一种黄嘌呤脱氢酶截断体及其应用
【专利摘要】本发明公开了一种黄嘌呤脱氢酶截断体及其应用。本发明公开蛋白，包括黄嘌呤脱氢酶截断体小亚基、黄嘌呤脱氢酶截断体中亚基和黄嘌呤脱氢酶截断体大亚基。本发明提供黄嘌呤脱氢酶截断体，其比野生型对底物(黄嘌呤)的亲和力提高19％，转化数提高115％，催化效率提高166％，耐温性提高11℃，有利于与其他酶类联用进一步开发新的应用领域，尤其适合于样品检测，包括黄嘌呤和次黄嘌呤的检测，与PNP酶联用检测无机磷酸，与PNP、XOD和POD酶联用检测腺苷脱氨酶，和5`-核苷酸酶的检测，同时适合于工业化应用，有利于提高酶催化效率、降低成本，更加有利于工业应用过程。
【专利说明】
一种黄嘌昤脱氢酶截断体及其应用
技术领域
[0001] 本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种黄嘌呤脱氢酶截断体及其应用。
【背景技术】
[0002] 黄噪呤氧化还原酶（Xanthine oxidoreductase，简称X0R)是一种包含铁硫簇、 钼蝶呤辅基的黄素蛋白类氧化还原酶，它具有黄噪呤氧化酶（Xanthine oxidase,简称 XOD，EC 1. 17. 3. 2)和黄嘌呤脱氢酶（Xanthine dehydrogenase，简称 XDH，EC1. 17. 1. 4) 两种不同的存在形式。X0R不仅能够利用天然存在的诸如氧气、NAD、硝酸盐等物质作为 电子受体，同时也可以利用诸如PMS和亚甲基蓝等人工合成染料作为电子受体，催化氧 化包括嘌呤、蝶啶和醛类等多种杂环分子的sp2杂化的碳原子（李丽书，陈献华，邵叶 波，刘璇，徐平，《黄嘌呤氧化还原酶的结构、功能和作用》。因此，X0R具有重要的商业 应用价值，被用于生产黄嘌呤氧化酶抗体和检测黄嘌呤/次黄嘌呤和酶联法检测无机 磷等的临床诊断试剂盒，以及酶法生物合成病毒唑等核苷类药物和降解有机污染物等 (Agarwal, A. , A. Banerjee, and U. C. Banerjee, Xanthine oxidoreductase: a journey from purine metabolism to cardiovascular excitation-contraction coupling. Crit Rev Biotechnol，2011. 31 (3) : 264-80。孟疆辉，陈蔚梅，利用黄嘌呤氧化酶提高病毒唑转化 率.武汉大学学报（自然科学版）.1999. 45 (6) : 838-840)。
[0003] XDH是生物体内X0R基因转录翻译的直接产物，是X0R在体内的主要存在状 态。X0D是由前体蛋白XDH经过巯基氧化可逆转变或者通过部分酶解断裂不可逆转变 而来，X0D可以利用分子0 2作为电子受体，但失去了 XDH所具有的利用NAD作为电子 受体的會泛力(NishinoTomoko, OkamotoKen, Kawaguchi Yuko, HoriHiroyuki, Matsumura Tomohiro, Eger Bryan T.,Pai,Emi1 F. , Nishino,Takeshi. Mechanism of the conversion of xanthine dehydrogenase to xanthine oxidase:identification of the two cysteine disulfide bonds and crystal structure of a non-convertible rat liver xanthine dehydrogenase mutant.The Journal of biological chemist ry，2005, 280(26) :24888-94)。在临床诊断中，由于溶液中溶解氧含量受到温度、压力、盐分 和有机物含量等因素影响，X0D在运用于样品检测时，样品中溶解氧量会对样品测定结果造 成影响。同样地，在规模化应用X0D酶法催化或含X0D酶全细胞生物转化生成核苷类药物 以及降解杂化类有机污染物质过程中，溶解氧的含量也会对催化转化过程造成影响。XDH不 受溶解氧气的影响，可以更好地满足这些特定应用需求。然而，目前市场上广泛提供的X0R 是X0D，主要提取自牛奶奶油等动物源材料和野生藤黄节杆菌等野生微生物，如Sigma公司 提供的牛奶X0D，日本Τ0Υ0Β0公司提供的细菌X0D。
