mRNA片段化方法及基于其构建测序文库的方法

mRNA片段化方法及基于其构建测序文库的方法
【专利摘要】本发明涉及一种mRNA片段化方法，以及基于该mRNA片段化方法构建测序文库的方法。本发明的mRNA片段化方法采用正、反向桥式探针，通过一步反转录及连接反应即可实现对mRNA样本的打断，且在反转录时同时引入两端接头，得到两端带有接头的cDNA文库。所得两端带接头的cDNA文库，可直接进行环化反应，也可先通过PCR扩增，再进行环化反应，从而得到单链环状核酸的测序文库，也可直接通过PCR扩增从而得到双链核酸的测序文库。本发明的mRNA片段化方法用于构建测序文库时，省去了传统方法建库中末端修复、先加一端接头、再加另一端接头的繁琐步骤，极大地简化了实验流程，缩短了建库周期，也大大降低了建库成本。
【专利说明】
mRNA片段化方法及基于其构建测序文库的方法
技术领域
[0001] 本发明涉及分子生物学技术领域，尤其涉及一种使mRNA样本片段化的方法，以及 基于该mRNA片段化方法构建测序文库的方法，以及所构建测序文库在高通量测序中的应 用。
【背景技术】
[0002] 新一代测序技术又称高通量测序技术，其主要特点是测序通量高，测序时间 短和测序成本低。RNA-seq又称转录组测序技术，即用高通量测序技术把mRNA、小 RNA(smallRNA)、非编码RNA(noncodingRNA)等或把其中的某些RNA的序列测出来，以检测 它们的表达水平。
[0003] 通常，在构建RNA测序文库时，需要首先纯化mRNA，然后把纯化得到的RNA样本片 段化，最后在待测序列片段的两端加测序接头。目前加接头的方法有很多种，可以在mRNA 水平或在cDNA水平上通过连接法加接头，也可以在反转录时通过随机引物引入接头。加接 头的方法不同，建库流程的繁琐程度及建库成本也将大有差异。
[0004] 为解决现有的RNA测序文库构建中存在的接头连接步骤过多，整体文库构建时间 长等问题，特提出了本发明。

【发明内容】

[0005] 本发明的目的在于提出一种mRNA样本的片段化方法，以及基于该mRNA片段化方 法构建RNA测序文库的方法。本发明的mRNA片段化方法在适当比例和投入量的正、反向 桥式探针的存在下，通过一步反转录及连接反应即可实现对mRNA样本的打断，不需要对样 本进行另外的物理性打断，且在反转录时同时引入两端接头，得到带有两端接头的cDNA文 库，省去了传统方法建库中末端修复、先加一端接头、再加另一端接头的繁琐步骤。基于上 述mRNA片段化方法所得到的两端带接头的cDNA文库，可直接进行环化反应，得到单链环状 核酸的测序文库，实现PCR-free (无需PCR扩增）的测序文库构建；也可先通过PCR扩增上 述cDNA文库，再进行环化反应，得到单链环状核酸的测序文库。
[0006] 为达此目的，本发明采用以下技术方案：
[0007] 第一方面，本发明提供了一种使mRNA样本片段化的方法，其包括：
[0008] (1)以所述mRNA样本为模板，以下述正向桥式探针和反向桥式探针的混合物为引 物，在逆转录酶的作用下进行逆转录反应；
[0009] 所述反向桥式探针的3'端区域含双链DNA接头1，其5'端游离且为由4-9个碱基 组成的随机序列，该随机序列在逆转录反应过程中与mRNA模板随机结合，但不延伸；
[0010] 所述正向桥式探针的5'端区域含双链DNA接头2,其3'端游离且为由4-9个碱基 组成的随机序列，该随机序列在逆转录反应过程中与mRNA模板随机结合，并在逆转录酶的 作用下向3'端延伸，直至所述反向桥式探针结合处；
[0011] (2)在连接酶的作用下，使正向桥式探针经延伸的3'端与反向桥式探针的5'端进 行连接反应，形成两端分别带双链DNA接头1、2的cDNA片段。
[0012] 上述mRNA样本片段化方法中，作为优选，步骤（1)中，所述mRNA样本为经纯化的 mRNA样本；
[0013] 优选地，所述mRNA样本的纯化方法包括如下步骤：
[0014] 0- )采用特异性针对rRNA的寡核苷酸探针，使其与总RNA中的rRNA进行杂交， 形成DNA:rRNA杂交体；
[0015] (2'）使用RNaseH消化步骤（Γ )所得DNA:rRNA杂交体中的rRNA ;
[0016] (3'）使用DNaseI消化步骤（2'）所得产物中的DNA寡核苷酸探针。
[0017] 上述mRNA样本纯化方法中，优选地，所述寡核苷酸探针是至少10个50nt的短片 段的等分子量的混合物，其序列与18S、25S rRNA、28SrRNA、12S mtrRNA、16S mtrRNA和5.8S RNA互补，此外还包括3种针对血液样品中的球蛋白RNA的寡核苷酸探针，可以更好地去除 血液中的球蛋白RNA，得到高纯度的原始转录本RNA。
