专利名称：：抗草甘膦植物的育种方法及组合物的制作方法抗草甘膦植物的育种方法及组合物相关申请的交叉引用本申请要求2006年1月23日提交的编号为60/761,216的美国临时申请作为优先^J^。本申请要求2006年1月23日提交的编号为60/761,710的美国临时申请作为优先;K^。上述申请的公开内以引用的方式纳入本文。
背景技术：
：草甘膦——N-(膦酰曱基)甘氨酸~~A在M界最广泛使用的除草剂。它被以RoundUp和Touchdown等商品名销售。草甘膦是一种叶用的非选择性的除草剂，在土壤中无活性。草甘膦可以在种植前用于控制免耕种植系统中滋生的杂草，或者通过在发芽后定点施用和直接施用以控制多种杂草，以及控制在抗草甘膦的作物例如大豆、玉米、芸苔和棉花中的杂草。抗草甘膦的作物一船^^吏用遗传工程i殳计的。天然存在的抗草甘膦的植物4艮稀少，并且这些少见的植物一般是杂草的变种。需要更多抗草甘膦的作物和观赏植物，特别是抗草甘膦的草坪草和饲料草。
发明内容本发明提供了关于具有草甘膦抗性的植物技术的多个实施方案。例如，多个实施方案涉及有经济价值的草和其他植物，所述草和植物包含具有特定M酸序列的遗传物质，包含特定的酶，通过使用特定的非转基因方法培育，包含特定保藏种质的特征，或者通过4吏用转基因方法产生。例如，本发明提供了一种包含抗草甘膦的EPSPS酶的多肽分子的植物，所述多肽M包含SEQIDNO.2的M酸序列或其功能部分。在某些实施方案中，EPSPS酶不^1该植物中天然存在的。SEQIDN0.2或其功能部分可以由包含SEQIDNO.l或其功能部分的核酸序列所编码。在某些实施方案中，所述多肽分子与SEQIDN0.2有超过约80。/。的同一性。在某些实施方案中，所述核酸序列与SEQIDNO.1有超过约93%的同一性。本发明还提供了一种抗草甘膦的经济草，所述草包含一种编码EPSPS酶的核酸分子。在某些实施方案中，所述核酸M包含SEQIDNO.1的序列或其功能部分。在多个实施方案中，所述核酸分子与SEQIDNO.1有超过约97%的同一性。在某些实施方案中，所述EPSPS酶可以是一种多肽分子，所述多肽W包含SEQIDN0.2或其部分的J^的M酸序列。本发明还提供了一种抗草甘膦的植物，所述植物包含非转基因的抗草甘膦的硬直黑麦草Uo/2'咖/^/cM)种质。在某些实施方案中，本发明提供了以编号xxxx保藏于ATCC的Penner黑麦草(Pennerryegrass)的种质。在某些实施方案中，所述种质包含SEQIDN0.1或其功能部分的核酸分子。所述种质可以包含抗草甘膦的植物EPSPS酶的多肽分子。在某些实施方案中，所述种质包含一种多肽分子，所述多肽分子包含SEQIDNO.2或其功能部分的M酸序列。在某些实施方案中，所述种质包含两个不同的抗草甘膦基因。在某些实施方案中，所述种质包含至少一种抗草甘膦的蛋白。所述种质可以被用于育种程序中或与性亲和的植物杂交。在多个实施方案中，本发明提供了用于以下场所的草和其他植物高尔夫球场、高尔夫絲长草、高尔夫JW发球台、草场、田径场、公园、路旁、公用设施或铁路通过区、小径、种子或草皮。在多个实施方案中，这些植物是经济植物，包括抗草甘膦的草冲草。例如所述草坪草可以选自于黑麦草、羊茅草、其组合及其杂交种。在某些实施方案中，本发明提供了抗草甘膦的饲料草。在某些实施方案中，本发明^供了抗草甘膦的黑麦和小麦等谷类作物。本发明还提供了抗草甘膦植物的种子，以及包含这类种子的混合物。本发明还提供了所述植物的子代、生长枝、分蘖、组织培养物、细胞原生质体、克隆和/或种质。本发明还提供了产生草场的方法，所述草场中基本没有其敏感的杂草变种。所述方法包括:提供一种包含非转基因的抗草甘膦多年生草碎草的草场，以及对所述草场施以有除草剂效果剂量的草甘膦化合物。本领域技术人员应理解的是，本文描述的附图仅仅出于说明的目的。所述附图并非意在以任何方式限制本发明的范围。图1显示了抗性的、敏感的和中间状态的加利福尼亚硬直黑麦草的植物损伤的剂量效应曲线；图2显示硬直黑麦草EPSPS基因的5，/3，随才;ur增cDNA末端聚合Sl^式反应(RACEPCR)的方案；图3显示了存在草甘膦时抗草甘膦生物型(R)和草甘膦敏感生物型(S)的加利福尼亚硬直黑麦草的EPSPS活性；图4显示了多年生黑麦草和抗草甘膦的硬直黑麦草杂交的F2种群植物中草甘膦抗性类的分布；图5显示了抗草甘膦的F2杂交植物与敏感的多年生黑麦草回交产生的371^^L物的单F2bd种群中草甘膦抗性类的分布；图6显示了在草甘膦处理3和4WAT来自F2bd杂交种的抗性(R)克隆的草甘膦敏感性；和图7显示了用抗草甘膦的EPSPS克隆转化的根癌农杆菌(々ro6a"er/腿/咖e尸ac/e/w)(口)和野生型根癌树菌(^)絲在草甘膦的情况下生长48小时后的表达结果。具体实施例方式以下的技术说明仅仅是一个或多个发明的主旨、制备和用途的本质性示例，并不是意在限制本申请或那些要求本申请优先权的其他申请或者这些申请的授权专利中要求的任何具体发明的范围、应用或用途。在阅读本文的技术说明时必须考虑以下的定义和非限制性指导方针。具体地，虽然在讨论一些实施方案时，本发明将涉及草的草甘膦抗性以及源自植物的5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶("EPSPS")，但是不应该将这些详细描述看作限制为本发明仅仅有这些应用。本文^J1的标题(例如"
背景技术：
"和"
发明内容")和小标题仅仅意在一般性地组织本发明中的论题，并不是意在限制所述技M其伶阿方面的公开。具体地，"
背景技术：
"中公开的JJI可能包括新技术，并且可以不构成对现有技术的引用。"
发明内容"中公开的i^不是详尽M完全iik/厶开所述技术的整个范围或其任一个实施方案。将本说明书的节中的材料分类或详细描述为具有特定的功用仅是为了便利，并且不能得出以下的推论所述材料用于任何给9定组^中的时候都必须具有或者唯一地具有这种与本文的分类一致的功食&。本文引用的参考文献并不构成承认这些参考文^l现有技^Ml者与本文公开的技术的专科I"生有伶f可关联。为了所有的目的，本说明书"M实施方式"中引用的所有参考文献的全文通过引用的方式纳4文。在一篇或多篇纳入的参考文献、文献和类似材料与本申请不同或相反时(包括但不限于定义的术语、术语用法、描述的技术等等)均以本申请的内容为准。所述描#具体实例虽然显示了所述技术的实施方案，但是仅仅是为了说明的目的，而不是意在限制所述技术的范围。而且，对具有所述特征的多个实施方案进行详述不是意在排1^￡具有其他特征的其他实施方案，或者^所述特征的不同组合的其他实施方案。提供M实例是为了解#^何制备该技术的组^以及如何使用该技术的方法，除非另外明确地说明，所述M实例均不是意在表征该技术的给定实施方案是否已经被制备或经过测试。^^Mt^供了草甘膦抗性的植物。本文佳J的术语"草甘膦"是指N-膦酰曱基甘氨酸及其盐。草甘膦是RoundUpS除草剂(MonsantoCo.)的活性成分。本文使用的术语"抗性的"是指降低草甘膦对植物生长和发育的毒性作用。在敏感'^tt物种中，草甘膦抑制芳香族M酸色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸的生物合成。在莽草酸途径中，草甘膦与底物磷酸烯醇丙酮酸(PEP)竟争与5-烯醇丙酮^酸-3-磷酸合成酶(EPSPS;E.C.2.5.1.19)的结合位点。草甘膦是已知唯一能抑制EPSPS的除草剂。高等植物中草甘膦的代谢很有限并且目前尚不清楚。如果草甘膦以植物毒性的用量被施用，那么它可能不容易被代谢。现已经报道了草甘膦代谢成氨曱基磷酸(aminomethylphosonicacid)("AMPA")的过程是^^慢的。在使用草甘膦超过30年后，几个国家才艮道了某些抗草甘膦的杂草物种。已经报道的草甘膦抗性物种有澳大利亚和美国加利福尼亚的硬直黑麦草r/g2V咖Gaud.)j马来西亚的牛筋草Cfi7e^/"e//7力.ca)^美国德拉华的加拿大蓬(Co/y^3ca加^/e/w/;);智利的意大利黑麦草(多花黑麦草(Zo/i咖M/7〃/7oiYza^);南非的香丝草(hairyfleabane)(Co/y幼toar/朋".5)和长叶车前(buckhornplantain)(尸/朋^3卵/朋ceo/"a)。已经在马来西亚的牛筋草、澳大利亚的硬直黑麦草和美国的加拿大蓬中研究了草甘膦抗性的遗传。这些研究的结论是草甘膦抗性的遗传受半显性的单基因的核内控制。然而，也有报道称来自澳大利亚的另一种群的硬直黑麦草的草甘膦抗性受多个基因的控制。本发明提供了用于产生具有草甘膦抗性的植物的多种方法。实施方案包括非转基因方法、转基因方法以及4吏用如本文进一步描述的特定保藏材料的方法。本发明提供了抗草甘膦的植物，包括含有抗草甘膦的ESPS酶或编码ESPS酶的遗传物质的植物，所述ESPS酶或所述遗传物质在这些植物中不K然存在的。本文使用的术语"植物"涵盖任何高等植物>^其子代，包括草、玉米、稻、小麦、大麦等单子叶植物；大豆、棉花、番痴、马铃薯、拟南芥、烟草等双子叶植物；松、枞、柏等棵子植物；草莓、越橘、糊匕、苹果、梨、桃、橙和其^^计橘、葡萄等水果；以及这些植物的种质和其他部分，包括植物的生殖单元——^']如种子、鳞茎、块茎、花粉、孢子、球茎、根茎、插条、小枝、分蘖、接枝、芽、球果、种荚、克隆、胚、组织培养、胚乳、胚珠、角质层、分生组织、花和可再生所述植物的其他部分或组织。在多个实施方案中，所述植物是"观赏植物"或者是种植的最终目的是取其美观而非为M物的价值或作为饲料的栽培种，例如用于花园、公园中或者作为风景设计中的特征。例如，为了切花或仅仅为享受，房主可以种植观赏植物美化家园或花园。观赏植物包括室内植物和用于室外园艺或景观美化的植物——例如灌木、花卉、常,物、观赏树木和草。在某些实施方案中，这些植物包括谷类、豆类、祠料作物、油料作物、纤维作物、蔬菜作物、草、草坪草、甘蔗、甜菜、烟草、林木、果树、水果灌木、一年生观赏植物和多年生观赏植物等等。在某些实施方案中，；WU^供了经济草。本文4吏用的术语"经济草"是指这样的禾4^牛植物，在所述植物的种子、草皮、M物和饲料中至少一项在市场上具有经济价值(一般用货币单位衡量)。经济草的实例包括但不限于草碎草、饲料草、小麦、黑麦(谷类)、稻、玉米、竹子和观赏草。在某些实施方案中，本发明提供了抗草甘膦的谷类作物——^'J如黑麦、小黑麦和小麦。本发明还提供了抗草甘膦的饲料草。在某些实施方案中，所述植物是抗草甘膦的草坪草。"草畔草"是^m则修剪后可形成密集生长的叶片和4艮的草。草坪草是一种主要的农作物，它每年覆盖5千万英亩土地并且是唯一一种随城市化而增加的作物。草冲草的实例包括但不限于黑麦草、苜股颖、zyosua、羊茅草、早熟禾(bluegrass)、festolium和狗牙根。在多个实施方案中，所述草坪草是黑麦草、早熟禾、羊茅草、festolium、其组合、其杂交种以及头肝生物。可以通过本发明的方法产生抗草甘膦的草坪草，然后培育至其他草冲草使之具有所需经济性状。草坪草可以出现于(但不局限于)例如高尔夫、田径场上、公园中、草场中、学^^地面上、路旁、通过区、输电线下、小径上，并且可以作为种子或草皮出售。在多个实施方案中，本发明提供了用于高尔夫球场、高尔夫长草、高尔夫JW发球台、草场、田径场、公园、路旁、公用设M铁路通过区、小径、种子或草皮的草或^flMt物。在多个实施方案中，本技术提供了一块包含一群草的"草场"，所述草具有所需特征(主要是观赏性)，所述草场可以通过种子、草皮或其他方法栽植，或者被维持用于商业的、居住的或其他的目的。在某些实施方案中，所述草场可以是高尔夫球场^ui、高尔夫长草、高尔夫果呤、田径场、公园、住宅庭院或商业景观。应理解，并非所有的所述植物都可以^^i本文描述的所有方法获得。然而，选择一种或多种这些方法用于制备给定的本发明的植物是本领域普通技术人员可以做到的。而且，虽然在本发明方法的描述中可能具体地描述了给定植物的制备，然而应理解这些植物可以通过其他方法制备，并JLititil些方法也可以制备^ftMt物。非转基因的抗草甘膦植物及其制备方法在多个实施方案中，本技供了非转基因的抗草甘膦植物。如本文中所述，所述术语"非转基因的"是指使用育种或不包括遗传转化的类似技术从其他植物衍生植物以获得抗草甘膦性状，即所述植物不包含转基因。