[0004] 研究表明，XDH主要有两种：一种是以牛奶XDH为代表的真核XDH，由单一多肽链构 成（α )2同源二聚体；另一种为荚膜红细菌XDH为代表的细菌XDH，由（α β ) 2形态存在的异 源四聚体。作为转录翻译的直接产物，牛奶XDH可以在体内或者体外，经过胰蛋白酶和糜蛋 白酶等蛋白酶的部分酶解或者氧化形成二硫键而转化成为X0D。牛奶X0D利用分子氧作为 电子受体，其催化氧化黄嘌呤等底物的活性是牛奶XDH利用NAD作为电子受体催化氧化反 应活性的10倍。而荚膜红细菌XDH是一种纯粹的XDH，经过胰蛋白酶的部分酶解并不能转变 形成XOD，同时这种经过酶解断裂形成的截断体XDH的酶学性质没有得到改善。而荚膜红细 菌XDH催化活性比牛奶XOD催化氧化黄嘌呤等底物能力至少高5倍（LeimkilhlerSilke，Ho dsonRachael, George Graham N, Rajagopalan K. V. Recombinant Rhodobacter capsulatus xanthine dehydrogenase,a useful model system for the characterization of protein variants leading to xanthinuria I in humans. Journal of Biological Chem istry，2003, 278(23) :20802-20811)。除高的催化活性外，已有的研究还比表明微生物来源 的XDH具有比真核XDH更高的温度耐受性，更加适合于商业化应用。然而，迄今为止除了牛 和鸡来源XDH可以商业途径获取，比如美国MyBioSource公司提供的牛XDH，但是价格昂贵 且产量非常有限，尚未见到商品化微生物来源XDH。开发高催化活性和高稳定性的微生物 XDH是一项具有重要应用前景的工作。
[0005] 前期研究获取了 一种新的荚膜红细菌XDH及其编码基因，公开在申请号为 201410764840. 5的专利申请中，该荚膜红细菌XDH是迄今为止报道的催化活性最高的XDH 之一，具有宽泛的温度和pH作用范围，展示了优良的潜在应用价值，是进一步开发催化效 率和温度耐受性提高的新型酶的良好出发材料。
【发明内容】
[0006] 本发明的一个目的是提供一种黄嘌呤脱氢酶截断体。
[0007] 本发明提供的一种蛋白，为黄嘌呤脱氢酶截断体Splitl78,其由亚基甲、亚基乙和 亚基丙3个亚基组成：
[0008] 所述亚基甲的氨基酸序列为序列表中序列4或将序列表中序列4所示的氨基酸序 列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加的序列；
[0009] 所述亚基乙的氨基酸序列为序列表中序列5或将序列表中序列5所示的氨基酸序 列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加的序列；
[0010] 所述亚基丙的氨基酸序列为序列表中序列6或将序列表中序列6所示的氨基酸序 列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加的序列。
[0011] 上述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加为不超过10个氨基酸 残基的取代和/或缺失和/或添加。
[0012] 编码上述蛋白的DNA分子也是本发明保护的范围。
[0013] 上述DNA分子包括所述亚基甲的编码DNA分子、所述亚基乙的编码DNA分子和所 述亚基丙的编码DNA分子。
[0014] 所述亚基甲的编码DNA分子的核苷酸序列为序列表中序列3第22位至第558位；
[0015] 所述亚基乙的编码DNA分子的核苷酸序列为序列表中序列3第573位至第1430 位；
[0016] 所述亚基丙的编码DNA分子的核苷酸序列为序列表中序列3第1427位至第3760 位。
[0017] 上述DNA分子为如下中1)-4)中至少一种：
[0018] 1)编码区为序列表中序列3第22位至第3760位核苷酸所示的DNA分子；
[0019] 2)编码区为序列表中序列3的核苷酸所示的DNA分子；
[0020] 3)在严格条件下与1)或2)限定的DNA分子杂交且编码权利要求1或2所述蛋白 的DNA分子；
[0021] 4)与1)或2)限定的DNA分子具有90%以上的同一性且编码权利要求1或2所 述蛋白的DNA分子。
[0022] 上述严格条件可为在6 X SSC，0. 5% SDS的溶液中，在65°C下杂交，然后用2 X SSC， 0· 1 % SDS 和 1 X SSC，0· 1 % SDS 各洗膜一次。
[0023] 含有上述DNA分子的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌也是本发明保护 的范围。
[0024] 所述转基因细胞系不包括动物和植物的繁殖材料。
[0025] 上述重组载体将序列表中序列3所示的DNA分子替换pTrc99A质粒Ncol和 Hindlll酶识别位点间DNA片段得到的重组质粒，命名为pTRS178,即为产荚膜红细菌黄嘌 呤脱氢酶截断体的重组质粒，表达黄嘌呤脱氢酶截断体。
[0026] 上述的蛋白在作为黄嘌呤脱氢酶中的应用也是本发明保护的范围。