[0018] 上述mRNA纯化方法，采用寡核苷酸探针与rRNA杂交以去除rRNA、富集mRNA，与传 统的〇lig〇-dT磁珠法相比，避免了富集到的mRNA具有3'偏向性，使富集到的mRNA更均 一；并且，对样本的质量要求也没那么苛刻，即使样本有轻度的降解，也可以用于后续的测 序，获得较好的测序数据。此外，上述纯化mRNA的方法不仅可以富集到带有polyA的mRNA, 还可以富集不完整的mRNA及不带polyA的mRNA,甚至可以富集ncRNA、snoRNA等感兴趣而 oligo-dT磁珠法难以富集的RNA。该mRNA纯化方法，与oligo-dT磁珠法相比，测序数据有 更好的随机性、基因覆盖度、QPCR相关性及基因表达量相关性。
[0019] 上述mRNA样本片段化方法中，作为优选，所述反向桥式探针或正向桥式探针中的 随机序列由6个或9个碱基组成；
[0020] 优选地，所述反向桥式探针的3'端区域包括标签序列；
[0021] 优选地，所述正向桥式探针与反向桥式探针的加入量之比为10:1~1:20,优选为 1:2。
[0022] 最终的cDNA片段文库中，cDNA片段的大小取决于相邻两个正、反桥式探针的距 离，而这取决于正、反向桥式探针的加入量及加入比例。
[0023] 作为优选，上述mRNA样本片段化方法还包括以下步骤：
[0024] (3)用RNase酶处理步骤（2)所得产物，以去除mRNA模板，并对其进行变性处理， 形成两端分别带接头序列的单链DNA片段；
[0025] 优选地，所述RNase酶为RNaseA和/或RNaseH ;
[0026] 优选地，采用碱变性法或高温变性法进行变性处理。
[0027] 第二方面，本发明提供了一种RNA测序文库的构建方法，其包括：
[0028] (1)采用第一方面所述的mRNA样本片段化方法，对mRNA样本进行片段化处理，获 得两端分别带接头序列的单链DNA片段；
[0029] (2)将步骤⑴所得单链DNA片段进行环化，形成单链环状核酸产物，即为测序文 库；
[0030] 优选地，利用介导片段实现所述核酸单链的环化，所述介导片段具有相应互补序 列用于连接核酸单链的两端；
[0031] 优选地，还包括在核酸单链环化完成后，消化线性单链的步骤。
[0032] 上述RNA测序文库的构建方法中，作为优选，所述反向桥式探针由下述两条核苷 酸链组成：
[0033] a) 5' -N^NNNNN-SEQ ID NO: Ι-χχχχχχχχχχ-SEQ ID N0:2~3> 所示核苷酸链，其中， N表示A、C、G或T任一种；*表示硫代修饰；χχχχχχχχχχ表示标签序列；
[0034] b)SEQ ID Ν0:3所示核苷酸链；
[0035] 优选地，所述正向桥式探针由下述两条核苷酸链组成：
[0036] a'）5' -SEQ ID NO: 4~NNNNNN~3?所示核苷酸链，其中，N 表示 A、C、G 或 T 任一种； 和
[0037] b'）SEQ ID Ν0:5 所示核苷酸链。
[0038] SEQ ID NO: 1 序列（从 5,到 3,）为：AAGTCGGAGGCCAA ;
[0039] SEQ ID N0:2 序列（从 5' 到 3'）为：GCGGTCTTAGGAAGACAAGCTC ;
[0040] SEQ ID N0:3 序列为：5, -TTGGCCTCCGACTT-3,；
[0041] SEQ ID N0:4 序列（从 5' 到 3'）为：
[0042] GACTCACTGAGATCGGGCTTCGACTGGAGAC ；
[0043] SEQ ID N0:5 序列为：
[0044] 5' -GTCTCCAGTCGAAGCCCGATCTCAGTGAGTC-3'。
[0045] 本方面所述RNA测序文库的构建方法包括：
[0046] 取3~5ug总RNA样品，使用探针法去除总RNA中的rRNA以富集mRNA。用正反桥式 探针随机杂交到mRNA上，并与溶液I混匀反应，得到带有两端接头、片段大小合适的cDNA， 文库插入片段的大小取决于相邻两个正反桥式探针的距离，即可以通过调整两端接头的比 例及接头和模板的比例，得到不同大小的cDNA文库。通过桥式寡核苷酸和T4DNA连接酶将 cDNA单链环化，用酶消化没有环化的片段。用磁珠纯化环状文库，最后使用高通量测序平台 测序。与一般的测序相比，它不需要对文库进行PCR扩增，因此避免了由PCR扩增引入的碱 基错误和复制偏差，使测序数据更真实可信。但是PCR-free方案需要更多的总RNA的投入 量来提高cDNA的产量。
[0047] 第三方面，本发明提供了另一种构建RNA测序文库的方法，其包括：
[0048] (1)采用第一方面所述的mRNA样本片段化方法，对mRNA样本进行片段化处理，获 得两端分别带接头序列的单链DNA片段；
[0049] (2) PCR 扩增：
[0050] 第一轮：使用针对一端接头序列设计的引物，对步骤（1)所得单链DNA片段进行扩 增，得到其互补链；
