microRNA 100的应用
【专利摘要】本发明公开了一种microRNA 100的应用。本发明公开抑制microRNA 100活性或表达的物质在制备抑制肿瘤发展的产品中的应用。本发明的实验证明，microRNA 100过表达可抑制大肠癌细胞的生长、增殖，但却能显著促进其垂直及水平迁移扩散能力，高度提示其在大肠癌发生发展中发挥重要功能，既能发挥抑癌基因的功能抑制肿瘤增殖、生长，又有促进肿瘤发展的功能促进肿瘤转移。
【专利说明】
microRNA 100 的应用
技术领域
[0001] 本发明涉及一种microRNA的应用；特别涉及microRNA 100的应用，属于生物技术 领域。
【背景技术】
[0002] micro RNAs (miRNAs)，是一种大小约21-23个碱基的单链小分子RNA，通过和靶基 因 mRNA碱基配对引导沉默复合体（RISC)降解mRNA或抑制mRNA的翻译，通常在转录后水 平调控蛋白表达（最近发现micro RNA也能在转录水平调控基因表达）。随着对micro RNA 研究的不断深入，越来越多的证据表明micro RNA分子在肿瘤发生发展的各个环节中发挥 着原癌基因或抑癌基因的作用。
[0003] MiR-100(microRNA100, GenBank number:NR_029515. 1，mir 编号：MI0000102)定 位于11号染色体，与miR-99a、miR-99b同属于miR-99家族。
【发明内容】
[0004] 本发明所要解决的技术问题是提供预防和/或治疗大肠癌的一种microRNA。
[0005] 为了解决以上技术问题，本发明提供一种抑制microRNA 100活性或表达的物质 在制备抑制肿瘤发展的产品中的应用；
[0006] 所述 microRNA 100 的序列如 SEQ ID No. 1 所不。
[0007] 为了解决以上技术问题，本发明还提供如下1)-7)任一所述的物质在制备具有促 进肿瘤发展功能的产品中的应用：
[0008] 1)microRNA 100 ；
[0009] 2)microRNA 100 的编码基因；
[0010] 3)含有microRNA 100的编码基因的重组载体；
[0011] 4)含有microRNA 100的编码基因的表达盒；
[0012] 5)含有microRNA 100的编码基因的转基因细胞系；
[0013] 6)含有microRNA 100的编码基因的重组菌；
[0014] 7)含有microRNA 100的编码基因的重组病毒；
[0015] 所述 microRNA 100 的序列如 SEQ ID No. 1 所不。
[0016] 为了解决以上技术问题，本发明还提供如下1)-7)任一所述的物质作为靶点在筛 选和/或制备具有抑制肿瘤发展功能的产品中的应用：
[0017] 1)microRNA 100 ；
[0018] 2)microRNA 100 的编码基因；
[0019] 3)含有microRNA 100的编码基因的重组载体；
[0020] 4)含有microRNA 100的编码基因的表达盒；
[0021] 5)含有microRNA 100的编码基因的转基因细胞系；
[0022] 6)含有microRNA 100的编码基因的重组菌；
[0023] 7)含有microRNA 100的编码基因的重组病毒；
[0024] 所述 microRNA 100 的序列如 SEQ ID No. 1 所不。
[0025] 上述任一所述的应用中，所述肿瘤发展体现为肿瘤细胞迁移和/或扩散；
[0026] 所述肿瘤细胞迁移和/或扩散具体可为A和/或B :
[0027] A、肿瘤细胞的水平迁移和/或扩散；
[0028] B、肿瘤细胞的垂直迁移和/或扩散。
[0029] 为了解决以上技术问题，本发明还提供如下1)_7)任一所述的物质在制备抑制肿 瘤细胞的生长和/或增殖的产品中的应用：
[0030] 1)microRNA 100 ；
[0031] 2)microRNA 100 的编码基因；
[0032] 3)含有microRNA 100的编码基因的重组载体；
[0033] 4)含有microRNA 100的编码基因的表达盒；
[0034] 5)含有microRNA 100的编码基因的转基因细胞系；
[0035] 6)含有microRNA 100的编码基因的重组菌；
[0036] 7)含有microRNA 100的编码基因的重组病毒；
[0037] 所述 microRNA 100 的序列如 SEQ ID No. 1 所不。
[0038] 上述任一所述的应用中，所述肿瘤为大肠癌；
[0039] 所述大肠癌的癌细胞可为HCT-8细胞。
[0040] 本发明的实验证明，microRNA 100过表达后抑制大肠癌细胞的生长和/增殖，但 可显著增强其迁移能力，在大肠癌转移过程中起重要作用。microRNA 100在大肠癌的预防 和/或治疗领域具有重要应用。