[0027] 上述DNA分子或上述重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌在制备黄嘌呤脱 氢酶中的应用也是本发明保护的范围。
[0028] 上述的蛋白或上述DNA分子或上述重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌在 制备具有黄嘌呤脱氢酶活性的产品中的应用也是本发明保护的范围；
[0029] 或上述的蛋白或上述DNA分子或权利要求5所述重组载体、表达盒、转基因细胞系 或重组菌在降解黄嘌呤或次黄嘌呤中的应用也是本发明保护的范围。
[0030] 上述应用中，所述黄嘌呤脱氢酶具有如下1)_3)中至少一种特性：
[0031] 1)所述黄嘌呤脱氢酶的亚基构型为（α β 丫）2型；
[0032] 2)所述黄嘌呤脱氢酶的最适反应温度为40°C ;
[0033] 3)所述黄噪呤脱氢酶的最适pH值为8. 5。
[0034] 本发明的另一个目的是提供一种制备黄嘌呤脱氢酶的方法。
[0035] 本发明提供的方法，包括如下步骤：诱导表达上述的重组菌，得到权利要求1所述 蛋白。
[0036] 本发明提供的黄嘌呤脱氢酶截断体为由大小为18. 9kDa、序列如序列4所示的小 亚基和大小为30. 3kDa、序列如序列5所不的中亚基和大小为83. 2kDa、序列如序列6所不 的大亚基组成，该黄嘌呤脱氢酶截断体最适pH为8. 5, pH4. 5-10. 5范围内稳定，最适温度为 40°C，25-60°C范围内稳定，半失活温度为63. 2°C，对黄嘌呤的KJ直为55±3 μ M，转化数为 200. 08±4· 29s \最大比活力可达90. 14土 L 93U/mg蛋白，催化效率为3. 64s \ μΜ ^
[0037] 本发明的实验证明，本发明发现黄嘌呤脱氢酶截断体，其与野生型黄嘌呤脱氢酶 相比，亚基构型由（α 0)2改变成为（α β γ) 2;本发明提供的黄嘌呤脱氢酶截断体对底物 (黄嘌呤）的亲和力提高19%，转化数提高115%，催化效率提高166%。
[0038] 本发明提供的荚膜红细菌黄嘌呤脱氢酶截断体为首次报道的在XDH小亚基中选 择型断裂铁硫簇和FAD结构域，这与已经报道的黄嘌呤脱氢酶及商品化黄嘌呤氧化酶有显 著不同。另外，本发明提供的黄嘌呤脱氢酶截断体生产方法，从体内源头分段合成各亚基， 避免了体外蛋白酶的有限酶解过程，可以简化生产工艺，有利于降低生产成本。
[0039] 本发明提供的荚膜红细菌黄嘌呤脱氢酶断裂体保留了野生型酶的不依赖于分子 氧（黄嘌呤脱氢酶利用NAD作为电子受体，不管是否存在氧气均可以发生反应）、宽泛的pH 作用范围和耐受性、和宽泛的温度作用范围的特性，有利于与其他酶类联用进一步开发新 的应用领域，尤其适合于样品检测，包括黄嘌呤和次黄嘌呤的检测，与PNP酶联用检测无机 磷酸，与PNP、X0D和P0D酶联用检测腺苷脱氨酶，和5'-核苷酸酶的检测，同时适合于工业 化应用，包括降解病毒唑等核苷类药物生产过程中产生的次黄嘌呤等副产物和降解嘌呤、 蝶啶和醛类等多种含sp2杂化的碳原子的杂环分子类有机污染物等商业化应用的需求。并 可以将本发明提供的黄嘌呤脱氢酶的应用领域拓展至其它催化底物，例如其它嘌呤、蝶啶、 杂环分子和醛类在内的多种底物的氧化反应，和亚甲基蓝、苯醌、高铁氰化物和硝酸盐等多 种类型的电子受体，进一步将该黄嘌呤脱氢酶应用于生物传感器领域。黄嘌呤脱氢酶截断 体提高的催化活性和温度耐受性，有利于减少酶的使用量、降低成本，更加有利于工业应用 过程。
【附图说明】
[0040] 图1为野生型荚膜红细菌黄嘌呤脱氢酶的计算结构与牛奶黄嘌呤脱氢酶晶体结 构的结构比对图。
[0041] 图2为纯化的黄嘌呤脱氢酶截断体Splitl78与野生型的natvie-PAGE(A)和 SDS-PAGE 电泳图（B)。
[0042] 图3为纯化的黄嘌呤脱氢酶截断体Splitl78与野生型的酶活（A)和稳定性（B) 随温度变化图。
[0043] 图4为纯化的重组黄嘌呤脱氢酶Splitl78与野生型的酶活㈧和稳定性⑶随 pH变化图。
[0044] 图5为黄嘌呤浓度对纯化的黄嘌呤脱氢酶截断体Splitl78与野生型酶催反应速 度的影响；(A)初反应速度与浓度关系图；(B)Lineweaver-Burk双倒数图。
[0045] 图6为纯化的黄嘌呤脱氢酶截断体Splitl78降解黄嘌呤和次黄嘌呤生成尿酸随 时间变化图。
【具体实施方式】