[0051] 第二轮开始：使用分别针对两端接头序列设计的引物，对步骤（1)所得单链DNA片 段和第一轮扩增得到的其互补链进行PCR扩增；
[0052] (3)对步骤（2)所得PCR产物进行高温变性处理，获得单链核酸；
[0053] (4)利用介导片段，将步骤（3)所得单链核酸进行环化，形成单链环状核酸产物， 即为测序文库；所述介导片段具有相应互补序列用于连接核酸单链的两端；
[0054] 优选地，还包括在核酸单链环化完成后，消化线性单链的步骤。
[0055] 上述RNA测序文库的构建方法中，作为优选，所述反向桥式探针由下述两条核苷 酸链组成：
[0056] i)5' -+G+G+GHHNNNN-SEQ ID NO:6-xxxxxxxxxx~SEQ ID N0:7~3> 所示核苷酸链， 其中，N表示A、C、G或T任一种，Η表示A、Τ或C任一种；xxxxxxxxxx表示标签序列；+表 示LNA修饰；
[0057] ii)如SEQ ID N0:8所示核苷酸链；
[0058] 优选地，所述正向桥式探针由下述两条核苷酸链组成：
[0059] i'）5' -SEQ ID NO: 9-+G+G+GNNN-3?所示核苷酸链，其中，N 表示 A、C、G 或 T 任一 种；+表示LNA修饰，用于提高引物与模板结合的紧密度，阻止链置换；
[0060] ii'）如SEQ ID N0:10所示核苷酸链。
[0061] SEQ ID N0:6(从 5' 到 3'）序列为：GTCTCCAGTCGAAGCCCGA ;
[0062] SEQ ID NO:7 (从 5' 到 3'）序列为：TCGAGCTTGTCTTCCTAAGACOT*T ;
[0063] SEQ ID N0:8 序列为：5, -TCGGGCTTCGACTGGAGAC-3,；
[0064] SEQ ID N0:9(从 5' 到 3'）序列为：GCTTGGCCTCCGACTT ;
[0065] SEQIDN0:10序列为：5'-AAGTCGGAGGCCAAGC-3，。
[0066] 上述第二方面或第三方面的构建方法构建的均为单链环状RNA测序文库，然而本 发明所述的mRNA样本片段化方法也可用于普通双链文库的构建，只需要把接头序列改成 相应的测序平台的接头序列即可，因此，本发明还要求保护如下第四方面所述的技术方案。 [0067] 第四方面，本发明提供了一种RNA测序文库的构建方法，其包括：
[0068] (1)采用第一方面所述的mRNA样本片段化方法，对mRNA样本进行片段化处理，获 得两端分别带接头序列的单链DNA片段；
[0069] (2) PCR 扩增：
[0070] 第一轮：使用针对一端接头序列设计的引物，对步骤（1)所得单链DNA片段进行扩 增，得到其互补链；
[0071] 第二轮开始：使用分别针对两端接头序列设计的引物，对步骤（1)所得单链DNA片 段和第一轮扩增得到的其互补链进行PCR扩增，所得扩增产物即为测序文库；
[0072] 优选地，所述接头序列为相应测序平台的接头序列。
[0073] 第五方面，本发明提供了一种RNA测序文库，其由第二方面、第三方面或第四方面 所述构建方法制得。
[0074] 第六方面，本发明提供了如第五方面所述的RNA测序文库在高通量测序中的应 用。
[0075] 本发明基于正、反向桥式探针对mRNA样本进行打断，而不需要对RNA进行另外的 物理性打断，并且在同一管中建立反转录和连接反应体系，通过一步反转录和连接反应就 能同时引入两端接头，得到带有两端接头的cDNA文库；从mRNA到单链环化或PCR扩增之前 只需要一步即可完成，省去了传统方法建库中末端修复、先加一端接头、再加另一端接头的 繁琐步骤。
[0076] 反转录后有两种建库方案：（l)PCR-free的建库：不需要对cDNA进行PCR扩增， 直接进行环化反应，实现了 PCR-free的建库技术，流程见图2 ;由于无需对文库进行PCR 扩增，一方面避免了由于PCR引入的复制偏差和复制时的碱基错误，提高了数据的真实可 靠性，另一方面也简化了建库流程，缩短了建库周期，同时还可以在反转录时引入标签序列 (实施例中称为barcode)，在环化时可以实现多样本同时环化，大大降低了建库成本，可自 动化，易操作，可以用于大批量建库。（2)PCR扩增建库：由于在反转录时引入两端接头及 任选地标签序列（实施例中称为barcode)，只需要一步反转录就能得到带两端接头的单链 cDNA文库，再经PCR扩增以富集带有两端接头的cDNA，省去了第二链合成的步骤，简化了实 验流程，流程见图2。由于反转录时标签序列（即barcode)的引入，在PCR扩增时可以实现 多样本同时PCR，降低建库成本。PCR扩增的方法可以减少总RNA的投入量，使少量的RNA 样本也可以实现建库。
【附图说明】
[0077] 图1是本发明所采用的富集mRNA的方法示意图；
[0078] 图2是本发明的RNA测序文库构建流程图；