这些植物通常不作为基因工程生物("GM0")。然而，应理解，这些植物可以具有与转基因植物基^目同的特征，或者可以非转基因地衍生自并非以草甘膦抗性为目的的转基因产生的植物。在某些实施方案中，这些植物可以是杂交种。本文使用的术语"杂交种"是指种间受精形成的种子或植物，与来自同一物种的雌配子与雄配子受精产生的种子相对。本文使用的术语"转化"是指一种方法，所述方法是将外源的核酸序列(例如载体、重组核酸分子等)导入细胞或原生质体，从而外源核酸被整合进入染色体或质体基因组或者能够自我复制。本文使用的术语"转化的"或"转基因的"是指细胞、组织、器官或生物体中已经,皮导入夕卜源核酸一一例如重组载体。可以通过多种本领域已知的方法完成转化，所述方法包括磷酸钓-DNA共沉淀、DEAE葡聚糖介导的转染、凝^^介导的转染、玻璃珠、电穿孔、显微注射、脂质体融合、脂质转染、原生质体融合、病毒感染、基因枪(例如粒子轰击)、农杆菌感染等等。"转基因的"或"转化的"细M生物体还包括所述细M生物体的子代，以及^J1这种"转基因的，，植物作为杂交亲本的育种程序产生的有以下特征子代由于所必卜源核酸存在而导致出现表型的改变。本文使用的术语"转基因"是指通过转化导入细胞或生物体的任何核酸序列。所述术语转基因还涵盖经过定向重组插入核#列#^的天然植物基因的组成部分。在多个实施方案中，这些植物培育自或衍生自黑麦草属的草(包括硬直黑麦草)。黑麦草属在4^界包括5个种。它们可以分成异花受粉(自交不亲和)组和自花受粉(自交亲和)组，异花受粉组包括多年生黑麦草aw/腿;ere;2/7eL.)(多年生黑麦草)、多花黑麦草0^//咖M/Z〃/7or咖Lam.)(—年生黑麦草)、硬直黑麦草(硬直黑麦草(rigidryegrass)),而自花受粉组包括毒麦(ZoZ/腿^zffl7e/e/7f咖L.)和细穗毒麦(Zo/Z腿reaw^/fflSchrank)。异花受粉植物是自交不亲和的，并且在同属的物种之内或之间进行天然的异型杂交。黑麦草是二倍体，具有14条染色体(2n-14),而饲料黑麦草可以是四倍体，具有28条染色体(411=28)。在某些实施方案中，所述非转基因的抗草甘膦的草可以是黑麦草杂交种，并且在某些实施方案中，非转基因的抗草甘膦的草可以是杂交种一一其中一个亲本是抗草甘膦的硬直黑麦草。石更直黑麦草^i人为起源于欧洲。在美国首次用于发布硬直黑麦草栽培种的育种方法是自然选#去劣。这些方法识别并去除异常植物，并且具有所需特征的植物被作为亲本产生后面的循环。将具有特定表型特征的植物个体从种群中选择出来并用作后续代的亲本。在某些实施方案中，非转基因的抗草甘膦的草(如草坪草)包含编码抗草甘膦的EPSPS酶的核酸分子。本文使用的术语"编码"是指细胞或者在体外具有转录和翻译功能的完全组件通过染色体DNA、质粒DNA、cDNA或合成DNA产生本文详述的任何蛋白。某些实施方案包括一种含有编码以下蛋白的核酸分子的植物SEQIDNO.2的抗草甘膦的EPSPS酶、与SEQID.NO.2有80%同一性的抗草甘膦的EPSPS蛋白以及它们的功能片段。本文使用的术语"蛋白"、"多肽"、"肽"、"编码产物"、"M酸序列"可以互换使用，指的是包含以肽键连接的氨基酸的化合物。由一个基因编码的"蛋白"不限于由所述基因编码的J^^列，而且包括所述蛋白的翻译后修饰。本文使用的术语"#^*列"是指蛋白分子的^J^^列，所述术语"M,列"及类似术语一一例如"多肽"或"蛋白"不是意味着将所述M酸序列限制为所述蛋白分子相关的完整的、天然的M酸序列。此外，"tJ^酸序列"可以从编码所述蛋白的核酸序列推导。从编码的核酸序列推导的M酸序列包括由所述推导的#^酸序列衍生的序列以及经过翻译后处理修饰的序列，其中所述修饰包括但不限于:糖基化、羟基化、磷酸化以及M酸删除、置换和插入。因此，包含推导的JL^酸序列的M酸序列应理解为包括所述编码的和推导的M酸序列的翻译后修饰。在某些实施方案中，才艮据本发明的抗草甘膦的EPSPS可以包括叶绿体转运肽(CTP)。CTP协助EPSPS从其J!^合成位点捧逸至叶绿体中。在叶绿体中CTP被从EPSPS上切下以产生功能性的EPSPS酵。在某些实施方案中，编码抗草甘膦的EPSPS酶的核酸分子可以包括基本上与SEQIDN0.1或其片段类似的序列。在某些实施方案中，所述核酸分子与SEQIDNO.1有超过约93%的同一性，并且在101残基位置编码有一个丝氨酸。在某些实施方案中，所述核酸分子与SEQIDNO.1有超过97%的同一性。本文使用的术语"同一性"是指两条核酸或蛋白序列之间相似性的程度。通过合适的计算^4呈序进行两条序列的J^叶。将匹酉14^J^^J^酸数目除以4^il氨基酸的总数目并乘以IOO得到百分数的同一性。例如，如果两条580个4^对的序列有145匹酉U^基，那么它们有25%的同一性。如果被比较的两条序列的长度不同，那么用匹配的数目除以两个长度中,的那个。例如，如果200个和约400个M酸蛋白之间有100个匹配JL^酸，那么通it^"虑^^M的序列它们有50%的同一性。如果g的序列长度少于150g或50#^酸，那么的同一性。在某些实施方案二中，^;膦的经^^含有抗草甘膦的:PSPS酶，并且所述酶可以与SEQIDN0.2或其片^i^类似。本文使用的术语"等效^J^位置"是EPSPS酶中与不同的EPSPS酶中g位置功能等效的位置。等效g位置的实例包括以下SEQIDNO.2的残J^位置53与SEQIDNO.2的^t^位置101是等效的。本文4M的术语"絲紅换"和"絲酸变体"是指在蛋白的M位置单4^m^被优选置换为另一MM^。置换、删除、插^^或它们的4壬意纽^^可以^^且^f吏用以l^得最终的构^t体。在某些实施方案中，所述非转基因的抗草甘膦的草含有SEQIDNO.1的功能部分。在某些实施方案中，所述非转基因的抗草甘膦的草含有抗草甘膦的EPSPS酶，所述SI^有SEQIDNO.2的功能部分。在某些实施方案中，所述非转基因的抗草甘膦的草含有编码SEQ.ID.NO.2或其功能部分的基因的一#分。本文^J^J的术语"基因"是编码肽、多肽、蛋白、前体或RNA分子的核酸序列一—例如染色体DNA、质粒DNA、cDNA、合成DNA或其他DNA,以及参与表达调控的编码序列侧区域。术语"基因"涵盖编码蛋白的结构基因区并且包括编码区5，和3，两端约1kb长的邻接的区域，因此，基因对应于全长mRNA。功能性多肽可以由全长的编码序列编码，或者由所述编码序列的^f可部分编码一一只要所述多肽的所需的活性或功能性质被保留即可。本文^J^I的术语"部分"当用于基因时是指该基因的片段。所述片段的长度范围可以从数个核苷M基因序列全长减去一个核苦酸。本文^^I的术语"EPSPS基因的片段"或"EPSPS基因的部分"是指全长EPSPS基因核酸的部分，至少是能够表达具有EPSPS活性的蛋白的最小长度。本文^JI的术语"酶"是指负责催^f匕学^Jl和生物^I的^^或^^聚集体。催化化学反应和生物反应的W被称为"具有酶活性"或者"具有催化活性"。在某些实施方案中，所述非转基因的抗草甘膦的草含有抗草甘膦的植物EPSPS酶的多肽分子。在某些实施方案中，所述多肽分子含有与SEQIDN0.2或其任f可的功能部分J^类似的M酸序列。在某些实施方案中，非转基因的抗草甘膦的草含有抗草甘膦的EPSPS酶，所述EPSPS酶是SEQIDNO.2及与其有超过80。/。同一性的序列中的任一条。在某些实施方案中，抗草甘膦的EPSPS酶可以与SEQIDNO.2或其功能部分的至少一条J4^类似。在某些实施方案中，非转基因的抗草甘膦的草含有一种多肽分子，所述多肽分子基本上包含提供抗草甘膦的酶的SEQIDNO.2。在某些实施方案中，非转基因的抗草甘膦的草碎草含有与SEQIDNO.1(可^ft地编码SEQIDNO.2)^S4^上类似的基因。在某些实施方案中，本发明提供了一种分离的核酸分子，所述分子包含编码抗草甘膦的、源自植物的EPSPS酶的SEQIDNO.1。在某些实施方案中，SEQIDN0.1^1从黑麦草物种分离的。在某些实施方案中，SEQIDNO.1是从硬直黑麦草分离的。在某些实施方案中，分离的核酸分子包含与SEQIDNO.1有超过约93%同一性并站^^位置101编码有丝氨酸的核絲列。在某些实施方案中，分离的核酸分子包含与SEQIDN0.1有超过约97%同一性的核^列。在某些实施方案中，SEQIDNO.l从ATCC保藏的Penner黑麦草(保藏号xxxx)的种质分离。本文使用的术语植物"种质"或"遗传材料"是指植物的生殖繁殖或营养繁殖的材料，并且包括来自植物的4沐原遗传材料(所iiii传材料对于育种者开发杂交种和/或改良栽培种是需要的)。植物种质或遗传材料可以是能长成新植物的活组织，例如种子或者叶、根、茎段、花粉、、雄蕊、雌蔬、孢子、球茎、根茎、插条、接枝、芽、球果、种荚、外皮、冠、分生组织或细胞等其他的植物部分，所述植物部分可以被培养成全植林并且可以含有植物遗传组成的所有遗传信息。本文^JI的术语"分离的"当用于"分离的"核酸时是指通过常规的核酸纯化方法将核酸与其出现的生物体的细胞中其自酸序列(例如其他染色体和染色体外DNA和RNA)^上分离或纯化。该术语也涵盖重组核酸和化学合成的核酸。在某些实施方案中，本发明提供了一条分离的多肽分子，所述多肽分子包含提供抗草甘膦的EPSPS酶的SEQIDNO.2。在某些实施方案中，SEQIDNO.2是由SEQIDNO.1编码的。在某些实施方案中，SEQIDNO.2是^^f更直黑麦草中分离。在某些实施方案中，SEQIDN0.2是从ATCC保藏的Penner黑麦草(保藏号xxxx)的种质分离的。在某些实施方案中，分离的DNA分子编码SEQIDNO.2的抗草甘膦的EPSPS酶，并且所述分离的DNA分子可以是SEQIDNO.1的核^列。常规的育种方法包括从最强和最符合需要的植物选种和播种，以产生下一代作物。除非另外声明，本文使用的术语"选择"是指确定栽培种对草甘膦的相对抗性的方法。本文使用的术语"栽培种"是指具有某种共同表型的一组植物，并iUj"所述^t物来i兌，这些表型在植物间显示很小的差异至无差异。本文使用的术语"栽培的"是指在农业条件下特意种植的植物，与无意中生M农业条件下的"杂草"相对。的性状，并且可能包括与市售;亲本回交以去除不需i基因的很长的过:。本文使用的术语"性状"是指植物的可观测的和/或可测量的特征。本文使用的术语"野生型"是指在大的个M群中共有的基因型或表型。功能性野生型基因是在种群中最常出现的基因，并且因itb^A为地指定为所述基因的"正常"或"野生型"形式。相反，术语"修饰的"或"突变的"当^U1于基因或基因产物的时候分别是指，与野生型基因或基因产物相比，序列和/或功能'l^t(例如改变的特征)出现变化的基因或基因产物。本文使用的术语"天然的"是指天然存在的("野生型的，，)核酸或多肽。本文使用的术语"等位基因"是指以下条件下的M的基因变体所述基因在种群中以不止一种形式出现。本文使用的术语"隐性的"、"隐性基因"和"隐性表型"是指，当两个等位基因同时位于某一基因座作为"杂合子"的时候，缺4L4型或产生弱表型的等位基因。本文使用的术语"显性的"、"显性基因"和"显性表型"是指，存在第二等位基因的时4tJ陚予主^"^型的等^:基因。在某些实施方案中，育种方法包括突变研究、复合杂交和进化育种、雄性不育促使的轮回选择以及来自平衡三级三体(tertiarytrisomies)的市售杂交种和来自细胞质雄性不育的市售杂交种。在多个实施方案中，通过育种有可能合并在两个或多个植物个体中出现的性状，并且有可能将这些性状传递给这些植物的子代。杂交种育种是一种先进的育种方式。从两个不同的变种或近交系的杂交产生杂交种植物。例如，从两个低产的自交系开始，它们的杂交产生高产的子代。杂交种在活力、产量、均一性以及其他特征方面经常优于非杂交变种，并且这是它们的农业价值的主要方面。在产生杂交种种子的过程中，通常将两个变种相邻种植以有效地受粉；一个变种作为雌性(卵)亲本并且另一个作为雄性(花粉)亲本。天然受粉通过风、昆虫或其他动物发生。在过去，大M^M两个变种进行杂^A;f艮困难的工作，这是因为许多作物物种的植物生有雄性和雌性两种生殖结构并且是自交亲和的，即它们能够自花受粉也能异花受粉。因此，为了防止自花受粉并获得纯的杂交种子，可能需要将所述种子的亲本去势。