[0046] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0047] 下述实施例中所用的材料、试剂、试剂盒等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0048] pTrc99A为中国质粒载体菌株细胞株基因保藏中心Biovector Science Lab, Inc. 产品，产品目录号为 Biovectorl08321 (GenBank 登录号为 M22744. 1，Amann, Ε·，Ochs, B. and Abel,K. J. Tightly regulated tac promoter vectors useful for the expression of unfused and fused proteins in Escherichia coli.Gene, 1988,69(2):301-315.) 〇
[0049] 重组质粒pTrc99A-RcXDHNHis为将序列8所示的DNA分子插入pTrc99A载体Ncol 和Hind III双酶切位点得到的载体。
[0050] 含pTrc99A-RcXDHNHis重组质粒的工程化大肠杆菌DH5 α :将重组质粒 pTrc99A-RcXDHNHis转入工程化大肠杆菌DH5 α中，得到重组菌。
[0051] 镍离子金属鳌合亲和层析介质一 Qiagen?镇柱亲和树脂为Qiagen公司产品，产品 目录号为30210。
[0052] 黄嘌呤和次黄嘌呤为Sigma公司产品，产品目录号分别为Sigma X7375_10g和 Sigma H9377〇
[0053] Stratagene定点突变试剂盒为安捷伦公司Agilent Technologies产品，产品目 录号为200518。
[0054] 下述实施例中的黄嘌呤脱氢酶截断体Splitl78(以下简称截断体，或Splitl78) 均是指实施例1制备的黄嘌呤脱氢酶截断体；
[0055] 实施例1、黄嘌呤脱氢酶截断体及编码基因的获得
[0056] -、黄嘌呤脱氢酶截断体及其编码基因的获得
[0057] 1、野生型黄嘌呤脱氢酶理论计算模型的构建
[0058] 以蛋白质晶体结构数据库中解析的荚膜红细菌黄嘌呤脱氢酶晶体结构（PDB ID: 2W3S)为模板，分别构建野生型黄嘌呤脱氢酶大亚基和小亚基的同源模型；该操作借助于 Swiss-Model 服务器（http://www. swissmodel. expasy. org/interactive)完成，也可以米 用SPDBV软件（http://spdbv. vital-it. ch)在本地电脑上构建同源模型。
[0059] 借助于SPDBV软件，将2W3S PDB文件和野生型的大小两个亚基的理论模型PDB文 件导入；借助于软件所带结构比对功能，将大小亚基组装进2W3S模版；只保留2W3S中各氧 化还原中心原子及底物类似物分子和野生型的大小亚基，进行能量最小化优化。优化后的 结构即为野生型的理论计算模型。
[0060] 2、野生型黄嘌呤脱氢酶的理论计算模型与牛奶XDH晶体结构比对
[0061] 借助于Pymol工具，将经过蛋白酶有限裂解的牛奶XDH的晶体结构（PDB ID :3AX9) 和步骤一中所得野生型的理论计算模型进行结构比对。结果如下图1所示。
[0062] 图1表明野生型黄嘌呤脱氢酶与牛奶XDH总体结构基本一致，大亚基部分可以更 好的叠合，主要的区别在于小亚基部分。其中，牛奶XDH在对应于野生型黄嘌呤脱氢酶柔环 1〇〇Ρ 167 177的部位断裂掉。Loop 167 177链接野生型黄嘌呤脱氢酶中包含[2Fe_2S]簇的结构域 和包含FAD的结构域。L〇〇p 167 177的C端（第177位氨基酸）链接另一柔环，并与牛XDH中 相对应的位置一致，而N端（第167位氨基酸）链接一 alpha螺旋，并且与牛XDH对应位置 偏差较大。因此，为尽可能地减少对酶结构和活性的干扰，本发明选择L〇〇p 167 177的C端，即 177位氨基酸进行断裂设计。
[0063] 二、产荚膜红细菌黄嘌呤脱氢酶截断体的重组质粒PTRS178的构建
[0064] 1、提取模板质粒
[0065] 用接种环挑取一环保藏于_80°C超低温冰箱的含pTrc99A-RcXDHNHis重组质粒的 工程化大肠杆菌DH5 α，在含有1〇〇 μ g/ml氨苄青霉素的LB固体培养基平板上划线，然后倒 置于37°C培养箱中静止培养16h ;挑取单菌落接种于5ml含有100 μ g/ml氨苄青霉素的LB 液体培养基中，于37°C、220rpm摇床中培养过夜；用质粒提取试剂盒（Tiangen公司，产品代 码DP103)提取质粒DNA ;
[0066] 2、设计并合成如下引物
[0067] 采用Stratagene定点突变试剂盒（安捷伦公司，Agilent Technologies，产品目 录号为200518)策略，以pTrC99A-RCXDHNHis全质粒为模板，通过长片段引物在特定位置引 入碱基序列。所设计引物如下，
[0068] 上游引物：
[0069] 5? -AGCCTAAGG AGGA AACAGACC K\^C(XXKXKVFCCT(K；C(VAAA(XXKK}GATG -3'（序列 1)