[0079] 图3是PCR-free RNA测序文库的尿素变性胶检测结果；
[0080] 图4是UHRR样品PCR产物分布；
[0081] 图5是HBRR样品PCR产物分布；
[0082] 图6是小鼠 RNA样品PCR产物分布；
[0083] 图7是YH RNA样品PCR产物分布；
[0084] 图8是8个样本混合文库片段分布。
【具体实施方式】
[0085] 下面结合附图并通过【具体实施方式】来进一步说明本发明的技术方案。
[0086] 样品来源：人细胞RNA(UHRR)、人脑参考RNA(HBRR)、人血液细胞系（YH)RNA与小鼠 RNA，共4种RNA标准品，每个标准品做2个平行。
[0087] 寡核苷酸探针序列：参考专利申请"富集原始转录本信息的RNA文库的建库方法 及其应用"（申请号：2014105057932)中披露的探针序列。
[0088] 实施例1无需PCR扩增（PCR free)的RNA测序f库构律
[0089] 1、纯化 mRNA
[0090] (1) DNA探针与总RNA中的rRNA杂交
[0091]
[0092] 反应条件：95°C 2min，0· 1°C / 秒（梯度降温），22°C，5min.
[0093] (2) RNaseH消化与DNA探针杂交的rRNA
[0094]

[0095] 反应条件：37°C 3〇min
[0096] (3) DNaseI 消化 DNA 探针
[0099] 反应条件：37? 30min
[0100] (4)反应结束后，用1. 2XRNA Clean XP磁珠纯化。
[0101] 2、逆转录和连接反应
[0102] 下述3T、5T及分别与之互补的序列3B、5B订购于invitrogen。
[0103] 3T序列如下：
[0104] 5 ' -N*NNNNNAAGTCGGAGGCCAAxxxxxxxxxxGCGGTCTTAGGAAGACAAGCTC-3 ' ；此处下划 线部分为SEQ ID N0:1，斜体部分为SEQ ID N0:2 ;
[0105] 3B序列如下：
[0106] 5, -TTGGCCTCCGACTT-3，（SEQ ID N0:3);
[0107] 5T序列如下：
[0108] 5 ' -GACTCACTGAGATCGGGCTTCGACTGGAGACNNNNNN-3 '；此处下划线部分为 SEQ ID NO:4 ；
[0109] 5B序列如下：
[0110] 5'-GTCTCCAGTCGAAGCCCGATCTCAGTGAGTC-3'（SEQ ID N0:5)。
[0111] 注：N表示A、C、G或T ;xxxxxxxxxx表示标签序列；*表示硫代修饰，作用是防止外 切酶消化。
[0112] 具体地，适用于各样品的标签序列如下：
[0113] 标签序列-25:AGCCCCAGGG(SEQIDN0:14，适用的样品名及编号 ：UHRR-l);
[0114] 标签序列-26:CACTTGAAAC(SEQIDN0:15，适用的样品名及编号 ：UHRR-2);
[0115] 标签序列-27:CCAACCCAGA(SEQIDN0:16，适用的样品名及编号 ：HRR-l);
[0116] 标签序列-28:TTAGAGCTCC(SEQIDN0:17，适用的样品名及编号：HRR-2) ;
[0117] 标签序列-29:TTTCATCACA(SEQIDN0:18，适用的样品名及编号：YH-l) ;
[0118] 标签序列-30:TTAGGGGCTA(SEQIDN0:19，适用的样品名及编号：YH-2) ;
[0119] 标签序列-31:AATTTGTATT(SEQIDN0:20，适用的样品名及编号：M0USE-l) ;
[0120] 标签序列-32:GTGTTAACTA(SEQIDN0:21，适用的样品名及编号 ：M0USE-2)。
[0121] 将序列31\51\38、58均稀释到10(^1，然后按如下比例分别配制成4(^14(^3'、 AdA5'接头。

[0129] 向 5 μ 1 已纯化的 mRNA 中加 0· 6 μ 1 10 μ M AdA mix (接头），25°C孵育 5min ;加溶 液 Ι:4μ1 第一链缓冲液，2μ1 0.1MDTT，0.3yl lOmM (1ΝΤΡ，4μ1 50%PEG8000,0.5yl 10mM ΑΤΡ，0· 5 μ 1 Super Script II (200U/ μ 1)，0· 5 μ 1 T4DNA 连接酶（600u/ μ 1)，0· 5 μ 1 RNase抑制剂，补水至总体积20 μ 1，混匀，在PCR仪上按照以下程序进行反应：
[0130] 步骤 1 25°C 5min
[0131] 步骤 2 37°C lh
[0132] 步骤3 12 °C保持
[0133] 反应结束后，向以上反应体积中加2μ 1 RNaseA、2y 1 RNaseH，37°C 30min~lh， 95°C变性5min，立即置于冰上2min.
