抗草甘膦相关蛋白在调控生物草甘膦抗性中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物技术领域中抗草甘膦相关蛋白在调控生物草甘膦抗性中的应用。
【背景技术】
[0002] 除草剂的使用是农业丰收的保障，具有快速、高效、经济的优势。化学除草剂自问 世以来，品种越来越多，应用范围越来越广，目前几乎遍及各地的各类作物，然而，许多除草 剂在应用过程中都存在着一定的局限性，如某些除草剂杀草谱窄，防除杂草效果一般;还有 些除草剂安全性较差，毒性大，容易造成土壤、水体污染等;长残留除草剂的使用容易造成 后茬作物减产，甚至绝产，给农业生产带来巨大损失;抗性杂草产生速度加快，很少有除草 剂能够真正的做到高效低毒低残留，草甘膦在这些方面却表现的尤为出众，草甘膦与抗草 甘膦作物的搭配能够打破僵局，更加符合当前人们对环保和安全性的要求，所以转基因抗 草甘膦作物在全球种植面积不断扩大，草甘膦的生产和使用也将进一步增加。
[0003] 杂草的存在给农业生产和粮食产量带来损失，除草剂的开发与应用给人类带来了 福音。草甘膦是目前全球应用最为广泛的除草剂之一，其主要作用机理是竞争性抑制真菌、 细菌、藻类、高等植物、顶复门寄生虫体内莽草酸合成途径中的芳香族氨基酸(包括色氨酸、 酪氨酸、苯丙氨酸）生物合成过程中的关键酶5-烯醇式丙酮酸莽草酸-3-磷酸合成酶（5_ enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase，EPSPS，EC 2.5.1 · 19)的活性，扰乱莽草酸 合成途径，干扰蛋白质合成，阻止次生产物的形成，最终使植株死亡。
[0004] 草甘膦的唯一靶标酶为EPSP合成酶。自1969年Ahmed等在真菌体中芳香族氨基酸 的生物合成过程中首次发现EPSP合成酶之后，研究人员对EPSP合成酶的研究范围逐渐扩 大，不仅集中在对其酶活性及动力学方面的研究，对EPSP合成酶相对应的EPSPS基因的研究 也逐渐深入。EPSPS的过量表达可降低草甘膦的抑制作用，早在1983年，Rogers等为增强 ar〇A基因的表达，将其与质粒pBR322连接并转化大肠杆菌，其草甘膦抗性成功提高为原来 的8倍，而在进一步研究中发现，抗草甘膦生物中EPSP合酶含量比敏感型生物高很多，其抗 性来源于过量表达的EPSP合成酶;EPSP合酶对草甘膦的亲和力下降也会使生物产生草甘膦 抗性，自1983年美国孟山都公司在几种天然抗草甘膦的细菌（根农杆菌CP4、假单胞菌、 PG2982、无色杆菌LBAA等）中发现了对草甘膦不敏感的EPSP合成酶，由于其蛋白质产物对草 甘膦不敏感，从而获得草甘膦抗性资源，成功培育了抗草甘膦作物。至今，通过转化EPSPS基 因，创制出了抗草甘膦的大豆、玉米、油菜、甜菜、苜蓿、棉花等多种作物的抗性品系。然而除 EPSPS基因之外的其它与草甘膦抗性相关的基因的报道却极为少见。
【发明内容】
[0005] 本发明所要解决的技术问题是如何提高生物的草甘膦抗性。
[0006] 为解决上述技术问题，本发明首先提供了抗草甘膦相关蛋白在调控生物草甘膦抗 性中的应用。
[0007] 本发明所提供的抗草甘膦相关蛋白在调控生物草甘膦抗性中的应用;所述抗草甘 膦相关蛋白的名称为Mfs40,是如下A1)、A2)或A3):
[0008] Al)氨基酸序列为序列2的蛋白质；
[0009] A2)在序列2的氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸残 基得到的具有相同功能的由Al)衍生的蛋白质；
[0010] A3)在Al)或A2)的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质。
[0011]其中，序列2由344个氨基酸残基组成。
[0012 ]为了使Al)中的蛋白质便于纯化，可在序列表中序列1所示的蛋白质的氨基末端或 羧基末端连接上如表1所示的标签。
[0013] 表1、标签的序列
[0015] ~上述Al)中的Mf s40可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上 述Al)中的Mf s40的编码基因可通过将序列表中序列1所示的DNA序列中缺失一个或几个氨 基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5'端和/或3'端连 上表1所示的标签的编码序列得到。
[0016] 其中，序列1由1035个核苷酸组成，编码序列2所示的蛋白质。
[0017] 上述应用中，所述生物可为细菌、植物、真菌或藻类，如大肠杆菌。
[0018] 为解决上述技术问题，本发明还提供了与Mfs40相关的生物材料在调控生物草甘 膦抗性中的应用；
[0019] 所述生物材料，为下述BI)至B14)中的任一种：
[0020] BI)编码Mf s40的核酸分子；
[0021] B2)含有BI)所述核酸分子的表达盒；
[0022] B3)含有B1)所述核酸分子的重组载体；
[0023] B4)含有B2)所述表达盒的重组载体；
[0024] B5)含有Bl)所述核酸分子的重组微生物；
[0025] B6)含有B2)所述表达盒的重组微生物；
[0026] B7)含有B3)所述重组载体的重组微生物；