硬直黑麦草与多年生黑麦草的杂交不AJl接进行的，并iMt自然中通常不会发生，这是因为多年生黑麦草需^4化作用并且多年生黑麦草和硬直黑麦草的花期不同。因此，必须控制多年生黑麦草的春化和种植以将多年生黑麦草和硬直黑麦草的花期同步化。本文使用的术语"F-代"和"子代(filialgeneration)"是指在双亲杂^^f封可连续代的细胞、组织或生物体。所述双亲杂交(例如亲本)交g&产生的代的种子及其植物是第一子代(表示为"Fr)，而一个R个体与另一个h个体杂交产生的代的种子及其植物是第二子代(表示为"F2")。例如，F2种子及生成的植物由Fi自花传粉产生，而后面的F代由其前一代自花传粉产生。本文使用的术语"组织培养"是，以一种使其结构和/或功能分化^^持的方式在体外维持组织或培养组织。在一个组织培养的实例中，分生组织可以是在芽顶端或根顶端以^Ljt腋芽中主动切下的部分(大小约0.2咖至约1.0cm)。在另一个实例中，它们可以在显微镜下被分成段并且可以在特定的培养基中再生成完全的植物。在组织培养方法的第三个实例中，也可以在体外栽培芽尖和茎插枝(大小约0.2mm至约1.0cm)以产生完整的小;fct林。本文使用的术语"再生"是指^物细胞、组织或器官(例如植物原生质体或外植体)长成植物的过程。在本发明的某些实施方案中，方法包括再生非转基因的抗草甘膦植物或其部分。在某些实施方案中，再生可以使用本领域技术人员已知的组织培#^术。在胚发生中，卵细胞被花粉受粉后形成含有两个亲本遗传构成的新胚。然而，在种间杂交或属间杂交(i^杂幻中，所述杂幻降出现，但是由于不能形成正常的胚乳而死亡。通过以下方式可以拯i^斤i^:在早期从颖果中切下并且lt^体外栽培于人工培养基中。M，可以从该胚再生完整的小植林。另夕卜，的胼胝体组织。通it^培养可以产生纯合的植物。在双倍体系统中，如果卵细胞被其他物种的花粉受粉(例如小麦x玉米)，*出现刺:应，所i^'J^:应引起新发育的胚仅包含来自雌性配子的染色体(染色條目为正常胚的一半)。从该胚再生的植物是不育的，但经过^UM山素处理可使该纯合植物的能育性'ltt。本文使用的术语"内源的"是指源于生物体或细胞内部的物质。本文佳月的术语"外源的"是指源于生物体或细胞夕卜部的物质。这"^:适用于有以下用途的核酸分子用于产生转化的或转基因的宿主细J^植物。除了正常有性杂交的可行性之外，原生质体融合可以作为一种独特的工具用以组合有价值的性状。本文使用的术语原生质体是指已除去细胞壁的细胞。本文使用的术语原生质球是指大部分细胞壁被去除的细胞。可以佳月细胞壁降解酶从叶或其，浙组织分离原生质体。通过电脉沖触发，两个选择的育种系的原生质体可以在电场中融合。这种融合被称为体细胞杂交，其涵盖来自两个融合配偶体的所有染色体的组合。因此，所i^始材料将具有两倍的染色体数目，所#始材料可以通过特定杂交或者通过另一培养获得。在另一个实例中，非常规的杂交方法包括遗传自交不亲和植物的克隆繁殖，这种方法净皮记载于美国专利4，499，687(1985)中用于产生杂交种的芸苔种子。在某些实施方案中，抗草甘膦的多年生黑麦草的育种方法包含以下步骤提*有抗草甘膦的硬直黑麦草的种质，将所述种质与包括黑麦草的第二种质杂交以产生F1;从抗草甘膦的Fi代的至少一个成员选择所得的种质，将从Fi代选择的种质回交包括黑麦草的第二种质以产生bd代，从抗草甘膦的bd代选择所得的种质，将从bd代选择的种质回交包括黑麦草的所迷第二种质以产生bc2代，从抗草甘膦的bCs代选择所得的种质并提供抗草甘膦的黑麦草。在某些实施方案中，回交(bc)可以最高至7代。在某些实施方案中，回交可以与前交相混合。在某些实施方案中，育种的方法包含提供指示草甘膦抗性的生物标记。在某些实施方案中，包括抗草甘膦的硬直黑麦草的所述种质可以包含基本上是SEQIDNO.l或其功能部分的核酸。在某些实施方案中，抗草甘膦的草畔草可以通过胚培养获得。在某些实施方案中，抗草甘膦的草可以通过使用原生质体融合获得。在某些实施方案中，选择步骤可以包括对生成代的成员喷施有除草剂效果剂量的草甘膦，并且这个步骤可以包括等待一段时间一一例如2、3、4周或更长时间以确定所述生成代中的存活者。在某些实施方案中，育种方法可以包括将以下步骤至少重复一次提供、杂交、选择和回交。某些实施方案包括通过所述育种方法制备的种子。在某些实施方案中，所述育种方法还可以包M择所需的农艺性状。在某些实施方案中，所需的农艺性状可以包括抗旱性、耐盐性、抗病性、抗真菌性、抗细菌性、叶片高度、叶片宽度、叶片颜色、活力、种子产量、抗昆虫性和耐冬性。在某些实施方案中，育种方法可以包括包含抗草甘膦的硬直黑麦草的种质的用途，所述种质包含以下的分子是SEQIDN0.2的主^"部分或其功能部分并且编码抗草甘膦的EPSPS酶。在某些实施方案中，抗草甘膦的植物的育种方法包含以下步骤提*有基本上是以下核酸序列之一的材料SEQIDN0.1或其功能部分以及与其有超过97%的同一性的序列；将所述材料与与之亲和的种质杂交并产生抗草甘膦的种质。在某些实施方案中，所述材料可以选自于种质、外皮、种子、花粉、胚珠、根、花、组织、分生组织、胚乳、种子、细胞或其他植物部分。在某些实施方案中，所述材料可以选自于黑麦草、羊茅草、festolium、其组合以及其杂交种。在某些实施方案中，抗草甘膦的种质是包含来自抗草甘膦的硬直黑麦草的种质的杂交种。在某些实施方案中，产生抗草甘膦的植物的方法包含以下步骤将第一草植物与至少一种其他草植物杂交以产生草植物的子代，并且该第一草植物可以包含至少一条的序列SEQIDNO.2或其功能部分以及与其有80%同一性的序列；以及筛选所述草植物的子代以选择抗草甘膦的草植物的子代。在某些实施方案中，具有增强的草甘膦抗性的植物的育种方法包含以下步骤提供第一植物，所述第一植物是抗草甘膦的硬直黑麦草；将所述第一植物与第4物杂交以产生杂交种植物，所述杂交种植物包含抗草甘膦的基因；以及选择抗草甘膦的植物或其衍生物。在某些实施方案中，育种方法还可以包含将所述抗草甘膦的杂交种或其衍生物与第二植物回交以产生回交的杂交种植物，所述回交的杂交种植物包含天然的抗性基因，以及选择抗草甘膦的杂交的杂交种植物。在某些实施方案中，所述第二植物可以是至少一种的黑麦草、羊茅草、饲料黑麦草、festolium、其组合、其杂交种以及，生物。在某些实施方案中，育种方法还可以包含将第一植物暴露于秋水仙素或其他诱变因子(mutedgene)以形成四倍体。在黑麦草中使二倍体暴露形成四倍体是本领域公知的，例如见Myers(1939)J.Heredity30:499-504。在某些实施方案中，育种方法可以包含以下的步骤其包括将一个四倍体与四倍体的第二植物杂交以产生杂交种植物。这样的四倍体可能具有作为饲料产品(forgeproduct)的价值。在某些实施方案中，四倍体可以是黑麦草、其杂交种或其衍生物。在某些实施方案中，以一个四倍体的选择代与包含四倍体的第二植物可以进行进一步回交。在某些实施方案中，以杂交种四倍体与另一植物可以进行另外的杂交。在某些实施方案中，四倍体的植物包含抗草甘膦的植物EPSPS酶的多肽分子，并且多肽分子可以包含SEQIDNO.2或其功能部分中的至少一条序列。在某些实施方案中，育种方法可以包括一种材料，所述材料包含SEQIDN0.2或其片段以及与其有80。/n同一性的序列。在某些实施方案中，育种方法可以包括包含SEQIDNO.2及其片段的材料的用途。在某些实施方案中，育种方法可以包括含有以下序列的材料SEQIDNO.1的突变体或其片段以及与其有93%同一性的序列，并且编码抗草甘膦的EPSPS酶。在某些实施方案中，育种方法可以包括含有以下蛋白的材料SEQIDNO.17的突变体或其片段，并且是抗草甘膦的EPSPS酶。在某些实施方案中，育种方法可以包括羊茅草或羊茅草杂交种的用途。在某些实施方案中，育种方法可以包括使用本发明的抗草甘膦的植物以产生小黑麦的杂交种。从黑麦和小麦制造小黑麦杂交种的技术和方法是本领域技术人员/z^p的，并且可以包括二倍体、四倍体、六倍体、八倍体和/或双单倍体的用途。在某些实施方案中，这样的技术和方法可以包^水仙素用于使染色体加倍。在本文使用的一些技术和方法中，小麦被用作母本(细胞质)并且黑麦被用作父本(花粉M)，这样形成的小黑麦杂交种是不育的。在某些情况下，很难出现黑麦基因在小麦细胞质和显性的小麦核基因组的背景中的表达。在某些实施方案中，本文使用的技术和方法可以产生具有黑麦细胞质的小黑麦(secalotricum),并且它与小麦花粉被用于产生小黑麦。在某些实施方案中，生成的小黑麦植物或杂交种可以被用于产生非转基因的抗草甘膦的小麦植物。将性状从小黑麦转移至小;W:本领域技术人员7>的。在某些实施方案中，育种方法可以从抗草甘膦的硬直黑麦草或其杂交种产生抗草甘膦的小麦。在某些实施方案中，将草甘膦抗性培育至植物中的方法包含以下的步骤选择组成型表达抗草甘膦的酶的植物材料，使用所述植物材料和一个育种程序，以及选择具有所需的农艺性状的抗草甘膦的子代。在某些实施方案中，将草甘膦培育至植物中的方法包括^吏用来自黑麦草、羊茅草、festolium、其组合、其杂交种以及^^f生物的植物材料。在某些实施方案中，将草甘膦抗性培育至植物中的方法可以包括回交和进一步选择的步骤。在某些实施方案中，可以重复所述回交和进一步选择多次直至所需的农艺性状稳定。在某些实施方案中，将草甘膦抗性培育至植物中的方法可以包括硬直黑麦草的植物材料的用途，所述硬直黑麦草包含抗草甘膦的基因。在某些实施方案中，将草甘膦抗性培育至植物中的方法包括使用四倍体，并且这样的四倍体可以通过使用秋水仙素等诱变剂获得。育种草畔草的方法是本领域技术人员公知的(见例如Cassler和Duncan编辑的TurfgrassBiology,GeneticsandBreeding(2003))，并且任何的育种方法一一包括本领域技术人员已知的方法可以与本发明的抗草甘膦的材料一块使用。在某些实施方案中，本发明提供了在ATCC中保藏的Penner黑麦草(在2007年1月23日以保藏号xxxx保酌的种质。所述种质以种子的形式保藏。如本领域技术人员已知的，所述种质可以生长成草植物。在某些实施方案中，所述种质是多年生的黑麦草。在某些实施方案中，所述种质包含核酸分子，所述核酸分子包含下述序列SEQIDN0.1或其功能部分以及与其有93%的同一性的序列。在某些实施方案中，所述种质包含抗草甘膦的植物EPSPS酶的多肽分子。在某些实施方案中，所述种质包含一种多肽分子，所述多肽分子包含下述M酸序列SEQIDNO.2或其功能部分以及与其有80%的同一性的序列。在某些实施方案中，所述Penner黑麦草可以被用于育种程序中或者与性亲和的植物杂交以产生抗草甘膦的植物。在某些实施方案中，所述种质是多年生的黑麦草。还7>开了一种产生草植物的方法，其包含将产生自Penner黑麦草的草植物与至少一种其他草植物杂交以产生至少一种种子，M所述种子，并且使所述种子萌发以生成至少一种子代草植物。本发明的技术包括使用这种方法产生的草植物，以及所述草植物的营养枝、分蘖或克隆。在某些实施方案中，所述Penner黑麦草可用于产生如本文描述的抗草甘膦的祠料草。在某些实施方案中，所述Penner黑麦草可以用于产生抗草甘膦的小麦。在某些实施方案中，所述Penner黑麦草可以与羊茅草杂交。在某些实施方案中，本发明提供了从所述Pernier黑麦草产生抗草甘膦的草碎草的方法。在某些实施方案中，方法可以包括通过将所述Penner黑麦草的植物与第二草畔草植物杂交从所述Penner黑麦草产生子代植物，其中所述Penner黑麦草的种子样品以保藏号xxxxx保藏于ATCC;然后将所述子^R^t物自交或者与第4物杂交以产生下一代的子代植物的种子，>^斤述种子种植下一代的子代植物，并且将下一代的子4诚物自交或者与第^t物杂交；并且将杂交和种植步骤重复2至10次以从所述Penner黑麦草产生抗草甘膦的草坪草。在某些实施方案中，所述种质可以具有不止一对抗草甘膦的等位基因。至少一对所述的抗草甘膦等位基因是EPSPS基因在SEQIDNO.1的第301位核苷酸处的单核苷酸多态性("SNP")。通过对来自敏感的和抗性的黑麦草生物型的EPSPS进行测序鉴定所述SNP。在这个位置上胞嘧咬变，腺嘧咬将氨基酸vMJt氨酸变成丝氨酸。SEQIDNO.1的第301个核苷酸处的SNP可以#^作一个标记，用于鉴别携带抗性形式EPSPS的等位基因的植物。