[0134] 3、纯化：用1. OX Ampure XP磁珠纯化，用EB或纯水回溶。
[0135] 取1 μ 1样品用HS Qubit定量。按照测定的浓度调整下一步反应使用的样本起始 量（不超过400ng)，使用ddH20将总体积补为60 μ 1。
[0136] 4、取60μ 1上述步骤的DNA(200~400ng)到PCR管中，95°C变性5min，立即置于 冰上2min。
[0137] 5、单链环化
[0138] 5. 1提前5分钟左右准备引物反应混合液，配制如下：
[0139]
[0140] 其中，0N1587 为介导引物，其具体序列为：5'-TCGAGCTTGTCTTCCTAAGACCGC-3'（即 SEQ ID N0:11)〇
[0141] 5. 2将上述混合液震荡充分混匀
[0142] 5. 3提前5分钟准备连接酶反应混合液，配制如下：
[0143]
[0144] 5. 4将连接酶反应混合液震荡充分混匀，离心后，向已经加入引物反应混合液的 EP管中加入连接酶反应混合液50 μ 1，震荡10s混匀，离心。
[0145] 5· 5置于孵育箱中37°C孵育1. 5h。
[0146] 6.酶切消化（Exol 和 ΕχοΙΙΙ)
[0147] 6. 1提前5分钟左右准备引物反应混合液，配制如下：
[0148]
[0149] 6. 2将上述混合液震荡充分混匀，离心后，向上一步得到的120 μ 1的样品中分别 加入8 μ 1的酶反应混合液；
[0150] 6. 3震荡10s混匀离心，置于孵育箱中37°C孵育30min。
[0151] 6. 4酶切30min完成后，向样品中加入6 μ 1 500mM EDTA终止酶反应。
[0152] 6. 5上述样品用1. 3X PEG32beads/tween20纯化，方法如下：
[0153] 将上步骤样品转移到1. 5ml不粘管中，加入170μ 1的PEG32磁珠/tween20(预先 室温平衡30min)，室温结合15min，期间吹打混匀一次；
[0154] 6. 6将不粘管置于磁力架上3-5min后弃去上清，用700 μ 1 75%乙醇洗涤两次，洗 涤时将不粘管前后方向反转，使得磁珠在乙醇中游动，每次洗涤游动2-3次；
[0155] 6. 7室温下晾干后用40 μ 1 1ΧΤΕ回溶，溶解时间共计15min，中间混匀一次；
[0156] 6. 8把上清转移到一个新的1. 5ml EP管中，将最终得到产物用Qubit?ssDNA Assay Kit测定浓度。
[0157] 6. 9 取 5 μ 1 样品至 PCR 管中与 5 μ 1 2x RNA loading buffer 混匀，同时取 2 μ 1 low Range RNA ladder到PCR管，将样品与ladder置于PCR仪中95°C变性2min，迅速转移 至冰上冷却2min，再进行6%的尿素变性胶检测。在此列举样品UHRR-1的结果，如图3所 /_J、1 〇
[0158] 实施例2需要PCR扩增的RNA测序f库构律
[0159] 1.纯化 mRNA
[0160] (1) DNA探针与总RNA杂交
[0161]
[0162] 反应条件：95°C 2min，0· 1°C /sec (梯度降温），22°C，3min〇
[0163] (2) RNaseH消化与DNA探针杂交的rRNA
[0164]
[0165] 反应条件：37°C 30min
[0166] (3) DNaseI 消化 DNA 探针
[0167]
[0168] 反应条件：37? 30min
[0169] (4)反应结束后，用L 2Χ RNA Clean ΧΡ磁珠纯化
[0170] 2、逆转录和连接反应
[0171] LNA修饰的接头序列3Τ、5Τ及分别与之互补的序列3Β、5Β :探针订购于 invitrogen。
[0172] 3T序列如下：
[0173] 5' -+G+G+GHHNNNNGTCTCCAGTCGAAGCCCGAxxxxxxxxxxTCGAGCTTGTCTTCCTAAGACC*T *T_3';其中，N表示A、C、G或T任一种；*表示硫代修饰；+表示LNA修饰，xxxxxxxxxx表示 标签序列；此处的下划线部分为SEQID N0:6,斜体部分为SEQ ID N0:7。
[0174] 具体地，适用于各样品的标签序列如下：
[0175] 标签序列-l:TGTCATAAAT(SEQIDN0:22，适用的样品名 ：UHRR-l);