[0070] (下划线所示序列为终止密码子，粗体斜体部分为RBS序列，粗体下划线部分序列 为起始密码子，斜体部分为与pTrc99A-R CXDHNHis中野生型黄嘌呤脱氢酶基因互补配对序 列）
[0071] 下游引物：
[0072] 5 ' -GGG CM；? GGTCTGTT TCCK CCTTAGGCTGTCTGCCCCCGCACGCCCGAGGATATTTC-3 '（序 列2)
[0073] (粗体下划线所示序列为起始密码子互补序列，斜体部分RBS序列互补序列，下划 线部分序列为终止密码子互补序列，斜体部分为与pTrc99A-R CXDHNHis中野生型黄嘌呤脱 氢酶基因互补配对序列）
[0074] 3、PCR产物的扩增
[0075] 以步骤一提取的pTrc99A_RcXDHNHis为模板，以上述二合成的上游引物和下游引 物为引物，进行PCR扩增，得到8845bpPCR产物，即为线性片段化的含有Splitl78截短体编 码基因的重组质粒pTRS 178。
[0076] 25 μ 1 PCR 反应体系：lng pTrc99A-RcXDHNHis, 2. 5 μ 1 上游引物，2. 5 μ 1 下游引 物，5 μ 1 5x Q5Reaction buffer，5 μ 15x Q5High GC enhancer，2 μ 1 dNTPs (各 2. 5mM)， 0· 5U Q5DNA polymerase，ddH20 补齐至 25 μ l〇
[0077] PCR 反应程序为：98°C预变性 lmin，98°C 10s，62°C 5s，72°C 4. 5min，循环 30 次，最 后 72°C退火 lOmin。
[0078] 4、重组质粒pTRS178的构建
[0079] 将上述获得的PCR产物加入10U Dpnl酶，于37°C水浴温浴lh以消解掉甲基化的 模板质粒。经消化的PCR产物直接转化大肠杆菌XLl-Blue感受态细胞，转化产物涂布含氨 苄青霉素（l〇〇μg/ml)的LB固体培养基，倒置于37°C恒温培养箱培养16h。挑选阳性克隆 提取质粒测序，结果质粒为将序列表中序列3所示的DNA分子替换pTrc99A质粒Ncol和 Hindlll酶识别位点间DNA片段得到的重组质粒，命名为pTRS178,即为产荚膜红细菌黄嘌 呤脱氢酶截断体的重组质粒，表达黄嘌呤脱氢酶截断体。
[0080] 序列表中序列3所示的DNA分子，自第22位至第3760位为黄嘌呤脱氢酶截断体 的编码基因，第3757位至第4695位为黄嘌呤脱氢酶伴侣蛋白的编码基因，该黄嘌呤脱氢酶 伴侣蛋白的氣基酸序列如序列7所不，大小为33. 4kDa。
[0081] 黄嘌呤脱氢酶截断体的编码基因中，序列3第22位至第558位为黄嘌呤脱氢酶截 断体的小亚基的编码基因序列，该小亚基的氣基酸序列如序列4所不，大小为约18. 9kDa ; 第573位至第1430位为黄嘌呤脱氢酶截断体的中亚基的编码基因序列，该中亚基的氨基酸 序列如序列5所示，大小为30. 3kDa ;其中第1427位至第3760位为黄嘌呤脱氢酶截断体的 大亚基的编码基因序列，该大亚基的氨基酸序列如序列6所示，大小为83. 2kDa。
[0082] 黄嘌呤脱氢酶截断体与野生型黄嘌呤脱氢酶相比，是将野生型的大小为49kDa的 小亚基从178位和179位中间进行断裂，生成大小分别为18. 9kDa和30. 3kDa的两个亚基。
[0083] 黄嘌呤脱氢酶截断体的编码基因（序列3)与野生型黄嘌呤脱氢酶编码基因（序 列8)相比，区别在于序列3比对8多了一段长度为20bp的核苷酸序列（序列1中第5至 24位核苷酸），序列3为在序列8中563位和564位碱基中间插入一段长度为20bp的核苷 酸序列（序列1中第5至24位核苷酸）得到的序列。
[0084] 三、黄嘌呤脱氢酶截断体的纯化
[0085] 1、将上述二得到的PTRS178转化大肠杆菌DH5 α，得到重组菌，挑取重组菌单菌 落，接种于5ml含有100 μ g/ml氨苄青霉素的LB液体培养基中，于37°C、220r/min条件下 培养过夜。将过夜培养的菌液，按照1 %的接种量转接于500ml含100 μ g/mL氨苄青霉素的 LB液体培养基中，于37°C、220r/min条件下培养，待菌液培养至0D_为0. 6左右，加入终浓 度为lmmol/L的IPTG诱导剂，同样条件下继续诱导培养16h。
[0086] 2、将步骤1得到的菌液9000r/min、4°C离心，收集沉淀，得到诱导表达的工程菌， 沉淀用50mmol/L磷酸盐缓冲液（pH 7. 5)洗涤一次后，重悬于100ml同样的缓冲液中，得到 菌悬液，将菌悬液通过高压细胞破碎机JN-10HC (广州聚能生物科技有限责任公司）破胞， 流速10L/H，4°C，压力为150MPa，破胞液于12 000r/min 4°C下离心30min，上清液为粗酶 液。
[0087] 3、金属螯合层析法纯化黄嘌呤脱氢酶截断体
[0088] (1)在上述2获得的粗酶液中加入终浓度为300mmol/L的NaCl和5mmol/L的咪 唑，并用0. 22 μ m滤膜过滤，得到滤液；