【附图说明】
[0041] 图1为胞系和HCT-8 (NC)细胞系的荧光显微镜观察结果。
[0042] 图2为细胞生长曲线。
[0043] 图3为microRNA 100对HCT-8细胞迁移能力的影响。
[0044] 图4为microRNA 100对HCT-8划痕愈合能力的影响。
【具体实施方式】
[0045] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0046] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0047] 大肠癌细胞系HCT-8为ATCC产品，产品目录号为CCL-244。
[0048] GFP-MIR-100慢病毒表达系统为上海吉凯基因化学技术有限公司产品，货号为 PMUL209000102,其中外源基因为 microRNA 100 (GenBank 号为 NR_029515. 1，序列如 SEQ ID No. 1所示），该慢病毒表达系统为能表达microRNA 100的慢病毒颗粒。
[0049] NC慢病毒表达系统（即为空载的GV209-EGFP)为上海吉凯基因化学技术有限公司 产品，其与GFP-MIR-100慢病毒表达系统的区别仅在于没有外源基因 microRNA 100。
[0050] 实施例1、稳定高表达microRNA 100的转移性大肠癌细胞系的获得
[0051] 一、大肠癌细胞系的获得
[0052] (一彡将大肠癌细胞系此了^在含有体积百分含量⑴"的胎牛血清丨办"^^) 和体积百分含量1%的青链霉素溶液（Invitrogen，货号10378-016)的RPMI-1640培养基 (Invitrogen，11875-093)中，37°C，5% C02的细胞培养箱中培养，根据细胞生长情况，每天 或者隔天更换新鲜培养基，在细胞浓度约为培养瓶培养面积80% -90%时进行传代。
[0053] (二）倒掉培养基，加入37°C PBS轻轻洗涤细胞，吸出PBS，加入胰蛋白酶（25cm2 培养瓶加500微升胰酶，75cm2培养瓶和10cm直径培养皿加入1毫升胰酶），在显微镜下观 察消化过程，直至HCT-8细胞变圆、细胞间连接断开。
[0054] (三）加入十倍于胰蛋白酶体积的PBS，用一次性吸管将HCT-8细胞轻轻吹打，制 成HCT-8细胞悬液。
[0055] (四）收集HCT-8细胞悬液于离心管中，离心（1000转/分钟，5分钟）。
[0056](五）用新鲜培养基（含有体积百分含量10%的胎牛血清（Hyclone)和体积百分 含量1%的青链霉素溶液（Invitrogen，货号10378-016)的RPMI-1640培养基）重悬细胞， 取1/2移入新的培养瓶或培养皿进行培养，得到传代后的HCT-8细胞。
[0057] 二、细胞转染
[0058] 将GFP-MIR-100慢病毒表达系统进行细胞转染：
[0059](一）分别将生长良好的步骤一得到的传代后HCT-8细胞按照每孔lOOul，每孔共 5*103个HCT-8细胞的量于转染前一天接种到96孔板中（正常培养，37°C，5 % C0 2培养箱）， 转染时细胞密度约30%。
[0060] (二）每孔中弃去原培养液，加入 90ul ENI. S (Enhanced Infection Solution， 促转染溶液，上海吉凯基因化学技术有限公司产品，产品目录号为REVG0002)、10ul po 1 ybrene (聚凝胺，上海吉凯基因化学技术有限公司产品，产品目录号为REVG0001)及lu 1 慢病毒试剂（GFP-MIR-100慢病毒表达系统，l*10sU/mL)，温和混匀。
[0061] (三）37°C培养12小时后，换正常培养基（含有体积百分含量10%的胎牛血清 (Hyclone)和体积百分含量1%的青链霉素溶液（Invitrogen产品，货号为10378-016)的 RPMI-1640培养基）终止转染。
[0062] (四）37°C培养72小时后，得到HCT_8hlg、胞系。
[0063] 采用上述同样的方法将NC慢病毒表达系统转染HCT-8细胞，得到HCT-8 (NC)细胞 系。
[0064] 三、检测细胞中microRNA 100的表达
[0065] ( 一）突光显微镜观察
[0066] 将胞系和HCT-8 (NC)细胞系分别置于倒置荧光显微镜下，检测其表达 microRNA 100情况，结果如图1所示。
[0067] 图 1 中，miR-100 为胞系，NC 为 HCT-8 (NC)。
[0068] 图1表明，胞系有绿色荧光反应，表明其稳定高表达microRNA 100。
[0069] 通过流式细胞仪计数得到HCT_8hlgh细胞系的转染率高达81. 1 %。