[0176] 标签序列-2:TTAATTAAGG(SEQIDN0:23，适用的样品名 ：UHRR-2);
[0177] 标签序列-3:GACTCACTGA(SEQIDN0:24，适用的样品名 ：HBRR-l);
[0178] 标签序列-4:ATAAGGCAGT(SEQIDN0:25，适用的样品名 ：HBRR-2);
[0179] 标签序列-5:TTGATAGATT(SEQIDN0:26，适用的样品名 ：YH-l);
[0180] 标签序列-6:CCTTCCTGGT(SEQIDN0:27，适用的样品名 ：YH-2);
[0181] 标签序列-7:AATATCTCTC(SEQIDN0:28，适用的样品名 ：mouse-2);
[0182] 标签序列-8:CATGTTTCCC(SEQIDN0:29，适用的样品名：mouse-2)。
[0183] 3B序列如下：
[0184] 5, -TCGGGCTTCGACTGGAGAC-3，（SEQ ID N0:8);
[0185] 5T序列如下：
[0186] 5' -GCTTGGCCTCCGACTT+G+G+GNNN-3' ：其中，Ν 表示 A、C、G 或 Τ 仵一种;+表示 LNA 修饰；此处的下划线部分为SEQ ID N0:9。
[0187] 5B序列如下：
[0188] 5'-AAGTCGGAGGCCAAGC-3'（SEQ ID N0:10)。
[0189] 将序列3T、5T、3B和5B均稀释到100 μ M，然后按如下比例分别配制成 40yMAdA3'、AdA5' 接头。

[0197] 向 5 μ 1 已纯化的 mRNA 中加 0· 6 μ 1 10 μ M AdA mix (接头），25°C 僻育 5min ;加 溶液 Ι:4μ1 第一链缓冲液，2μ1 0.1MDTT，lyl lOmM (1ΝΤΡ，4μ1 50%PEG8000,0.5yl 10mM ΑΤΡ，0·5μ1 Superscript II (20〇υ/μ1)，0·5μ1 Τ4连接酶（600ιι/μ1)，0·5μ1 RNase抑制剂，补水至总体积20 μ 1，混匀，在PCR仪上按照以下程序进行反应：
[0198] 步骤 1 25 °C 5min
[0199] 步骤 2 37 °C lh
[0200] 步骤3 12°C 保持
[0201] 反应结束后，向以上反应体积中加1 μ 1 RNaseA、l μ 1 RNaseH，37°C 30min~lh， 95°C变性5min，立即置于冰上2min。
[0202] 3、纯化：用Ampure XP磁珠纯化，Elution Buffer或纯水回溶。
[0203] 4、PCR扩增及纯化
[0204] 向反转录得到的 18. 6 μ 1 cDNA 中加 2· 5 μ 1 lOxPfx 缓冲液，1 μ 1 10mM dNTP， ΙμL 50mM MgS04,0. 5μ1 20 μ M PI, 1 μ 1 10 μ Μ Ρ2,0.4μ1 Platinum Pfx DNA polymerase聚合酶，总体积25 μ 1。
[0205] 其中，Ρ1和Ρ2为用于PCR扩增的两条引物的代号，其序列分别为：
[0206] P1 (即 SEQ ID N0:12) :5, -TCCTAAGACCGCTTGGCCTCCGACT-3,；
[0207] P2(即 SEQ ID N0:13) :5, -AAGGTCTTAGGAAGACAAGCTCGA-3，。
[0208] 反应程序设置如下：
[0209]
[0211] 其中，步骤2~4, 13个循环
[0212] 纯化方法：首先加0. 7X Ampure XP磁珠结合PCR产物，然后上清液再用0. 5X Ampure XP磁珠结合，用Elution Buffer或纯水回溶。回收产物中，每个平行样品随机选取 一个使用高敏芯片Agilent 2100检测，其结果如图4-7所示。
[0213] 取1 μ 1样品用HS Qubit测定浓度。按照测定的浓度调整下一步反应使用的样本 起始量不超过400ng，使用ddH20将总体积补为60 μ 1。
[0214] 5、取60μ 1上述步骤的DNA(200~400ng)到PCR管中，95°C变性5min，立即置于 冰上2min。
[0215] 6、单链环化
[0216] 6. 1提前5分钟左右准备引物反应混合液，配制如下：
[0217]
[0218] 其中，0N1587 为介导引物，其具体序列为：5'-TCGAGCTTGTCTTCCTAAGACCGC-3'（即 SEQ ID N0:11)〇