[0027] B8)含有M)所述重组载体的重组微生物；
[0028] B9)含有BI)所述核酸分子的转基因植物细胞系；
[0029] B10)含有B2)所述表达盒的转基因植物细胞系；
[0030] B11)含有BI)所述核酸分子的转基因植物组织；
[0031] B12)含有B2)所述表达盒的转基因植物组织；
[0032] B13)含有BI)所述核酸分子的转基因植物器官；
[0033] Bl 4)含有B2)所述表达盒的转基因植物器官。
[0034] 上述应用中，BI)所述核酸分子可为如下bl)、b2)或b3)的基因：
[0035] bl)核苷酸序列是序列表中序列1的cDNA分子或DNA分子；
[0036] b2)与bl)限定的核苷酸序列具有75%或75%以上同一性，且编码Mfs40的cDNA分 子或基因组DNA分子；
[0037] b3)在严格条件下与bl)限定的核苷酸序列杂交，且编码Mf s40的cDNA分子或基因 组DNA分子。
[0038] 其中，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA;所述核酸分子也可 以是RNA，如mRNA或hnRNA等。
[0039] 本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化和点突变的方 法，对本发明的编码Mfs40的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有与本发明分 离得到的Mfs40的核苷酸序列75%或者更高同一性的核苷酸，只要编码Mfs40且具有Mfs40 功能，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。
[0040] 这里使用的术语"同一性"指与天然核酸序列的序列相似性。"同一性"包括与本发 明的编码序列2的氨基酸序列组成的蛋白质的核苷酸序列具有75%或更高，或85%或更高， 或90%或更高，或95%或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或计算机软件进行 评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比（％)表示，其可以用来 评价相关序列之间的同一性。
[0041 ] 上述应用中，所述严格条件是在2 X SSC，0.1 % SDS的溶液中，在68°C下杂交并洗膜 2次，每次5min，又于0.5 X SSC，0.1 % SDS的溶液中，在68°C下杂交并洗膜2次，每次15min; 或，0.1 X SSPE(或0.1 X SSC)、0.1 %SDS的溶液中，65°C条件下杂交并洗膜。
[0042] 上述75%或75%以上同一性，可为80%、85%、90%或95%以上的同一性。
[0043] 上述应用中，B2)所述的含有编码Mfs40的核酸分子的表达盒(Mfs40基因表达盒）， 是指能够在宿主细胞中表达Mf s40的DNA，该DNA不但可包括启动Mf s40基因转录的启动子， 还可包括终止Mfs40基因转录的终止子。进一步，所述表达盒还可包括增强子序列。可用于 本发明的启动子包括但不限于：组成型启动子，组织、器官和发育特异的启动子，和诱导型 启动子。启动子的例子包括但不限于:花椰菜花叶病毒的组成型启动子35S:来自西红柿的 创伤诱导型启动子，亮氨酸氨基肽酶（〃LAP〃，Chao等人（1999)Plant Physiol 120 :979-992);来自烟草的化学诱导型启动子，发病机理相关I(PRl)(由水杨酸和BTH(苯并噻二唑-7-硫代羟酸S-甲酯)诱导）；西红柿蛋白酶抑制剂II启动子(PIN2)或LAP启动子(均可用茉莉 酮酸甲酯诱导）；热休克启动子(美国专利5,187,267);四环素诱导型启动子(美国专利5， 057,422);种子特异性启动子，如谷子种子特异性启动子?？128(0价010631398(中国专利 200710099169.7))，种子IC存蛋白质特异的启动子(例如，菜豆球蛋白、napin，oleosin和大 豆beta conglycin的启动子(Beachy等人（1985)EMB0 J.4:3047-3053))。它们可单独使用 或与其它的植物启动子结合使用。此处引用的所有参考文献均全文引用。合适的转录终止 子包括但不限于:农杆菌胭脂碱合成酶终止子(N0S终止子）、花椰菜花叶病毒CaMV 35S终止 子、tml终止子、豌豆rbcS E9终止子和胭脂氨酸和章鱼氨酸合酶终止子(参见，例如:Ode 11 等人（I985)Nature 313:810; Rosenberg等人（1987)Gene，56:125;Guerineau等人（1991) Mol .Gen.Genet，262:141;Proudfoot(1991)Cell ,64:671;Sanfacon等人Genes Dev·，5: 141 ;Mogen等人（1990)Plant Cell，2:1261 ;Munroe等人（1990)Gene ,91:151 ;Ballad等人 (1989)Nucleic Acids Res.l7:7891;Joshi等人（1987)Nucleic Acid Res. ,15:9627)。
[0044] 可用