[0070] (二）qRT-PCR 检测
[0071] 提取HCT-8hlgh细胞系的总RNA，并反转录为cDNA，以cDNA为模板，利用QIAGEN miScript SYBR Green PCR Kit(QIAGEN 产品，货号为 218075)及 microRNA 100 引物 (QIAGEN产品，货号为MS00003386)，进行RT-PCR，以RNU6B为内参（其引物为QIAGEN产 品，货号为 MS00033740);
[0072] 以未转染病毒的HCT-8细胞和HCT-8 (NC)细胞系进行上述实验，作为对照。
[0073] 以 HCT-8 (NC)的 microRNA 100 的相对表达率为 1，RT-PCR 结果表明，HCT-8hlg、 胞系的microRNA 100的相对表达率为50，microRNA 100在胞系中稳定过表达。
[0074] 实施例2、HCT-8hlgh细胞系稳定高表达microRNA 100的功能研究
[0075] 一、细胞生长和/或增殖实验
[0076] (一）取转染24小时、生长状态良好的实施例1得到的HCT_8hlgh细胞系，消化，制 成细胞悬液，调整细胞浓度为4 X 104个/mL。将细胞悬液接种在96孔板中，每孔100ul，细 胞总数一致（4000个/孔），作为实验孔，并设置空白对照（即每孔同样体积的含有体积百 分含量10%的胎牛血清（办〇1〇116)和体积百分含量1%的青链霉素溶液（111￥；[1：1'(^611，货号 10378-016)的RPMI-1640培养基）。将96孔板置37°C，5% C02培养箱中孵育4-6小时待 细胞全部贴壁。
[0077] (二）每孔加入 10ul 的 5mg/ml MTT 溶液。
[0078] (三）正常培养条件（37°C，5% C02培养箱）下培养3小时。
[0079] (四）吸弃上清，每孔加入50ul DMS0,水平振动15分钟后，用酶标仪测量每孔 490nm波长下的0D490值。
[0080] (五）再取转染后2、3、4、5天的生长状态良好的实施例1得到的HCT-8hlgh细胞系 进行上述实验，按照上述方法测得转染后2、3、4、5天的0D490值。
[0081] (六）以转染后天数为横轴，每次测定的实验孔的0D490值减去空白对照的0D490 值为纵轴，制成细胞生长曲线。
[0082] HCT-8(NC)细胞系进行上述实验制成细胞生长曲线。
[0083] 实验重复三次，结果取平均值。
[0084] 结果如图2所示。
[0085] 图 2 中，HCT-8 (mir-100)代表 胞系。
[0086] 图2表明，转染后第一天，HCT-8hlglPHCT-8(NC)的0D值相当，从第二天起HCT-8 hlghK 0D值小于HCT-8(NC)，第三天起两组细胞间差异显著，由此表明，microRNA 100过表 达后能抑制HCT-8细胞的生长和/或增殖。
[0087] 二、细胞迁移实验
[0088] ( 一）将Transwell小室（Corning公司产品）用无血清RPMI IMO培养基 (Invitrogen，货号为31800-022)平衡至少一个小时或过夜，有助于细胞更好贴附和生长。
[0089] (二）实验前一天，将由实施例1得到的HCT_8hlgh细胞在无血清RPMI 1640培养 基中饥饿过夜培养。
[0090] (三）将Transewll放入24孔板，在Transewll下室中加入600ul含有体积百分 含量10%胎牛血清（Hyclone)的RPMI 1640培养基作为趋化因子。
[0091] (四）取步骤（二）的细胞消化后进行活细胞计数，用无血清RPMI 1640培养基调 整细胞浓度为5X 105个/mL，制成HCT-8 ^#细胞悬液。再在步骤（三）的每个Transwell 小室中加入l〇〇ul该悬液，设三个平行样本，置于孵箱中培养。
[0092] (五）24小时后吸去上室液体，用PBS湿润棉签擦去膜上面未穿过聚碳酸酯膜上小 孔的细胞，生理盐水漂洗，稍干。
[0093](六）0· 6mL甲醇固定20分钟后，0· 6mL0. 5%结晶紫溶液（甲醇配置）染色10分 钟，流水冲洗3-5次，晾干。
[0094](七）用小刀片将聚碳酸酯膜小心切下，置膜于载玻片上，膜底面朝上，滴树脂后 用盖玻片封片，显微镜下随机计数5个视野的细胞数，求和，进行统计学检验，实验重复三 次，结果取平均值。
[0095] 以HCT-8 (NC)细胞系进行上述实验作为阴性对照。
[0096] 结果如图3所示。
[0097] 图3中，A为显微镜检测结果图，B为迁移细胞数统计结果。NC代表HCT-8 (NC)， mir-100 代表 HCT-8hlgh。
[0098] 图3中A表明，细胞迁移24小时后，与HCT-8 (NC)相比，有更多胞迁移 到Transwell小室的另一侧。