如表l中显示的并且在下文实施例中详述的那样，第二等位基因可以赋予草甘膦抗性。表1.在一组回交的草坪草样品中比较所述SNP和草甘膦抗性的发生。样品<table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table>a.SNP分析的实例见实施例5。在植物一一例如草畔草中同时具有所述第一等位基因(所述SNP)和所述第二等位基因可以增强草甘膦抗性。在某些实施方案中，所述第二等位基因可以是草甘膦氧化还原酶("G0X"),由G0X基因编码。为了产生抗草甘膦的植物_—例如草坪草，可以仅需要一对等位基因。在某些实施方案中，所述第二等位基因可以被鉴定为Gly-Rest2基因。所述Gly-Rest2基因编码抗草甘膦的蛋白，它可以祐:鉴定为不同于抗草甘膦的EPSPS的Gly-Resist蛋白("GRP")。为了鉴定哪些植物仅具有GRP蛋白，以下是可能有用的分析的实例。种植与已知抗草甘膦的植物杂交的植物。将有除草剂效果剂量的草甘膦施以所述植物。选择所述处理后存活的植物，然后将部分的所述植物用于确定是否存在抗草甘膦的EPSPS的生物标记。这样的分析的实例在下文的实施例中有所详述。如果所述生物标ie^在，那么所述植物至少具有抗草甘膦的EPSPS并且可能具有GRP。如果所述生物标记不存在，那么所述植物中存在有GRP并且不存在可检测量的抗草甘膦的EPSPS。可以设计用于GRP的生物标记分析，并且i殳计这样的分析是本领域^支术人员7^的。在某些实施方案中，本技术提供了一种生成基本上无杂草的草场的方法。在某些实施方案中，生成基本上无杂草的草场的方法包括以下步骤提供包含草甘膦草冲草的草场并且所述抗草甘膦的草坪草包含基本上是SEQIDNO.1或其功能部分的DNA分子；以及对所述草场施以有除草剂效果剂量的草甘膦化合物。在某些实施方案中，本发明包括获得基本上没有杂草变种的草场的方法，所述草场对所述杂草变种是敏感的。在这些实施方案中，所述草场基本上没有杂草。如本文指出的，草场敏感的杂草变种是那些按常规推理会在相似的草组成、土型和地理区的草场中出现的杂草。所述术语"杂草"是指不利的生长物，并且可以是以下中的一种蒲公英、牛筋草、欧亚活学丹(groundivy)、三叶草、马唐(crabgrass)、蓟、车前草、蓼(knotweed)、伛麦草(quackgrass)、4艮莲花(nimbleweed)、高羊茅草、匍旬苜股颖(creepingbentgrass)、结缕草(zoysiagrass)、铁线草、毛花雀稗(Dallisgrass)、田旋花(bindweed)、黑苜蓿、栗米草、千才艮草(chickenweed)、匍旬叫花子草(creepingbeggarweed)、鼠麴草、铍叶酸模(curlydock)、雏菊(Englishdaisy)、月见草、假蒲公英(falsedandelion)、牦牛儿苗(filaree)、墨苜蓿(Floridapusley)、宝盖草(henbU)、藜、锦葵、酢浆草、铜钱草(pennywort)、猪草、刺莴苣、马齿苋、豕草、小酸模、齐菜(Shepardspurse)、苦菜、婆婆纳(speedwell)、斑地锦、美狗舌草(tansyragwort)、胡萝卜、野生天竺葵(wildgeranium)、野牵牛花、鸭蒜(wildonion)、堇菜(wildviolet)、狐尾草、假高粱(Johnsongrass)、莎草(nutsedge)、百喜草、稗草、早熟禾、蒺藜草(sandbur)以及它们的组合。获得基本上没有杂草的草场的方法可以包括以下的步骤提供一个包含抗草甘膦的草碎草的草场，以;sjt所述草场施以有除草剂效果剂量的含草甘膦的混合物。在某些实施方案中，获得基本上没有杂草的草场的方法还包含种植能够长成抗草甘膦的草坪草的种子，其中所述草畔草选自于黑麦草、羊茅草、festolium,以及它们的组合、它们的杂交种以及它们的衍生物。在某些实施方案中，获得基本上没有杂草的草场的方法包含提供包含抗草甘膦的草畔草的草场，在某些实施方案中，SEQIDNO.1或其部分的EPSPS草甘膦抗性基因的DNA分子可以作为探针用于通过标准方法识别其他类似DM分子。在某些实施方案中，与硬直黑麦草的EPSPS草甘膦抗性基因同源或互补的寡核苷酸DM分子可以;故用于标记辅助的育种方法中，以协助将该基因培育至相关的作物种类和异源的作物种类中。例如，SNP分析可以被用于标记分析中。转基因抗草甘膦植物及制备方法在某些实施方案中，本发明提供了一种DNA构建体，所述构建体包含含有SEQIDNO.1的核酸分子，所述核酸分子编码抗草甘膦的植物EPSPS酶和SEQIDNO.2或其部分，并且与一个启动子可操作地连接以驱动在宿主细胞中的表达。在某些实施方案中，本发明提供了制备和使用这样的DNA构建体的方法。本文4吏用的术语"构建体"是指异源的遗传元件可操作^目互连接而组成重组DNA分子。在某些实施方案中，本发明提供了制备和使用这样的DNA构建体的方法。利用植物基因工程方法，可以通过将诱发高水平的野生型EPSPS产生的DNA分子插入至植物基因组中而产生抗草甘膦的植物。实例可以见Shahetal.，^72'e/zce233:478-481(1986)。草甘膦抗性也可以通过EPSPS变体的表达获得，所述EPSPS变体对草甘膦有较低的亲和性并且因此在草甘膦存在时保持其催化活性，这净皮例如美国专利4，940，835、5,094,945和5,633,435所披露，这些专利通过引用的方式纳^^文。例如如美国专利5，463，175所公开的，在植物组织中降解草甘膦的酶也能够赋予细胞的草甘膦抗性。因此，利用这样的基因可以产生抗草甘膦的转基因作物，从而利用草甘膦可有效地用于杂草控制并且对作物的损伤最小。例如，草甘膦抗性已经被通迚基因工程引入玉米中(公开于美国专利5，554，798)、小麦中(乂>开于Zhouetal.，户/a/^Ce//15:159-163(1995))、大豆中(公开于PCT申请公布W09200377)和芸苔中(/>开于PCT申^fr乂^布W09204449)。用于制名^i^甘膦的转基因植物的EPSPS和方法的其他实例包fe己载于和/或节选自根据以下文献的那些Singh，etal.,见"BiosynthesisandMolecularRegulationofAminoAcidsinPlants,"AmerSocPlantPhys.Pubs(1992);美国专利4，971，908;5，145，783;5，188，642;5,310,667;5,312,910;和6，40，497。它们还可以源自于非同源EPSPS基因的结构上不同的类一一例如^MOt菌CP4菌林分离的n类EPSPS基因。实例可以见美国专利5，633，435和5，627，061。作为EPSPSM酸编码序列改变的结果，野生型EPSPS酶的变体是抗草甘膦的，实例可以见Kishoreetal.，Wer."/oc力e瓜57:627-663(1988);Schulzetal.，JrcA137:121-123(1984);Sostetal.，173:238-241(1984);Kishoreetal.,见"BiotechnologyforCropProtection"ACS学术讨论会丛刊第379期，Hedlinetal.编辑，37-48(1988)。这些变体与野生型EPSPS酶相比一^:具有较高的Ki值一一这导致产生抗草甘膦的表型，而这些变体的特4ii^于对PEP的高Km——这J吏所itSl在动力学上是低效的。例如，大肠杆菌的天然EPSPS对于PEP的表观Km和对于草甘膦的4^见Ki是10pM和0.5jaM，而对于在位置96丙氨酸变成甘氨酸的单氨基酸替代的:^甘膦的分离体，这两个值分别是220nM和4.OmM。可以通过诱变构建抗草甘膦的植物变体EPSPS基因。本发明的技术的植物和方法中分别还可以使用EPSPS基因和蛋白的核酸和#^断列变体。"变体"DNA^是在天然EPSPS基因序列中包含小的变化的DNA分子一一例如天然EPSPS基因序列的一个或多个核苷酸被删除、添加和/或替换，并且所述变体EPSPS基因编码^^有EPSPS活性的蛋白。例如，变体DNA分子可以通过以下方式产生标准DNA诱变技M者化学合成所述变体DNA^^或其部分。核酸的4匕学>^成的方法在——例如Beaucageetal.，7fe"a.22:1859-1862(1981)和Matteuccietal.,/C力e瓜103:3185-(1981)中详述。核酸的化学合成可以在例如自动寡核苷酸合成4iUi进行。这样的变体优选不改变核酸蛋白编码区的阅读框，并且优选编码没有氨基酸变化的蛋白。形成核酸序列变体的最常见的目的是对所述序列修饰以添加或删除限制性内切核酸S^点或者影响所述核酸M的转M翻译。在某些实施方案中，本发明提供了包含DNA构建体的重组载体，所述DM构建体包含以下的核酸分子其含有SEQIDNO.1或其部分并且编码抗草甘膦的EPSPS酶，并且所述重组载体选自于质粒、人工染色体、粘粒、转座子、病毒及其组合。在某些实施方案中，本发明提供了制备和使用这样的重组载体的方法。本文^J^的术语"植物表达载体"是指包，控元件的嵌合DNA^S所述调控元件被可^ft^k^接以在植物中提供转基因产物的表达。本文使用的术语"嵌合的"是指融合的核酸或蛋白序列。嵌合核酸编码序列是由在阅读框内连接并编码嵌^白的两条或多条序列组成。嵌合基因是指一个由异源的多个遗传元件组成的基因。本文使用的术语"在可操作的组合中"、"以可操作的顺序"和"可,J4i^接的"是指核酸序列以以下方式的连接一^:核酸序列能够指导给定的基因转^/或所需蛋白分子的合成。这些术语在本文中也指核酸序列以上述方式连接从而产生功能性的蛋白。本文使用的术语"重组DNA构建体"或"重组载体"是指例如质粒、粘粒、病毒、自主复制序列、噬菌体或者线形或环形的单Mil双链DNA或RNA核苷酸序列的任何制剂，所述制剂可以是_任意来源的，能够^至基因组或自主复制，包—条或多条DNA以功能上可操作的方式连接的DNA分子。这样的重组DNA构建体或载体能够将5，端调控序列或启动子区域和选择的基因产物的DNA序列导入细胞中，所述DNA序列以这样的方式被转录成功能性mRNA,后:^L翻译并且因此^^达。为了抑制所需的特定RNA的翻译,重组DNA构建体或重组载体可以被构建成能够表ii^义RNA的形式。对在本文中有用的载体的该:计包括本领域才支^Mv员已知的方法(PlantMolecularBiology:ALaboratoryManual,Clark编辑，Springer,NewYork(1997))。本文使用的术语"质丰立，，^!指环形的、染色体外的、自主复制的DNA片断。本文^^|的术语"多肽片段"可以指EPSPS片段，所述EPSPS片M少比天然4^的EPSPS蛋白少一个g，但其明确地#EPSPS的活性。本文使用的术语"重组蛋白"或"重組多肽"是指由重组DNA分子表达的蛋白分子。相反，本文使用的术语"天然蛋白"是表示从例如非重组的源分离的蛋白。分子生物学技术可以被用于产生蛋白的重组形式，所述重组形式与所述蛋白的天然形式具有相同的性质。例如，SEQIDNO.2和SEQIDNO.14是天然蛋白。在某些实施方案中，本发明提供了包含DNA构建体的重组载体，所述DNA构建体包含以下的核酸分子其含有SEQIDNO.1或其部分并且编码抗草甘膦的EPSPS酶，并且所述重组载体选自于质粒、人工染色体、粘粒、转座子、病毒及其组合。在某些实施方案中，本发明提供了制备和使用这样的重组载体的方法。在某些实施方案中，本发明提供了包含SEQIDN0.2或其部分的分离的多肽分子，所述多肽M4lL供^^甘膦的EPSPS酶。在某些实施方案中，SEQIDNO.2是由SEQIDNO.1或其部分编码的。在某些实施方案中，SEQIDNO.2是从硬直黑麦草分离的。在某些实施方案中，分离的DNA分子编码SEQIDNO.2或其部分的抗草甘膦的EPSPS酶，其中所述DNAM具有SEQIDNO.1或其部分的核酸序列。在某些实施方案中，本发明提供了一种重组DNA分子，其包含在植物中有功能的启动子可操作地连接至编码包含SEQIDN0.2序列的EPSPS酶的结构DNA序列，可操作地连接至在植物中起到将多聚腺苷酸加到RNA序列3，端作用的3，非翻译区。在某些实施方案中，本发明提供了制备和使用这样的重组体分子的方法。