[0089] (2)将总体积为40ml的滤液上样QiageP镍柱亲和树脂，依次用含10mmol/L、 30mmol/L和50mmol/L咪唑的50mmol/L pH 7. 5磷酸缓冲液洗涤杂蛋白，每次洗脱的体积至 少为20个柱体积，然后用含120mmol/L咪唑的50mmol/L pH 7. 5磷酸缓冲液洗脱，收集洗 脱液为目的重组酶，以上洗脱的流速均为2. 5ml/min。
[0090] (3)将洗脱的目的重组酶通过分子截留量为lOKDa的Millipore超滤管，用 50mmol/L pH 7. 5Tris盐酸缓冲溶液反复换洗三次以除去盐分及咪唑成份后，得到浓缩酶 液，再将其重悬于50mmol/L pH 7. 5Tris盐酸缓冲液中，得到黄嘌呤脱氢酶截断体。
[0091] 采用上述的方法中，将pTrc99A-RCXDHNHis转入大肠杆菌中诱导表达，并按照上 述方法纯化，得到野生型黄嘌呤脱氢酶。
[0092] 将黄嘌呤脱氢酶截断体进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（Native-PAGE)和变性 聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE)检测，结果如图2所示，图2A为Native-PAGE结果，野生 型代表野生型黄嘌呤脱氢酶，Splitl78代表黄嘌呤脱氢酶截断体；图2B为SDS - PAGE结 果，结果表明，黄嘌呤脱氢酶截断体由大小约为18. 9kDa的小亚基、大小约为30. 3kDa的中 亚基和大小约为83. 2kDa的大亚基这三种亚基组成，而野生型黄嘌呤脱氢酶由大小约为 49. 2kDa的小亚基和约为83. 2kDa的大亚基这两种亚基组成。活性状态的黄嘌呤脱氢酶截 断体与野生型大小一致，均约为270kDa左右。可以推断出，截断体为（α β γ)2型组成，而 野生型为（α β)2。
[0093] 实施例2、黄嘌呤脱氢酶截断体在作为黄嘌呤脱氢酶的表征
[0094] 1、黄嘌呤脱氢酶酶活性的测定方法
[0095] 2mL酶活性的测定反应体系如表1所示。
[0096] 表1黄嘌呤脱氢酶酶活测定的2mL反应体系组成
[0097]
[0098] 将表1中的2mL反应体系中除黄嘌呤脱氢酶水溶液外的其余试剂混匀后置于40°C 水浴温浴5min，然后加入100 μ L黄嘌呤脱氢酶水溶液启动反应。在40°C条件下边反应边 记录反应3-5min内0D295吸光值变化，计算反应曲线最初线性部分的吸光度随时间变化速 率（△ 0D295/min)，吸光度随时间变化速率（△ 0D295/min)反映的是黄嘌呤脱氢酶水溶液生成 尿酸的速率。
[0099] 按照下述公式计算所检测的黄嘌呤脱氢酶的酶活和比酶活。
[0100] 酶活（U/ml) = A〇D295/minXl. 6Xdf (公式 1)
[0101] 比酶活（U/mg) = (U/ml) X 1/C (公式 2)
[0102] 公式1中1. 6为采用消光系数法将上述2ml反应体系中尿酸从吸光度变化转化为 摩尔浓度的计算系数，该系数计算方法为：
[0104] 其中：Vt为反应总体积（2. 0ml)，Vs为反应体系中酶液体积（0. 1ml)，12. 5为
[0105] 测定条件下尿酸的摩尔消光系数（cm2/ μ mol)，1. 0cm为测定比色杯光程。
[0106] 公式1中df为酶液稀释倍数。
[0107] 公式2中C为酶液的浓度，单位为mg/ml。
[0108] 酶活力单位⑶定义：在测定温度和pH值条件下每分钟转化生成1 μ mol尿酸所 需要的酶量。
[0109] 2、最适温度和温度耐受性的测定
[0110] 检测由实施例1中制备的黄嘌呤脱氢酶截断体是否具有黄嘌呤脱氢酶活性及其 最适温度和温度耐受性，以野生型黄嘌呤脱氢酶为对照。
[0111] 将上述1的方法中的黄嘌呤脱氢酶分别替换为实施例1中制备的黄嘌呤脱氢酶截 断体和野生型黄嘌呤脱氢酶。
[0112] 最适温度的测定通过将表1的200 μ 1反应体系分别置于25-80°C区间范围内测定 酶活，方法同步骤1，仅将水浴温度替换为25-80°C区间，相对酶活用残余酶活相对于最大 酶活的百分比来表示，最适温度用相对酶活的最大值对应的温度表示。
[0113] 实施例1制备的黄嘌呤脱氢酶截断体催化活性随反应温度变化曲线如图3A所示， 表明，黄嘌呤脱氢酶截断体具有黄嘌呤脱氢酶活性，且其最适反应温度为40°C，与野生型一 致。
[0114] 温度耐受性的测定是通过将实施例1制备的重组黄嘌呤脱氢酶在25_80°C区间不 同温度下分别处理30min，然后采用步骤1中的方法测定残余酶活，相对酶活用残余酶活性 相对于未经过处理的重组黄嘌呤脱氢酶的酶活性的百分比来表示。以相对残余酶活为纵坐 标，以处理温度为横坐标，进行S型曲线（Sigmoidal)曲线拟合，求出相对残余酶活为50% 时对应的处理温度，记为半失活温度（Τ 5(]3°)，用以表征温度耐受性。
