA基因型按电泳方向的第一条电泳带和第三条电泳带的电泳迁移率相同；AA基因型的待测猪的PCR产物显示两条电泳条带，且该两条电泳条带与所述GA基因型按电泳方向的第二条电泳带和第四条电泳带的电泳迁移率相同。7、辅助检测猪呼吸系统疾病抗病性的试剂盒，含有满足如下条件的引物对以猪的基因组DNA为模板进行PCR扩增的产物含有GenBankAccessionNumberDQ985806的自5'末端第2848位脱氧核糖核苷酸。8、根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于所述引物对为序列表中序列1所示序列的核苷酸和序列表中序列2所示序列的核苷酸。9、根据权利要求7或8所述的试剂盒，其特征在于所述试剂盒还包括进行PCR的试剂和进行电泳的试剂。10、权利要求7至9中任一所述试剂盒在猪的育种中的应用。全文摘要本发明公开了一种猪呼吸系统疾病抗病育种方法及其专用试剂盒。本发明提供的方法是检测待测猪的GenBankAccessionNumberDQ985806的自5′末端第2848位脱氧核糖核苷酸是G还是A，确定待测猪的基因型是GG、GA还是AA，采用GG基因型的猪进行育种。所述确定待测猪的基因型的方法为单链构象多态性分析。应用本发明的方法可大大降低分子育种花费，有效降低实际生产中的猪呼吸系统疾病发病率问题，降低饲养成本，提高经济效益。本发明的方法操作简单、费用低廉、检测时间短、准确度高、可实现自动化检测，将在猪育种中发挥巨大作用。文档编号A01K67/00GK101392297SQ20081022631公开日2009年3月25日申请日期2008年11月12日优先权日2008年11月12日发明者乔莉娟,张龙超,王立贤,程笃学,华颜申请人:中国农业科学院北京畜牧兽医研究所