在某些实施方案中，本发明提供了产生M甘膦的植物的方法，其包含步骤l)在植物细胞的基因组中插入包含以下序列的重组DNA分子在所述植物细胞中有功能的启动子可操作地连接至编码具有SEQ.IDNO.2序列的EPSPS酶的结构DNA序列，可操作地连接至在所述植物细胞中起到将多M苷酸加到其转录的RNA序列3，端作用的3，非翻译区；以及2)从所述转化的植物细胞再生遗传转化的植物，所述转化的植物与未转化的植物相比对除草剂草甘膦具有更高的抗性。在某些实施方案中，外源性遗传物质可以被转移至植物中，使用的是通过以下的方法为该目的设计的植物表达载体农杆菌、粒子轰击的方法或者本领域技术人员已知的其他方法。在某些实施方案中，外源性物质的亚组包含本发明的核酸分子。在某些实施方案中，被选择在本发明中使用的具体启动子一一就所述DNA分子而言应该能够诱导产生足够的表达，以在转化植物的营养组织或生殖组织中产生蛋白表达。启动子是调节RNA合成的DNA序列。启动子或启动子区通常出现在编码序列的上游(5，)，其通过以下方式调控所述编码序列的表达通过提供RNA聚合酶和/或在正确位点起始转录必需的其他因子的识别位点，控制信使RNA(mRM)的产生。已知的大多数天然启动子的位置在转录区之前。启动子的功能是开关，激活基因表达。如果基因被激活，即为基因被转录或者参与到转录中。转录涉及从基因合成mRM。因此，启动子作为转录调控元件，并且也提供基因转录成mRNA的起始位点。如本文预期的那样，启动子或启动子区包括通过以下方式派生的启动子变异体与多0控序列连接、随机诱变或受控诱变、以及增强子序列添加或重复。当被作为适合的重组栽体的一部分导入宿主的时候，本文公开的启动子区域及其生物学活性的等价物负责驱动受其控制的编码序列的转录，这可由其产生mRNA的能力来证明。启动子可以是"组成型的"或者是'H秀导型的"。本文使用的术语"组成型的"当被用于启动子时的意思是所述启动子在不存在刺激(例如热>^克、化学剂、光等)的时候能够指导可,连接的核酸序列的转录。组成型启动子一般能够指导转基因在^i4u^^r细Jffe^f^r组织中的表达。相反，"诱导型的"启动子在存在刺激(例如热休克、化学剂、光等)的时候能够指导可,连接的核酸序列的转录水平，与所述可,连接的核酸序列在不存在所述刺激的时候的转录水平是不同的。在某些实施方案中，DNA分子可以包含组成型的启动子、编码抗除草剂的酶的结构DNA序列和3，非编码区。本领域中已记载了大量的在植物细胞中有活性的组成型启动子。在某些实施方案中，在除草剂抗性的植物中组成型表达DNA分子的合适启动子，可以包括但不限于花椰菜花叶病毒(CaMV)35S启动子(Odelletal.，淑we313:801-812(1985))。植物中草甘麟的耙点一一EPSPS酶位于叶绿体中。在某些实施方案中，多种定位于叶绿体的蛋白(包括EPSPS)可以由核基因表达成前体，然后通过叶绿体转运肽(CTP)定位于叶绿体，所述转运#转入步骤中被切除一一如上文所述。合适的这种叶绿体蛋白的实例包括但不限于1，5-4酸核酮糖羧化酶的小亚基(SSU)、铁氧还蛋白、铁氧还蛋白氧化还原酶、捕光复合物蛋白i和蛋白n以及硫氧还蛋白F。在某些实施方案中，可以在体内和在体外证明通过使用与CTP的蛋白融合可以将非叶绿体蛋白定位至叶绿体，并且CTP序列对于蛋白定位于叶绿体是充分的。在某些实施方案中，合适的叶绿体转运肽的^——例如拟南芥EPSPSCTP(其实例可以见Kleeetal.，M厶6fe/.6fe/e^210:437-442(1987))和矮牵牛EPSPSCTP(其实例可以见della-Cioppaetal.,83:6873-6877(1986)),已经显示了将异源EPSPS蛋白序列定位至转基因植物的叶绿体中。在某些实施方案中，通it^达包含^J^端CTP的絲甘膦的EPSPS酶产生辟甘膦的植物是本领域技术人员公知的，并且其实例可以见美国专利5,312,910、5，627，061和5，633，435;以舰洲专利189707、0218571、508909和924299。本领域技术人员应理解可以制备多种嵌合构建体，利用特定CTP的功能性将M甘膦的EPSPS酶#^至植物细胞叶绿体中。编码叶绿体转运肽的核酸容易从基因组或任何定位至叶绿体的蛋白的cDNA获得，并且它们的序列是已知的并可以从例如GenBank获得。这种转运肽的另外的序列及其编码序列可以通过基于算法的搜索识别一一例如A.I.Scheinetal.，"Chloroplasttransitpeptideprediction:apeekinsidetheblackbox,"#"c/.29(16):6(2001)和O.Emanuelssonetal.，"ChloroP，aneuralnetwork-basedmethodforpredictingchloroplasttransitp印tidesandtheircleavagesites,"Sc/.8:978—984(1999)中详细描述的；或者，可以对提交到ChloroP网站(TechnicalUniversityofDenmark,Lyngby，DK的CenterforBiologicalSequenceAnalysis,可从http:〃丽.cbs.dtu.dk/services/ChloroP/ii>V)的4壬何序列进4亍ChloroP算法的序列分析。^f可这样的^MM的N末端肽可以以与根据本文描述的某些实施方案的EPSPS的融合的方式^^^成。在某些实施方案中，最后转录的是在嵌合载体中可操作地连接至所需基因的3，非翻译DNA序列。在某些实施方案中，重组DNA分子的3，非翻译区含有多腺苷酸化信号，所述多腺苷酸信号在植物中的功能是引M噤呤核苷酸添加至RNA的3，端。在某些实施方案中，3，非翻译区可以4植物细胞中表达的多种基因获得。在某些实施方案中，以下的3，非翻译区的这方面的能力可以被利用胭脂碱合成酶3，非翻译区(其实例可以见Fraleyeta1.，户wc.80:4803-4807(1983))、豌豆1，5-^酸核酮糖羧化/加氧酶的小亚基(Rubisco)基因的3，非翻译区(其实例可以见Coruzzietal.，M即/.3:1671-1679(1994))、大豆7S种子贮藏蛋白的3，非翻译区(其实例可以见Schuleretal.，to.10:8225-8244(1982))。在某些实施方案中，包含农杆菌瘤诱导(Ti)质粒基因的多M苷酸信号的3'转录非翻译区的这方面的能力可以被利用。植物分子生物学领域的技术人员可以适当地替换上述的遗传元件和其他相似功能的调控元件以将必需的功負y^供给植物表达盒。为在质粒中表达设计的对草甘膦耐受的DM构建体将需要包含在质粒中发挥功能的遗传元件。在某些实施方案中，栽体还可以包含筛选或选择标记的基因。本文使用的术语"选择标记，，是指以下的核酸序列其表达赋予有利于识别含有所述核酸序列的细胞的表型。选择标记包括那些赋予有毒化学剂抗性的标记(例如氨节青霉素抗性、卡那霉素抗性)、营养缺乏的补充物(例如尿嘧啶、组氨酸、亮氨劇或者出现可视觉分辨的特征(例如颜色变化或荧光)。有用的显性选择标记的基因包括编码抗菌素抗性(例如潮霉素抗性、卡那霉素抗性、博来霉素抗性、G418抗性、链霉素抗性或大观霉素抗性)的基因；以及编码除草剂抗性(例如膦丝菌素乙,移酶)的基因。用于选择有除草剂抗性的转化体的方法,皮记载于例如以下文献中Vasi1，tfe//tW犯d5b迈a〃cy4/7/7//ca〃o/w，AcademicPress,NewYork(1984)。其他可能的选#^/或筛选标记的基因对本领域技术人员是显而易见的。在某些实施方案中，选择标记可用于监测表达。有多种方法可以将转化核酸分子导入植物细胞。在本技术的某些实施方案中，用于转化编码植物EPSPS的核酸序列的合适方法实际上包括4封可的在将核酸M导入植物细胞中显示效果的方法，例如M菌感染、微弹轰击或核酸^"f"的直接递送。IW技术已经记载了将核酸^^直接递送至细胞的4种常用方法(l)化学方法(其实例可以见Grahametal.，Wro/0^754:536-539(1973));(2)物理方法——例如显樣i注射(其实例可以见Capecchi,Ce//22:479-488(1980))、电穿孔(其实例可以见Wongetal.，A/oc力e瓜A'o/7A^y.6b鹏〃/7.107:584-587(1982)、Fro咖etal.，化〃.Sc/.82:5824-5828(1985)和美国专利5，384，253)和基因枪(其实例可以见Johnstonetal.，VeMo^yCe//》/0/.43:353-365(1994));(3)病毒载体(其实例可以见Clapp，t7//7.,er//7a^7/.20:155-168(1993)、Luetal.，/178:2089-2096(1993)和Eglitisetal.，A/0&c力/7/^s6:608-614(1988));和(4)受体介导的机制(其实例可以见Curieleta1.，仇肌Ce/z.7er.3:147-154(1992)和Wagneretal.，Afe〃.Sc/.89:6099-6103(1992))。农杆菌介导的转移是一种将基因导入植物细胞的广泛应用的系统，这是因为DM可以被导入整个植物组织，从而省去了从原生质体再生完整的植物的步骤。<MM菌介导的植物^载体将DM导^v^t物细胞^l本领域/厶知的。现代的农杆菌转化栽体能够在大肠杆菌和农杆菌中复制。在某些实施方案中，含有未卸曱的(armed)和卸甲的(disarmed)两种Ti基因的农杆菌可以用于转化。在这些农杆菌介导的转化有效的植物变体中它是被选择的方法，这是由于其在基因转移方面容易的并确定的性质。还应理解的是，两个不同的转基因植物可以交配以产生包含两种独立分离的外源基因的后代。在某些实施方案中，合适子代的自交可以产生两个外源基因都纯合的植物。还考虑与亲^tt物的回交和与非转基因植物的异型杂交，以及营养繁殖。在某些实施方案中，转基因植物可以被包括在本文描述的育种方法中。在某些实施方案中，也可以使用其他的细胞转化方法，所述方法包括但不限于通过以下方式将DNA导入植物通过将DNA直接注射至植物生殖器官将DNA直接转移至花粉；或者通过直接将DNA注射至未成熟胚的细胞中，接着将脱水胚再水化。从单个的植物原生质体转化体或者从各种转化的外植体再生、发育和栽培植物是本领域公知的。在某些实施方案中，再生和种植方法包括以下步骤选择转化的细胞、培养这些个体化的细胞经过胚发育的常规阶段，经过生根小档_林阶段。在某些实施方案中，转基因胚和种子可以以类似的方式再生。在某些实施方案中，产生的生根的转基因枝可以因此被植于合适的植物生长介质，例如土壤中。含有异质的外源、异源基因的植物的发育或再生是本领域中公知的。在某些实施方案中，再生的植物自花受粉以提供纯合的转基因植物。另外,从再生植物获得的花粉与种子生长的农艺上重要系的植物杂交。相反，来自这些重要系的植物的花粉被用于对再生的植物受粉。在某些实施Z/^p的方法栽培。此外，本领域技^^员可以理解以下美国专利中的与植物转^4目关的方法和组^^:4,971,908、4,769,061、5,145,783、5,188,642、5,310,667、5,312,910、5,352,605、5,530,196、5,585,742、5，792，930、6，204，436、6,225,114、6,362,396、6,426,185、6，566,587和6，825，400。任何类型的细胞都可以用于从根据本发明的实施方案的核^Ji^文描述的改良的^甘膦的EPSPS。所述细胞可以是分离的单个细胞，或者是多细胞集聚的部分一一例如胼胝体、组织或生物体。在某些实施方案中，所述细胞将是植物细胞；在某些实施方案中，是单子叶植物细胞。在某些实施方案中，所述植物将是禾本目植物，优选是禾^f"植物。该科的植物的实例包括蓊股颖(蓊股颖属的普通苜股颖、匍荡苜股颖、细弱蓊股颖等多个种)、狗牙根(狗牙根属的狗牙根(Ot"^朋Ac^/o/7)等多个种)、早熟禾(早熟禾属的草地早熟禾、粗茎早熟禾等多个种)、野牛草(野牛草属的野牛草(A/c^/mcfec0^oA/e》等多个种)、地趁草(慈草属的^r朋o/w;y等多个种)、假俭草(假俭草属的假俭草Cfi^/z/OC力/oa0>/7//"iW'cfe5)等多个种)、羊茅草(羊茅属的苇状羊茅、羊茅、紫羊茅、草稃羊茅等多个种)、发草汰草属的发草(2fescA2邵s/acaes/7"oya)等多个种)、羽绒^C^(fountaingrass)(狼尾草属的狼尾草CPe/z//sef腿c/朋cfey〃/咖)即kikuyugrass等多个种)、crowngrass(雀;^"属的^^^年？