[0115] 实施例1制备的重组黄嘌呤脱氢酶温度耐受性的测定结果如图3B所示，表明，在 25-60°C以下，重组黄嘌呤脱氢酶保持稳定，比野生型耐受更高的温度，对应的T M3°值比野 生型高11°C。
[0116] 3、最适pH和pH耐受性的测定
[0117] 最适pH值通过测定pH 4. 0-11.0范围内的相对酶活，用最大酶活对应的pH值表 示。具体是将表1中反应体系中最终浓度为〇. 05M的pH 8. 5Tris盐酸缓冲溶液分别替换 为pH 4. 0-5. 8的0· 05M乙酸缓冲体系、pH 5. 8-8. 0的0· 05M磷酸缓冲体系、pH 7. 5-9. 0的 0. 05M的Tris盐酸缓冲体系和pH 9. 0-11. 0的0. 05M的碳酸钠缓冲体系进行测定。以野生 型黄嘌呤脱氢酶为对照。
[0118] 结果如图4A所示，表明，黄嘌呤脱氢酶截断体的最适pH值为8. 5,与野生型一致。
[0119] pH耐受性的测定是通过将黄嘌呤脱氢酶截断体置于pH 4.0-11.0区间不同pH值 0. 05M缓冲溶液（pH 4. 0-5. 8为0. 05M乙酸缓冲体系；pH 5. 8-8. 0为0. 05M磷酸缓冲体系； pH 7. 5-9. 0为Tris盐酸缓冲体系；pH 9. 0-11. 0为碳酸钠缓冲体系）中，于室温放置16h。 然后采用步骤1中的方法测定残余酶活，相对酶活用残余酶活性相对于未经过处理的黄嘌 呤脱氢酶的酶活性的百分比来表示。
[0120] 结果如图4B所示，表明，在pH4. 5-10. 5范围内，黄嘌呤脱氢酶截断体保持稳定。
[0121] 4、酶促动力学参数
[0122] 按照步骤1的方法测定实施例1的黄嘌呤脱氢酶截断体的酶活力。在最适pH8. 5 和最适温度40°C条件下，0. 001_5mM黄嘌呤浓度范围内测定的最初反应速度，符合米氏动 力学方程。
[0123] 测定结果如图5所示，A为初反应速度随黄嘌呤浓度变化图，B为对应的双倒数曲 线图，表明，黄嘌呤脱氢酶截断体对黄嘌呤的1为55±3 μΜ，kcat值为200. 08±4. 29s \比 酶活可达90.14±1.931]/1^，催化效率为3.6481.以1 1。同等条件下测定的野生型黄嘌呤 脱氢酶的K"为68 ± 20 μ M，k cat值为93. 03 ± 10. 5s \最大比活力为41. 91 ±4. 73U/mg蛋白， 催化效率为1.37s \ μΜ1。因此，与野生型相比，本发明提供的黄嘌呤脱氢酶截断体对底物 (黄嘌呤）的亲和力提高19%，转化数提高115%，催化效率提高166%。
[0124] 5、黄嘌呤脱氢酶截断体在降解黄嘌呤和次黄嘌呤以及处理含该类底物的材料中 的应用
[0125] 参照表1中黄嘌呤脱氢酶反应体系的构建方法，构建如下a)至d)四组反应体系：
[0126] a) 50mM Tris-HCl缓冲溶液（pH 7. 5)，分别含终浓度为ImM的EDTA，0.1 mM的氧嗪 酸钾，0.1 mM的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD+)，0.1 mM的黄嘌呤和0. 4975mg/L实施例1制备 的黄嘌呤脱氢酶截断体；
[0127] b) 50mM Tris-HCl缓冲溶液（pH 7. 5)，分别含终浓度为ImM的EDTA，0.1 mM的氧嗪 酸钾，0.1 mM的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD+)，0.1 mM的次黄嘌呤，和0. 4975mg/L实施例1 制备的黄嘌呤脱氢酶截断体；
[0128] c) 50mM Tris-HCl缓冲溶液（pH 8. 5)，分别含终浓度为ImM的EDTA，0.1 mM的氧嗪 酸钾，0.1 mM的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD+)，0.1 mM的黄嘌呤，和0. 4975mg/L实施例1制 备的黄嘌呤脱氢酶截断体；
[0129] d) 50mM Tris-HCl缓冲溶液（pH 8. 5)，分别含终浓度为ImM的EDTA，0.1 mM的氧嗪 酸钾，0.1 mM的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD+)，0.1 mM的次黄嘌呤，和0. 4975mg/L实施例1 制备的黄嘌呤脱氢酶截断体；
[0130] 分别将a)和b)反应体系中除黄嘌呤脱氢酶截断体外的所有试剂加入并混匀，置 于35°C水浴中温浴5min，然后加入黄嘌呤脱氢酶启动反应，利用带有加热模块的分光光度 计将反应温度控制在35°C条件下，边反应边记录反应3-5min内295nm下吸光值变化，绘制 吸光度（A0D 295)的增加随时间变化的关系曲线、并计算反应曲线最初线性部分的吸光度随 时间的变化速率（A 〇D295/min)，从而检测底物黄嘌呤和次黄嘌呤的降解情况。