[0219] 6. 2将上述混合液震荡充分混匀
[0220] 6. 3提前5分钟准备连接酶反应混合液，配制如下：
[0223] 6. 4将连接酶反应混合液震荡充分混匀，离心后，向已经加入引物反应混合液的 EP管中加入连接酶反应混合液50 μ 1，震荡10s混匀，旋转离心。
[0224] 6. 5置于孵育箱中37°C孵育1. 5h。
[0225] 7.酶切消化（ΕχοΙ 和 Exo III)
[0226] 7. 1提前5分钟左右准备引物反应混合液，配制如下：
[0227]
[0228] 7. 2将上述混合液震荡充分混匀，离心后，向上一步得到的120 μ 1的样品中分别 加入8 μ 1的酶反应混合液；
[0229] 7. 3震荡10s混匀离心，置于孵育箱中37°C孵育30min。
[0230] 7. 4酶切30min完成后，向样品中加入6 μ 1 500mM EDTA终止酶反应。
[0231] 7. 5上述样品用1. 3X PEG32磁珠/tween20纯化，方法如下：
[0232] 将上步骤样品转移到1. 5ml不粘管中，加入170 μ 1的PEG32磁珠/tween20 (预先 室温平衡30min)，室温结合15min，期间吹打混匀一次；
[0233] 7. 6将不粘管置于磁力架上3_5min后弃去上清，用700 μ 1 75%乙醇洗涤两次，洗 涤时将不粘管前后方向反转，使得磁珠在乙醇中游动，每次洗涤游动2-3次；
[0234] 7. 7室温下晾干后用40 μ 1 1ΧΤΕ回溶，溶解时间共计15min，中间混匀一次；
[0235] 7. 8把上清转移到一个新的1. 5ml EP管中，将最终得到产物用Qubit?ssDNA Assay Kit测定浓度。
[0236] 7. 9取5 μ 1最终产物至PCR管中与5 μ 1 2x RNA loading buffer混匀，同时取 2μ1 low Range RNA ladder到PCR管，将最终产物与ladder置于PCR仪中95°C变性2min， 迅速转移至冰上冷却2min，再进行6%的尿素变性胶检测。
[0237] 7. 10每个最终产物各取lul充分混合后，使用高敏芯片Agilent 2100检测，其结 果如图8所示。
[0238] 对于不同样品建库，各个样品的PCR产物均集中在180~220bp左右，片段比较集 中。环化后的文库，片段大小集中在212nt左右，有很好地重复性和实验稳定性。
[0239] 由上述结果可以看出，本发明所述RNA测序文库的构建方法重复性好，稳定性高。
[0240]
【申请人】声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细工艺流程，但本发明并 不局限于上述详细工艺流程，即不意味着本发明必须依赖上述详细工艺流程才能实施。所 属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换 及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
【主权项】
1. 一种使mRNA样本片段化的方法，其包括： (1) 以所述mRNA样本为模板，以下述正向桥式探针和反向桥式探针的混合物为引物， 在逆转录酶的作用下进行逆转录反应； 所述反向桥式探针的3'端区域含双链DNA接头1，其5'端游离且为由4-9个碱基组成 的随机序列，该随机序列在逆转录反应过程中与mRNA模板随机结合，但不延伸； 所述正向桥式探针的5'端区域含双链DNA接头2,其3'端游离且为由4-9个碱基组成 的随机序列，该随机序列在逆转录反应过程中与mRNA模板随机结合，并在逆转录酶的作用 下向3'端延伸，直至所述反向桥式探针结合处； (2) 在连接酶的作用下，使正向桥式探针经延伸的3'端与反向桥式探针的5'端进行连 接反应，形成两端分别带双链DNA接头1、2的cDNA片段。2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（1)中，所述mRNA样本为经纯化的 mRNA样本； 优选地，所述mRNA样本的纯化步骤包括： 0- )采用特异性针对rRNA的寡核苷酸探针，使其与总RNA中的rRNA进行杂交，形成 DNA:rRNA杂交体； (2'）使用RNaseH消化步骤（Γ )所得DNA:rRNA杂交体中的rRNA ; (3'）使用DNasel消化步骤（2'）所得产物中的DNA寡核苷酸探针。