卩Bahiagrass、海滨雀稗^卩seashorepaspalum等多个种)、黑麦草(黑麦草属的多花黑麦草、多年生黑麦草、硬直黑麦草等多个种)、盐草(盐草属的ZVW/c力/Aw/ca"等多个种)、圣奥古斯丁草(St.Augustinegrass)(钝叶草属的偏序钝叶草(5^e/20^7/Lr咖seco/jtf"uad等多个种)和草坪草(结缕草属的日本结缕草、马厄扭结缕草、细叶结缕草等多个种)。通过本领域已知的任何方法，可以将根据本文描述的某些实施方案的核酸转化至细胞或者例如其原生质体。在某些实施方案中，所述多肽以及编码该多肽的核酸可以是分离的、天然存在的分子。在某些实施方案中，所述多肽以及编码该多肽的核酸可以包含天然序列。在某些实施方案中，所述多肽以及编码该多肽的核酸可以是重组体并且至少一个上文指定的可以是突变的，即不是在所述多肽中天然存在的并且不是由该核酸的天然编码序列在天然状态编码的。实施例如下的实施例不是以任何形式对本发明进行限制。本领域技术人员可以利用这些实施例更好地理解本发明。实施例1石更直黑麦草/"2^/cT腿Gaud.)收集自从1984年开始用大量草甘膦处理的杏园。在温室中种植所述收集的植物并产生种子。使用草甘膦有效成分为l.12kg/公项、2.24kg/公顷和3.36kg/公项的用量，在第一代中选择抗性的、中间的和敏感的生物型。继续进行以下的筛选以高草甘膦用量(8.96kg有效成分/公顷)选择抗性个体，以低用量(0.28kg有效成分/公顷)选择敏感个体。本实施例中使用的抗性生物型(R)和敏感生物型(S)分别是从第5个循环和第4个循环产生的。加利福尼亚硬直黑麦草的R生物型和S生物型被分别种M种球形成前的完全营养生长成熟阶段。在一个实施方案中，在两^^i物(一林R生物型和一林S生物型)上^^取一片完全成熟的叶用以下的方式处理用3滴2jal的草甘膦(草甘膦异丙胺盐，ROUNDUPULTRA,MonsantoCo.，St.Louis,M0)溶液给予叶的上表面。这相当于在每公项187L的体积和172.5kPa的压力下草甘膦有效成分为1.12kgA^项的田间用量。在处理一周之后，S生物型死亡，而R生物型没有出现损伤。实施例2对R系和S系石更直黑麦草进4亍剂量响应研究。施以0.125x、0.25x、0.5x、lx、2x、4x、6x、8x、10x和12x水平的草甘膦用量。喷洒的溶液和施药方法与前文描述的类似。在4WAT评估可观测的植物损伤。两组实验(每个处理8次重复)的数据(4WAT)经非线性回归分析并且按照如下的log对数模型(log-logisticmodel)进行拟合-y=_一厕_1+欲p[b(log5C-logX幼)j其中y是预测的植物损伤(%对照)，X5。=获得50。/淑伤需要的剂量，b是Xs。处的斜率。在8-10周后，所述收集的^t物在温室中产生了种子。将所述种子指定为第一代，^!i:^种子并且重新种植用于评估絲甘膦抗性。如表2所示，在施以lx、2x、4x和8x的草甘膦后的存活率分别是89。/fl、59%、45%和9%。在每个草甘膦水平的各种敏感'^4明，所述收获的植物是遗传杂合的并#所述第一代中出现了分离。表2.从美国加利福尼亚收集的硬直黑麦草("//咖r2>/cM)的第一代的草甘膦抗性和敏感性。草甘膦存活者*死亡植物kg有效成分/公顷'.......'…百分比..........……O100o1.12(lx)89llc2.24(2x)59414.48(4x》45558.邻(8tc)一91a数据是两个实验(每个实验90^a物)的平均。b用于产生抗',物(R系)的植物。e来自克隆的用于进一步选#*敏感植物的种子。R系和S系的剂量响应曲线在图1中显示。R系和S系的15。(50%*员伤)的草甘膦用量的比率大于100倍(比率为llx对0.lx)。该大于100倍的比率表明，与已经证明有草甘膦抗性的其他杂草(在例如Heap,//7^r加〃朋a/5i/r^ro尸#er6/c/A/)es/Wa;^胎e^y(2004)中有净艮道，可从www.weedscience.org获得)相比，^加利福尼亚硬直黑麦草产生的硬直黑麦草中有很高的草甘膦抗性。实施例3在温室中安排具有相似成熟度的R系和S系的每个植物之间的异花受粉。为了防止来自不想要的黑麦草的花粉的污染，用透明塑料覆盖植物。例如Thorogood，户ere朋/a/Wye^rass(丄0//咖pere/zue丄.)见M.D.Casler和R.R.Duncan编辑，rw/^ras"/o/柳，6^〃"，a/w/A,eed//^，JohnWiley&Sons,Inc.,第75-105页(2003)中所述，这样处理的自花受粉的可能性小于3%。从R植物和S植物中M约500粒成熟种子并且分别##。种植民植物并且旨类似于前述的M。当植物高5-8cm时，评估R子代的草甘膦敏感性。以0.125x、0.5x、0.25x、lx、2x、4x、6x和8x的草甘膦喷洒，并且所述喷洒溶液的制备和iHit如前述。在3WAT和4WAT记录两个草甘膦实验每个中的10^tt物的^。^^种植20林均未喷洒的仏子代植物(RxS)，^吏之互交以产生F2。成熟的种子并且按前文的描iii^辨植。在F2种群中进一步评估草甘膦抗性。如前文所述，在分蘖阶段以0.125x的草甘膦(用于鉴定敏感亲本的用量)喷洒400林F2种群的植物。在3WAT和4WAT记录敏感植物(^重损伤的和死亡的)的数目。存活者经过另外1周的再适应后再以8x的草甘膦(用于鉴定抗性亲本的用量)喷洒。在3WAT和4WAT记录存活者的数目。在所述植物种群中剩下的那些显示敏感剂量和抗性剂量之间的植物被鉴定为是中间的。在F2种群中敏感、中间和抗性之间预期的比例用一个或两个基因参与草甘膦抗性的遗传的模型评估，这在例如以下的文献中详细描述DiggleandNeve见^"6/cA/ejes/s^/7cea/w/^rA/Cr3//^,S.B.Powles和D.L.Shaner编l卑，CRCPress,BocaRaton，London,NewYork,Washington,D.C.，第61-99页(2001)。卡方分4射皮用于确定F2分离的最可接受的比例和草甘膦抗性的遗传性。在温室中成功地杂交了R系和S系。从R亲本和S亲本分别收获民子代的种子。从R亲本(RxS)和从S亲本(SxR)jj^的R子代中的草甘膦敏感性显示是中间的，并且^Mt最高为2x的草甘膦中存活。(RxS)和(SxR)的R子代植物在lx和2x的草甘膦处理3WAT的损伤的范围分别是0-10%和50-60%。2x草甘膦造成的损伤在4WAT时下降至20-30%，并且在第5周后完全康复。4x或更高水平的草甘膦杀死了R植物。这些数据表明草甘膦抗性的遗传在加利福尼亚硬直黑麦草中是部分显性的和花粉传递的，没有母性遗传的迹象。来自RxS的未喷洒的Fi子代(20^Mt物)互交以产生F2。F2种群的草甘膦敏感性和卡方分析在表3中显示。0.125x草甘膦致死的植物和8x草甘膦存活的植物分别被指定为基因型类似于R亲本和S亲本。种群中其他的其^t物被鉴定为是中间的，它们处于敏感植物和抗'她物之间。基于孟德尔分离的预期比例和卡方分析在表3中显示。表3.来自加利福尼亚的硬直黑麦草ao/y咖r/^Vf咖Gaud.)的抗性生物型(8x草甘膦下存活)和敏感生物型(0.125x草甘膦下致死)杂交产生的F2种群的卡方分析。<table>tableseeoriginaldocumentpage36</column></row><table>a如果一个基因参与草甘膦抗性的遗传，用于在F2种群中的预期分离比的模型抗性的(RR):中间的(Rr):敏感的(rr)-l/4:2/4:1/4,na:不接受假设，aa:接受假设。b如果两个基因参与草甘膦抗性的遗传，用于在F2种群中的预期分离比的模型抗性的(RRRR):中间的(RRRr+RRrr+Rrrr):^t感的(rrrr)=l/16:14/16:1/16，na:不接受假设，aa:接受假设。在来自RxS互交的F2种群的400#^物中，27梯^ti物是敏感的(0.125x草甘膦下致死)，352林是中间的(在R和S之间)，21株是抗性的(8x草甘膦下存活)。用分别与一个或两个基因的遗传相关的假设分布比(l/4):(2/4):(1/4)和(1/16):(14/16):(1/16)来检验上述数目。如表3中所示，以分布比(1/16):(14/16):(1/16)检验的乂2值(乂2=0.8;0.75<P<0.90)表明至少两个基因参与草甘膦抗性的遗传。多个基因参与加利福尼亚硬直黑麦草的草甘膦抗性与例如以下文献报道的澳大利亚的硬直黑麦草的结果类似Fengetal.，/fee"c/.47:412-415(1999)和Pratleyetal.，,e"c/.47:405-411(1999)，但是与以下文献公开的遗传研究不同Lorraine-Colwilletal.,7fteor.J卯/.Ce/2e〃cs102:545-550(2001),后者的结论A^硬直黑麦草中草甘膦抗性的遗传涉及单个的半显性基因。实施例4如前文所述,从生长成熟期的加利福尼亚硬直黑麦草的冠组织分离总RM。分离RNA的方法改良自以下文献中详细描述的方法ChomczynskiandSacchi，^a/."/oc力郎162-156-159(1987)。通过使用OligotexmRNAMiniKit(QIAGENInc，Valencia,CA)#^1照厂商推荐的##从总RM中分离多聚AmRNA。mRNA的数量和质量通过光镨测定确定。^J)5，/3，RACEPCR试剂盒(RocheA卯liedScience,Penzberg，Germany)从多聚AmRNA合成cDNA的第一M。合成第一#^cDNA的##依照试剂盒的推荐。由mRNA的转^始，使用的^^应緩冲液中提供的脱lt^腺嘧咬锚(dT-anchor)和逆转录酶。cDM的第一^^浮皮作为PCR的模板用于扩增EPSPS编码区的主片段，^Ht^I正向和反向寡核苷酸(分别是FPl引物和反向RP1引物(IntegratedDNATechnologies,Inc.,IA))。包含cDNA;jt板、引物、緩冲液(PromegaCorp.,Madison,WI)、dNTP(核苦酸混合物(PromegaCorp.，Madison,WI))和Taq聚合酶(PromegaCorp.，Madison,WI)的PCR〉V給液4皮开发并,^于热循环中，温度的调节根据厂商对所述引物的4錄。如果引物的退火温>1^异超过1.0X:，可以通过降落PCRii^亍所i^应，这在例如以下的文献中有详细描述Donetal.，vV〃c/.女AfWe;y.19(14):408(1991)。PCR产物经过电泳，通过在UV光下显示清晰的带确i^功的扩增。切下所述带并使用所述试剂盒(来自5V3，RACEPCR试剂盒)从^^提取DNA。从PCR产物中4€取的DNA在GenomicTechnologyandSupportFacilities,("GTSF"),MichiganStateUniversity测序。如图2所示，EPSPS基因的3'端由第一^^cDNA作为模板通过3，RACEPCR产生。正向寡核苷酸引物(FP1(SEQIDN0.3);FP2(SEQIDNO.4);FP3(SEQIDNO.5))由以前测序EPSPS的编码区的主片^R构建，并且^J1由所迷试剂盒:^供的锚引物(SEQIDNO.IO)作为反向引物。开发了由于上述热循环中的PCR^給液，所述热循环的温度根据厂商的推荐调节。如前文所述Akii行扩增产物的电泳和进一步处理。通过5，RACEPCR产生EPSPS编码区的5，端。反向寡核苷酸引物(RP2(SEQIDNO.6)、RP3(SEQIDNO.7)和RP4(SEQIDNO.8))由以前测序EPSPS的编码区的主片段构建。^JI上述的緩沖^JI体系中的引物RP2和逆转录酶，从mRNA合成5，端cDNA的链。通过dATP核苷酸和末端转移酶(由上述的相同试剂盒提供)的反应，多聚A的尾被连接至cDNA链的5'末端。