[0131] 采用同样的操作方法，将c)和d)置于40°C温浴，然后加入重组黄嘌呤脱氢酶启动 反应，记录40°C反应条件下△ 0D295变化，检测底物黄嘌呤和次黄嘌呤的降解情况。
[0132] a)至d)反应体系中吸光度（A〇D295)的增加值随时间的曲线如图6A所示。
[0133] 作为对照，分别用0. 3665mg/L野生型黄嘌呤脱氢酶替代黄嘌呤脱氢酶截断体构 建上述a)至d)四组反应体系，采用相同的测定方法，检测各反应体系中底物黄嘌呤和次黄 嘌呤的降解解情况。野生型所构建的反应体系中吸光度（A0D 295)的增加值随时间的曲线 如图6B所示。
[0134] 图6A表明，黄嘌呤脱氢酶截断体在pH 7.5和35°C、pH 8.5和40°C下均可以有 效降解黄嘌呤和次黄嘌呤。a)至d)反应体系下的最大吸光度变化速度（Δ(?295/π?η)分 别为 0· 0187、0· 056、0· 0364 和 0· 0736,对应的降解速率分别为 0· 0299 μπιο?. L Lmin \ 0· 0896 μ mol. L、min \ 0· 0582 μ mol. L、min 1 和 0· 1178 μ mol. L、min \ 对应的比活力分 别为3. 01U/mg，9. 01U/mg，5. 85U/mg和11. 83U/mg，相比较于同等条件下测定的野生型对应 的比活力分别为2.641]/11^，8.241]/11^，5.081]/11^和10.581]/11^(图68)，分别提高了14%， 9%，15% 和 12%〇
【主权项】
1. 一种蛋白，由亚基甲、亚基乙和亚基丙3个亚基组成： 所述亚基甲的氨基酸序列为序列表中序列4或将序列表中序列4所示的氨基酸序列经 过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加的序列； 所述亚基乙的氨基酸序列为序列表中序列5或将序列表中序列5所示的氨基酸序列经 过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加的序列； 所述亚基丙的氨基酸序列为序列表中序列6或将序列表中序列6所示的氨基酸序列经 过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加的序列。2. 编码权利要求1所述蛋白的DNA分子。3. 根据权利要求2所述的DNA分子，其特征在于：所述DNA分子包括所述亚基甲的编 码DNA分子、所述亚基乙的编码DNA分子和所述亚基丙的编码DNA分子。4. 根据权利要求2或3所述的DNA分子，其特征在于： 所述DNA分子为如下中1)-4)中至少一种： 1) 编码区为序列表中序列3第22位至第3760位核苷酸所示的DNA分子； 2) 编码区为序列表中序列3的核苷酸所示的DNA分子； 3) 在严格条件下与1)或2)限定的DNA分子杂交且编码权利要求1或2所述蛋白的 DNA分子； 4) 与1)或2)限定的DNA分子具有90 %以上的同一性且编码权利要求1或2所述蛋 白的DNA分子。5. 含有权利要求2-4中任一所述DNA分子的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组 菌。6. 权利要求1所述的蛋白在作为黄嘌呤脱氢酶中的应用。7. 权利要求2-4中任一所述DNA分子或权利要求5所述重组载体、表达盒、转基因细胞 系或重组菌在制备黄嘌呤脱氢酶中的应用。8. 权利要求1所述的蛋白或权利要求2-4中任一所述DNA分子或权利要求5所述重组 载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌在制备具有黄嘌呤脱氢酶活性的产品中的应用； 或权利要求1所述的蛋白或权利要求2-4中任一所述DNA分子或权利要求5所述重组 载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌在降解黄嘌呤或次黄嘌呤中的应用。9. 根据权利要求7或8所述的应用，其特征在于：所述黄嘌呤脱氢酶具有如下1)-3)中 至少一种特性： 1) 所述黄嘌呤脱氢酶的亚基构型为（α β 丫）2型； 2) 所述黄嘌呤脱氢酶的最适反应温度为40°C ; 3) 所述黄噪呤脱氢酶的最适pH值为8. 5。10. -种制备黄嘌呤脱氢酶的方法，包括如下步骤：诱导表达权利要求5所述的重组 菌，得到权利要求1所述蛋白。
【文档编号】A62D101/28GK105985935SQ201510048275
【公开日】2016年10月5日
【申请日】2015年1月30日
【发明人】邢新会, 王成华, 张翀
【申请人】清华大学, 清华大学无锡应用技术研究院