[0099] 图3中B表明，HCT-8hlgh组的迁移细胞数为150, HCT-8(NC)组的迁移细胞数为 78，HCT-8hlg%i大约为HCT-8 (NC)组的2倍，而步骤（一）结果表明microRNAlOO过表达后 抑制HCT-8细胞增殖，因此，此处迁移实验中HCT-8 hlgh组增加的细胞为迁移的细胞，这说明 microRNA 100能够促进细胞的垂直迁移能力。
[0100] 三、划痕愈合实验
[0101] ( -）实验前一天，先在未接种细胞的24孔培养板背面用marker笔画横线标 记，将胞消化、计数，每孔取3X 10 5个细胞均匀种于24孔板中，作多个平行， 在含有体积百分含量10%的胎牛血清（Hyclone)和体积百分含量1 %的青链霉素溶液 (Invitrogen，货号为10378-016)的RPMI-1640培养基中，37°C培养箱培养。
[0102] (二）选择贴壁均匀且细胞密度达到90%以上的孔进行实验，利用20ul白色枪头 垂直于孔板轻轻在细胞上划过一道直线制造细胞划痕，尽量保证各个划痕宽度一致。
[0103] (三）吸去上清培养液，用PBS轻轻冲洗孔板三次，洗去划痕产生的细胞。
[0104] (四）加入含体积百分含量2%胎牛血清（Hyclone)的RPMI-1640培养基，选择有 marker笔标记的地方进行拍照。
[0105] (五）培养16小时后，再次选择相同地方进行拍照，比较两次拍照时细胞划痕的宽 度观察划痕愈合情况，至少3个平行。
[0106] 以HCT_8(NC)细胞系进行上述实验作为阴性对照。
[0107] 结果如图4所示。
[0108] 图 4 中，NC 代表 HCT-8 (NC)，mir-100 代表 HCT-8hlgh。
[0109] 图4中，A为划痕愈合实验镜下照相结果，B图为划痕实验统计结果图。
[0110] 图4中A表明，HCT-8细胞划痕后经相同时间，HCT-8hlgh的划痕愈合能力优于 HCT-8(NC)。
[0111] 图4中B表明，HCT-8hlghm平均迁移愈合距离为180um，HCT-8(NC)的平均迁移愈 合距离为125um，HCT-8 hlgh的平均迁移愈合距离大约为HCT-8(NC)的平均迁移愈合距离1. 5 倍，这说明microRNA 100能够促进HCT-8细胞的水平迁移扩散。
[0112] 上述实验证实，microRNA 100过表达可抑制大肠癌细胞的生长、增殖，但却能显著 促进其垂直及水平迁移扩散能力，高度提示其在大肠癌发生发展中发挥重要功能，既能发 挥抑癌基因的功能抑制肿瘤增殖、生长，又有促进肿瘤发展的功能促进其转移。
【主权项】
1. 抑制microRNA 100活性或表达的物质在制备抑制肿瘤发展的产品中的应用。2. 如下1)-7)任一所述的物质在制备具有促进肿瘤发展功能的产品中的应用： 1. microRNA 100 ； 2. microRNA 100的编码基因； 3) 含有microRNA 100的编码基因的重组载体； 4) 含有microRNA 100的编码基因的表达盒； 5) 含有microRNA 100的编码基因的转基因细胞系； 6) 含有microRNA 100的编码基因的重组菌； 7) 含有microRNA 100的编码基因的重组病毒。3. 如下1)-7)任一所述的物质作为靶点在筛选和/或制备具有抑制肿瘤发展功能的产 品中的应用： 1. microRNA 100 ； 2. microRNA 100的编码基因； 3) 含有microRNA 100的编码基因的重组载体； 4) 含有microRNA 100的编码基因的表达盒； 5) 含有microRNA 100的编码基因的转基因细胞系； 6) 含有microRNA 100的编码基因的重组菌； 7) 含有microRNA 100的编码基因的重组病毒。4. 根据权利要求1-3任一所述的应用，其特征在于：所述肿瘤发展体现为肿瘤细胞迁 移和/或扩散。5. 如下1)-7)任一所述的物质在制备抑制肿瘤细胞的生长和/或增殖的产品中的应 用： 1. microRNA 100 ； 2. microRNA 100的编码基因； 3) 含有microRNA 100的编码基因的重组载体； 4) 含有microRNA 100的编码基因的表达盒； 5) 含有microRNA 100的编码基因的转基因细胞系； 6) 含有microRNA 100的编码基因的重组菌； 7) 含有microRNA 100的编码基因的重组病毒。6. 根据权利要求1-5任一所述的应用，其特征在于：所述肿瘤为大肠癌。
【文档编号】C12N5/10GK105985953SQ201510039846
【公开日】2016年10月5日
【申请日】2015年1月27日
【发明人】马洁, 袁伟, 张善信, 徐昌青, 唐万燕
【申请人】中国医学科学院肿瘤医院