使用5，端cDNA链作为模板、脱，腺嘧咬锚(SEQIDN0.9)和RP3分别作为正向引物和反向引物进行PCR以扩增5，端EPSPS编码区。为了更好财增5，端EPSPS基因，用当前PCR产物为^t板，锚引物和RP4分别作为正向引物和反向引物进;f亍巢式PCR。根据厂商的##调节PCR混合液的扩增温度。如上文所述iikii行来自巢式PCR的扩增产物的电泳、显^^进一步处理。为了确认PCR产物的序列，通过使用pGEMEasy载体系统n(PromegaCorp.:Madison，WI)将EPSPS编码区的主片段、5，端和3，端克隆进质粒中。来自PCR产物的片段与载体连接，然后转化至JM109感受态细胞中并且在细菌培养用琼脂平板上培养，所述平板包含抗生素、异丙基-e-D-硫代半乳糖苷(IPTG)和5-溴-4-氯-3-吲咮-D"半享Ut苷(X-gal)。在37C培养24小时以后，白色菌落的生M示转化成功，而蓝色菌落表示转化失败。白色菌落在含抗生素的LB培养基中37t:下继续振荡培养24小时。然后，^^]提取试剂盒(QIAGENInc.，Valencia,CA)^::W^立DNA。在GTSF，MichiganStateUniversity对^i入片段进fr测序。实施例5在靶/"^^植物中，^JISNP测定来确定EPSPS基因在SEQIDNO.1的第301核苷酸的单核苷酸多态性(singlenucleicpolymorphism)("SNP")。通NO.;的第301个核苷酸的SNP可以用作鉴"带抗性形式EPSPS的植物的标记。DNA提取从生长于温室中的靶/试c^植物收集叶组织。通过^j)QIAGENDNeas，植物小试剂盒或WhatmanFTAEluteMicroCards4^取DNA。才艮据厂商的推荐(QIAGENSciences,Maryland,USA或WhatmanInc.,FlorhamPark，NJ，USA),用标准步^Ut物组织纯化总DNA。从至少10mg植物组织开始，1份植物组织中加入5份的PBS緩冲液。使用微型小杆或微离心管将叶组织磨成匀浆。所述匀浆^到标记环(markedcircle)内部的FTA⑧、舰小卡(FTAEluteMicroCard)M中。4^f可余下的半匀浆组织会,奵斤述卡拦截，并且l^被丢弃。在室温下将所述FTA卡在空气中干燥2个小时。根据如下修改的#^步^所述FTA卡上洗脱DNA:仅仅是对每个样品产生两个直径为2mm的孑L(2mm的穿孔工具来自RobozSurgicalInstrumentCo.Inc.Gaithersburg，MD，USA,货号#65-9902)代替单个直径为3mm的孔。对每个样品使用两只来自新的WhatmanFTA纸的穿孔器以使交叉污染最小化。在1.5ml的微量离心管中进行穿孔，使用无菌水洗脱DNA。4^1分光it^计估计DM的浓度。SNP测定才艮据厂商的推荐(A卯liedBiosystems，FosterCity，CA，USA)开发定制的TaqManSNP基因分型测试。5微升的每种样品(两份)被转移至384孑L^的孔中(A卯liedBiosytems384孔^Ji板，货号#4309849)，然后使W室温下风千。通粉入5ia1主^gjL^^';^384孑Ul的每个孔中[2.5p1无AmpEraseUNG的Taqman通用主混合液(2x),0.125ji1的40x测定混合液(引物和Taqman探针，40x)和2.375y1的衬生物学级的水]进行SNP基因分型效'J定。引物和Taqman探针通过AppliedBiosystems的"Assay-by-Design"月良务设计并合成(正向引物CGGCAGGTTCCCGATTGA(SEQIDNO.11);反向引物GCATTTCCACCAGCAGCTACTA(SEQIDNO.12);V10s^标i己的Taqman探针CCGTCAATGgCCGCAT(SEQIDNO.13);和FANT-标记的Taqman探4十CCGTCAATG^CCGCAT(SEQIDNO.14))。将所述板密封(AppliedBiosystemsMicroAmp光粘性膜，货号#4311971)，短暂地振荡，并进行短暂地离心。在AppliedBiosystems7900HT序列检测系统中进行实时PCR，使用惰性参比染料R0X,并且关闭9600仿真模式(9600emulation)(循环##::50匸2耕，95X:10转；40个循环92匸15秒和60°C1糾)。朋AppliedBiosystemsSDS软件0M^2.1)进行等位基因辨别分析。实施例6EPSPS的提取方法改良自以下文献中描述的方法Boerboometal.，reed5W.38:463-467(1990)。v^Ua利福尼亚硬直黑麦草收集^l且织(每个样品0.5克湿重)，在液氮中冷冻并且用装有150mg聚乙烯聚他咯烷酮(PVPP)的冷研钵磨碎。将所得的细^^且织在0.5ml的提,沖液(pH7.5)中ii一步^9f磨，所述提g冲液含有10mM三羟曱基^&曱烷盐雖、1mM乙二胺四乙酸(EDTA)、10。/。(v/v)甘油、1mg/ml牛血清白蛋白(BSA)、10mM抗坏血酸、1mM苯曱脒(BAM)和5mM二硫苏糖醇(DTT)。在15，000xg离心所述;^^液10分钟，上清絲1.0ml的葡^t舰G-50柱(7MICRO-SPINS*葡聚糖舰G-50柱，LifeScienceProductsInc.,Frederick,CO)中脱盐，并且进一步在1，000xg离心3分钟。遵照Bradford,^a/.历'oc力e迈72:248-254(1976)中描述的方法，在595nm用光语测定定量上清液中的总蛋白。EPSPS活性的测定改良自WestwoodandWeller，粉W5W.45:2-11(1997)中详细描述的方法。使用pH7.5的緩沖液中的10n1酶提^L^E微型管中测定粹酸3-磷酸(S3P)和磷狄醇式丙酮酸(PEP)的^JI。所ii^J^給液含有50mMHEPES、1mM(NH4)6Mo7024、5mMKF、1mMPEP、1mMS3P以及以下浓度的草甘膦0、5、50、500和5000jiM。在25。C下孵育^I混合液20分钟，在ioox:水浴2分钟进4^f止并在15，oooxg离心io分^H吏变性的蛋白沉淀。通过用以下方式确定混合液中剩余的PEP定量S3P和PEP的反应加入NADH、丙酮酸激酶和乳^氲酶(PK/LDH)在340nm下用分光3t^计测量。在EPSPS的酶活'錄示为每mg蛋白的酶#(EU)，1EU等于在测^Ml中每分钟消耗1摩尔PEP。每种处理三次重复的实验结果用非线性回归分析并且按照以下的log-对数模型进行拟合y一100_l+exp[b(logX-logX50)]其中y是预期的EPSPS活性(%对照)、X5。=抑制50%的EPSPS活性需要的草甘膦浓度，并且b是在Xs。处的斜率。如图3所示，对来自R生物型和S生物型硬直黑麦草的组成型EPSPS的活性的评估显示，存在5-5000jiM的草甘膦的时候，S中的EPSPS与R中的相比被更加显著地抑制。R植物中EPSPS敏感水平的降^[^4现出是加利福尼亚硬直黑麦草中草甘膦抗性的主要因素。这与例如以下文献描述的关于澳大利亚硬直黑麦草的报道结勤目反Baersonetal.，粉ed50:721-730(2002)和Lorraine-Colwilletal.,户es〃c5t/.55:486-503(1999)，并且比例如以下文献描述的关于马来西亚的抗草甘膦牛筋草有更显著的和意想不到的草甘膦抗性(高大约两个数量级)Baersonetal.户/a/^Physiol.129:1265-1275(2002)。实施例7在8x的草甘膦中存活的R生物型的加利福尼亚硬直黑麦草和在0.25x的草甘膦中死亡的多年生黑麦草被单独^t植于950ml盆中，所述盆中含有上文描述的专业种植^^培养基。将^tt物,在温室中，补充光照、每天浇水并且每周用NPK水溶性月C^(20-20-20)^y巴。在成熟营养阶段，将多年生黑麦草植物在温度4±1°C、8小时#16小时夜的生长室中进行春化处理。经过4周的春化处理后，将所述植物移出并^#在温室中直至开花。草甘^^更直黑麦草植物不需要春化处理即开始开花。因为两个物种都是异花受粉植物，所以将多年生黑麦草的种球用加利福尼亚硬直黑麦草受粉，并且也进行反向地受粉。已经知道两者都是自交不亲和的。在种球出m^和花粉打开前，每个物种的各一##:物被隔离于温室的隔间中。为了提供异花受粉的条件，多年生黑麦草和硬直黑麦草植物被并排放置。在受粉时期，按照前述常Mi^维持植物直至种子成熟。由完全发育成熟的褐色种子表示杂交成功。从多年生黑麦草和硬直黑麦草^li^^种子。使用多年生黑麦草杂交种的种子进行进一步的评估。如前述，从多年生黑麦草收获的&杂交种的种子在温室中以单植#^种植并维持。在分蘖阶段，以每种草甘膦用量(O.25x、0.5x、1.0x、1.5x、2.0x、4.0x和8x，Mx=1.12kg/公项)处理50^Nt物进行敏感性或抗性的评估。使用扇形雾锥M在172.5kPa的压力下以18717/>顷的喷洒溶液喷施草甘膦。在处理3周后计数每个处理中的死亡者或存活者，具有最高抗性水平的植物祐:进一步维持并互交以产生F2。用0.5x的草甘^^f估F2种群的草甘膦敏感性。在处理3周后(3WAT)记录严重损伤的植物和死亡的植物，并且将这些植物指定为与敏感的(S)亲^f目似。将存活者进行再适应用于8x草甘膦下的进一步评估。来自8x草甘膦的存活者^:指定为与抗性(R)亲^f目似。剩下的对应于S和R之间种群^L指定为中间的(1)。根据F2种群中的孟德尔分离比率评估草甘膦抗性性状的遗传。对涉及一个、两个或多个基因时敏感的、中间的和抗性的之间的预期比进行假设。卡方分才/m用于确定F2种群的最能接受的比值。来自F2种群的抗性植物与S亲本(多年生黑麦草)回交。春化处理和受粉的操作与上文描述的相似。使来自所述回交(F山d)的&杂交种;tt物互交以产生F2(F2bCl)。在F2bd种群中评估草甘膦抗性性状的遗传。用0.25x和8x的草甘^估草甘膦敏感性。数据收集和遗^^H古与上文的,相似。在温室中成功地进行了多年生黑麦草和加利福尼亚抗草甘膦的石更直黑麦草的杂交(M4)。表4.多年生黑麦草("//咖/7"e/we)和加利福尼亚^^甘膦的硬直黑麦草(厶Wg/cfe^之间的杂交方案。硬直黑麦草(取自加利福尼亚)第一代中的分离分离的抗性个体和敏感个体的选择多年生黑麦草X抗性硬直黑麦草的第？代(3亲本》JUx草甘膦存活的)Ei杂种(互交)4F2杂种(S-亲本>x(寂)(l):(s》多年生黑麦草iFibc杂种(互交》Pabci杂种多年生黑麦草x(草甘^R)(S-亲本》jF2bc"(评估R、I和S)^甘膦性状通过异花受粉被转移至多年生黑麦草。从多年生黑麦草^的F2杂交种植物显示了中间的抗性水平，2x的草甘膦处理时90%^_存活的(见表5)。表5.&种群(多年生黑麦草和草甘膦抗'1^更直黑麦草杂幻中草甘膦的敏感小生或抗寸生。<table>tableseeoriginaldocumentpage43</column></row><table>在图4中显示了草甘膦敏感性在F2种群中的分离。敏感植物在F2中的百分数(16%)比预期的高，这是由于草甘膦用量(O.5x)超过敏感亲本的敏感7jc平。进一步的评估显示，多年生黑麦草的敏感性水平是O.25x的草甘膦。来自F2的抗'秘物到敏感亲本多年生黑麦草的回交被设计,用以再现敏感亲本(多年生黑麦草)的农艺特征。F由d种群中的草甘膦抗性水平表现出与前面的Fi种群相似的结果。草甘膦敏感性水平在F2bd种群中的分布在图5中显示。以0x、lx、2x、4x、6x、8x、10x、12x和14x的草甘膦对来自Fzbd的抗性植物样品的敏感性水平进4tif估，并且结果在图6中显示。6x以下的草甘膦水平没有出iy员伤，在8x和10x时出现轻微损伤，并且12x的草甘膦下出现严重的损伤。来自8x以下草甘膦水平处理的F2bd的抗性R克隆的生^发育(包括花序(inflorescence))与对照植物相似。实施例8錄达抗性的硬直黑麦草EPSPS的农杆菌测定草甘膦抗性的水平，所錄杆菌用编码抗性的EPSPS酶(SEQIDNO.16)的DM构建#^#化。EPSPS基因(SEQIDNO.15)来自M甘膦的硬直黑麦草。