3. 根据权利要求1或2所述方法，其特征在于，所述反向桥式探针或正向桥式探针中的 随机序列由6个或9个碱基组成； 优选地，所述反向桥式探针的3'端区域包括标签序列； 优选地，所述正向桥式探针与反向桥式探针的加入量之比为10:1~1:20,优选为1:2。4. 根据权利要求1-3任一项所述的方法，其特征在于，还包括： (3) 用RNase酶处理步骤（2)所得产物，以去除mRNA模板，并对其进行变性处理，形成 两端分别带接头序列的单链DNA片段； 优选地，所述RNase酶为RNaseA和/或RNaseH ; 优选地，采用碱变性法或高温变性法进行变性处理。5. -种RNA测序文库的构建方法，其特征在于，包括： (1) 采用权利要求1-4任一项所述方法，对mRNA样本进行片段化处理，获得两端分别带 接头序列的单链DNA片段； (2) 将步骤（1)所得单链DNA片段进行环化，形成单链环状核酸产物，即为测序文库； 优选地，利用介导片段实现所述核酸单链的环化，所述介导片段具有相应互补序列用 于连接核酸单链的两端； 优选地，还包括在核酸单链环化完成后，消化线性单链的步骤。6. 根据权利要求5所述的构建方法，其特征在于，所述反向桥式探针由下述两条核苷 酸链组成： a) 5' -N^NNNNN-SEQ ID NO: Ι-χχχχχχχχχχ-SEQ ID N0:2~3> 所示核苷酸链，其中，N 表 示A、C、G或T任一种；*表示硫代修饰；χχχχχχχχχχ表示标签序列；和 b) SEQ ID Ν0:3所示核苷酸链； 优选地，所述正向桥式探针由下述两条链组成： a'）5' -SEQ ID NO: 4~NNNNNN~3?所示核苷酸链，其中，N表示A、C、G或T任一种；和 b'）SEQ ID NO :5所示核苷酸链。7. -种RNA测序文库的构建方法，其特征在于，包括： (1) 采用权利要求1-4任一项所述方法，对mRNA样本进行片段化处理，获得两端分别带 接头序列的单链DNA片段； (2) PCR 扩增： 第一轮：使用针对一端接头序列设计的引物，对步骤（1)所得单链DNA片段进行扩增， 得到其互补链； 第二轮开始：使用分别针对两端接头序列设计的引物，对步骤（1)所得单链DNA片段和 第一轮扩增得到的其互补链进行PCR扩增； (3) 对步骤（2)所得PCR扩增产物进行高温变性处理，获得单链核酸； (4) 利用介导片段，将步骤（3)所得单链核酸进行环化，形成单链环状核酸产物，即为 测序文库；所述介导片段具有相应互补序列用于连接核酸单链的两端； 优选地，还包括在核酸单链环化完成后，消化线性单链的步骤。8. 根据权利要求7所述的构建方法，其特征在于，所述反向桥式探针由下述两条核苷 酸链组成： i) 5' -+G+G+GHHNNNN-SEQ ID NO: 6-xxxxxxxxxx~SEQ ID N0:7~3> 所示核苷酸链,其中， N表示A、C、G或T任一种，Η表示A、Τ或C任一种；xxxxxxxxxx表示标签序列；+表示LNA 修饰； ii) 如SEQ ID NO:8所示序列的核苷酸链； 优选地，所述正向桥式探针由下述两条核苷酸链组成： i'）5' -SEQ ID N0:9-+G+G+GNNN~3> 所示核苷酸链，其中，N 表示 A、C、G 或 T 任一种，+ 表示LNA修饰； ii'）如SEQIDN0:10所示核苷酸链。9. 一种RNA测序文库的构建方法，其特征在于，包括： (1) 采用权利要求1-4任一项所述方法，对mRNA样本进行片段化处理，获得两端分别带 接头序列的单链DNA片段； (2) PCR 扩增： 第一轮：使用针对一端接头序列设计的引物，对步骤（1)所得单链DNA片段进行扩增， 得到其互补链； 第二轮开始：使用分别针对两端接头序列设计的引物，对步骤（1)所得单链DNA片段和 第一轮扩增得到的其互补链进行PCR扩增，所得扩增产物即为测序文库； 优选地，所述接头序列为相应测序平台的接头序列。10. -种RNA测序文库，其特征在于，由权利要求5-9任一项所述构建方法制得。11. 如权利要求10所述的RNA测序文库在高通量测序中的应用。
【文档编号】C12Q1/68GK105985945SQ201510049847
【公开日】2016年10月5日
【申请日】2015年1月30日
【发明人】王虹荔, 祝珍珍, 耿春雨, 章文蔚, 蒋慧, 李计广
【申请人】深圳华大基因研究院