所述EPSPS基因与二元载体pFGC5941连接，pFGC5941是一种11406bp的构建体，它具有卡那霉素抗性基因，作为选择标记的BAR基因以及35S启动子。所iii^^^隆至pGEM载体并且在LB肉汤培养基中培养。在来自克隆的pGEM的质粒中通过PCR确认插入的EPSPS基因。通过"冻融技术"利用液氮将经确认的所i^t粒被转化至根癌农杆菌中。转化的农杆菌在LB平;tSLh培养并且在28C维持72小时。一些集落在LB肉汤中培养24小时，然后通过PCR测试插入的EPSPS基因。所述确认的;Mt菌在50mLLB肉汤中培养24小时。以5000xg离心储菌10^4中，将沉淀悬浮与2mL1.0MCaCl2中。同时，按照类似于所述转化农杆菌的方法培养和提取野生型农杆菌。在50mL培养基中培养所ii^杆菌溶液(10jiL)，所述培养基含有lxM-9盐培养基(SIGMA)、20mM葡萄糖、2mMMgS04以及以下浓度的草甘膦0mM、0.25mM、0.5mM、0.75mM、1.0mM、1.5mM和2mM。在48小时后测定生长(以600nm的光密度表示)。结果示于表6和图7。表6.野生型农杆菌和转化的农杆菌在含有各种草甘膦浓度的M-9培养基中的生长。草甘膦野生型农杆菌转化的农杆菌inMOD600nm百分数OD600n迈百分数0.000.638990,641000.250.236370.632诉0.500邻50.80.1850.750.005(X80緒151,000-0040,80,02541,500.0040.8CK02442.000.0040-80.023本文描述的实施方案和实施例出于示例性目的，并非意在通过描述限制本发明的组合物和方法的全部范围。可以对某些实施方案、材料、组合物和方法进行得到MJy目似结果的等效修改、修饰和变动，而不背离本发明的范围。权利要求1.一种抗草甘膦的植物，所述植物包含非转基因的抗草甘膦的硬直黑麦草(Loliumrigidum)的种质。2.根据权利要求1的抗草甘膦的植物，所述植物包含SEQIDNO.2或其功能部分。3.根据权利要求2的抗草甘膦的植物，其中所述SEQIDNO.2或其功能部分为抗草甘膦的EPSPS蛋白。4.根据权利要求1的抗草甘膦的植物，所述植物包含SEQIDNO.1或其功能部分的核酸序列。5.根据权利要求4的抗草甘膦的植物，其中所述核酸序列编码抗草甘膦的EPSPS蛋白。6.根据权利要求l的抗草甘膦的植物，其中所述植物来自禾^"。7.根据权利要求6的抗草甘膦的植物，其中所述植物为草碎草。8.根据权利要求7的抗草甘膦的植物，其中所述草畔草选自于抗草甘膦的黑麦草、抗草甘膦的羊茅草以及它们的其组合和它们的杂交种。9.根据权利要求7的抗草甘膦的植物，其中所述草碎草存在于高尔夫球场、高尔夫辆长草、高尔夫絲发球台、草场、田径场、公园、校园、路旁、通过区、小径或草皮上。10.根据权利要求1的抗草甘膦的植物的种子。11.一种种子混合物，所述种子混合物包括根据权利要求10所述的种子。12.—种包含SEQIDNO.2或其功能部分的植物，其中所述SEQIDNO.2对所述植物来说不是天然存在的。13.根据权利要求12的植物，其中所述SEQIDNO.2或其功能部分为抗草甘膦的EPSPS蛋白。14.根据权利要求13的植物，其中所述抗草甘膦的EPSPS蛋白由SEQIDNO.1或其功能部分编码。15.根据权利要求12的植物，其中所述植物来自于禾本科。16.根据权利要求12的植物，其中所述植物为非转基因的。17.根据权利要求12的植物，其中所述植物为多年生草冲草。18.根据权利要求12的植物的种子。19.一种种子混合物，所述种子混合物包含根据权利要求18所述的种子。20.—种非转基因的抗草甘膦的草畔草，所述草坪草包含编码抗草甘膦的EPSPS酶的核酸分子。21.根据权利要求20的非转基因的抗草甘膦的草畔草，其中所述核酸分子包含SEQIDNO.l或其功能部分的序列。22.根据权利要求20的非转基因的抗草甘膦的草坪草，其中所述抗草甘膦的EPSPS酶包含SEQIDNO.2或其功能部分。23.根据权利要求20的非转基因的抗草甘膦的草坪草，其中所述草坪草选自于抗草甘膦的黑麦草、抗草甘膦的羊茅草、其组合以及其杂交种。24.根据权利要求20的非转基因的抗草甘膦的草畔草，其中所述草畔草为一种杂交种，所述杂交种包含来自于非转基因的抗草甘膦的硬直黑麦草的种质。25.根据权利要求20的非转基因的抗草甘膦的草坪草的种子。26.—种种子混合物，所述种子混合物包含根据权利要求25所述的种子。27.根据权利要求20的非转基因的抗草甘膦的草冲草的子代。28.根据权利要求20的非转基因的抗草甘膦的草碎草的营养枝或克隆。29.根据权利要求20的非转基因的抗草甘膦的草坪草，其中所述草畔草存在于高尔夫球场艰直、高尔夫长草、高尔夫球场发球台、草场、田径场、公园、校园、路旁、通过区、小径或草皮上。30.—种抗草甘膦的经济草，所述经济草包含编码抗草甘膦的EPSPS酶的核酸分子，其中所述核酸分子包含SEQIDNO.l或其功能部分的序列。31.根据权利要求30的抗草甘膦的经济草，其中所述抗草甘膦的经济草为非转基因的。32.根据权利要求30的抗草甘膦的经济草，其中所述抗草甘膦的EPSPS酶包含SEQIDN0.2或其功能部分。33.根据权利要求30的抗草甘膦的经济草，其中所述草选自于抗草甘膦的黑麦草、抗草甘膦的羊茅草、抗草甘膦的饲料草、抗草甘膦的小麦、其组合以及其杂交种。34.根据权利要求30的抗草甘膦的经济草，其中所述草为一种杂交种，所述杂交种包含来自于非转基因的抗草甘膦的硬直黑麦草的种质。35.根据权利要求30的抗草甘膦的经济草的种子。36.—种种子混合物，所述种子混合物包含根据权利要求35所述的种子。37.根据权利要求30的非转基因的抗草甘膦的经济草的子代。38.根据权利要求30的抗草甘膦的经济草的营养枝或克隆。39.根据权利要求30的抗草甘膦的经济草，其中所述草^草存在于高尔夫球场、高尔夫辆长草、高尔夫絲发球台、草场、田径场、公园、校园、路旁、通过区、小径或草皮上。40.—种抗草甘膦的基因，所述基因来自于在2007年1月23日作为Penner黑麦草保藏于美国典型培养物保藏中心(AmericanTypeCulturalCollection)的种质。41.根据权利要求40的基因，所錄因包含SEQ.IDNO.1或其功能部分。42.根据权利要求40的基因，所ii^因编码^^甘膦的EPSPS和^^甘膦的GRP中的至少一种。43.才艮据权利要求40的基因，所迷基因编码^1甘膦的EPSPS,所述EPSPS包含SEQIDN0.2或其功能部分。44.根据权利要求40的基因，所ii^因编码^^甘膦的GRP，通过以下方式鉴定所述,甘膦的GRP:对所述种质施以有除草剂效果剂量的草甘膦，然后用至少一种生物标记分析^f可存活的种质。45.—种DNA构建体，所述构建体包含根据权利要求40所述的至少一个基因。46.—种转化植物的方法，所述方法包含用根据权利要求45的DNA构建体转化植物。47.在2007年1月23日作为Penner黑麦草保藏于美国典型培絲保藏中心(AmericanTypeCulturalCollection)的种质。48.—种^甘膦的EPSPS，所述EPSPS是从根据权利要求47所述的种质获得的。49.一个基因，所i^因编码根据权利要求48的抗草甘膦的EPSPS。50.—种^甘膦的GRP蛋白，所述GRP蛋白是从才Mt权利要求47所述的种质获得的。51.—个基因，所逸基因编码才緣权利要求50的4^甘膦的GRP。52.—种获得种植田的方法，所述种植田基本上没有其敏感的杂草变种，所述方法包括提供一种包含非转基因的抗草甘膦的经济草的种植田，其中所述抗草甘膦的经济草不是通过遗传转化产生的；以及对所述草场施以有除草剂效果剂量的含有草甘膦的混合物。53.根据权利要求52的方法，其中所述提供包含种植能够长成所述抗草甘膦的经济草的种子。54.根据权利要求52的方法，其中所述抗草甘膦的经济草包含来自非转基因的抗草甘膦的硬直黑麦草的种质。55.根据权利要求52的方法，其中所述抗草甘膦的经济草包含在2007年1月23日作为Penner黑麦草保藏于美国典型培#^保藏中心(AmericanTypeCulturalCollection)的种质。56.根据权利要求52的方法，其中所述抗草甘膦的经济草为选自于以下的草坪草黑麦草、羊茅草、其组合以及其杂交种。57.根据权利要求52的方法，其中所述种植田为草场。58.根据权利要求57的方法，其中所述草场选自于高尔夫球场球道、高尔夫辆长草、高尔夫JW发球台、草场、田径场、公园、校园、路旁、通过区、小径或草皮。59.根据权利要求52的方法，其中所述抗草甘膦的经济草为小麦。60.根据权利要求52的方法，其中所述抗草甘膦的经济草包含一种核酸分子，所述核酸分子基本上与SEQIDNO.1或其功能部分相似。61.根据权利要求52的方法，其中所述抗草甘膦的经济草包含一种蛋白，所述蛋白基本上与SEQIDN0.2或其功能部分相似。62.根据权利要求52的方法，其中所述抗草甘膦的经济草是天然品种。63.根据权利要求52的方法，其中所述杂草变种选自于蒲公英、牛筋草、欧亚活学丹、三叶草、马唐、蓟、车前草、蓼、偃麦草、银莲花、高羊茅草、匍匐翦股颖、结缕草、铁线草、M雀稗、田旋花、黑苜蓿、栗米草、千根草、匍旬叫花子草、鼠麴草、铍叶酸模、雏菊、月见草、假蒲公英、牦牛儿苗、墨苜蓿、宝盖草、藜、锦葵、酢浆草、铜钱草、猪草、刺莴苣、马齿苋、絲、小酸模、芥菜、苦菜、婆婆纳、舰锦、美狗舌草、胡萝卜、野生天竺葵、野牵牛花、鸭蒜、堇菜、^C^、假高粱、莎草、百喜草、稗草、早熟禾、蒺蓉草，以及它们的组合。64.根据权利要求52的方法，其中所述种植田基本上没有杂草。65.根据权利要求52的方法，其中所述抗草甘膦的经济草为多年生抗草甘膦的草坪草。66.—种分离的核酸分子，所述核酸分子包含SEQIDN0.l或其功能部分的絲序列。67.—种包含多核苷酸片段的DNA构建体，所述多核苷酸片段具有SEQIDNO.1或其部分的M序列并且编码SEQIDNO.2，所述多核苷酸片^R净皮可操作地连接至表达调控元件上，所ii^达调控元件可以被宿主细胞用于驱动由所述多核苷酸片段编码的EPSPS多肽的表达。68.—种重组DNA分子，所述^包含与表达调控元件可操作地连接的编码EPSPS多肽的结构DNA片段，所述EPSPS多肽包含SEQIDNO.2或其功能部分的序列，所*达调控元件被宿主细胞用于驱动由所述结构DNA片段编码的EPSPS多肽或肽的表达。69.根据权利要求68的重组DNA分子，其中所ii^达调4tit件可以被植物细胞用于实现所述结构DNA序列表达。70.根据权利要求68的重组DNA衬，其中所錄达调控元件包括植物启动子，所述启动子与所述结构DNA序列^1异源的。71.才mt权利要求68的重组DNA分子，所述DNA分子还包^—段可^fMik^接于所述结构DM片段的DNA序列，所述DNA序列编码J^末端的叶绿体絲肽。72.—种产生抗草甘膦的植物的方法，所述方法包含在植物细胞的基因组中插入包含以下序列的重组DNA分子在植物细胞中有功能的启动子可^Mt地连接至编码具有SEQ.IDNO.2序列的EPSPS酶的结构DNA序列，可操作地连接至員物细胞中起到将多苷酸加到其转录的RNA序列3，端作用的3，非翻译区；以及^^斤述转化的植物细胞再生遗传转化的植物，所述植物与未转化的植物相比对除草剂草甘膦具有更高的抗性。73.根据权利要求73的方法，其中所述重组DM分子还包含一段可操作地连接于所述结构DNA序列的DNA序列，所述被连接的DNA序列编石4tJ^端的叶绿^^肽。全文摘要一种包含SEQIDNO.2或其功能部分的植物，其中SEQIDNO.2对所述植物来说不是天然存在的。一种抗草甘膦的经济草，其包含编码EPSPS酶的核酸分子。在某些实施方案中，所述核酸分子包含SEQIDNO.1或其功能部分的序列。在某些实施方案中，所述EPSPS酶可以是一种多肽分子，所述多肽分子包含基本上是SEQIDNO.2或其部分的氨基酸序列。实施方案包括含有SEQIDNO.1或其功能部分的DNA构建体，以及将所述DNA构建体插入植物中的转基因方法。某些实施方案包括非转基因的抗草甘膦的草坪草。文档编号C12N9/10GK101437843SQ200780009628公开日2009年5月20日申请日期2007年1月23日优先权日2006年1月23日发明者D·彭纳,M·西马玛塔申请人:密歇根州立大学评议会