专利名称：一种6－氯嘌呤核苷的酶法合成方法
技术领域：
本发明涉及一种核苷类似物的酶法合成方法。具体地说涉及一种6-氯嘌呤核苷的酶法合成方法。
背景技术：
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6-氯嘌呤核苷(6-chlro-purine riboside)是重要的医药中间体，可制备多种新型核苷类药物(如6-甲氧基-9-β-D-嘌呤核苷，6-氯嘌呤-2’，3’双脱氧苯甲氧基核苷)，特别是作为合成抗心率失常新药CVT-510(N-[3(R)-tetrahydrofuranyl]-6-aminopurine riboside)的重要中间体之一，具有很好的应用前景(Zaza A.CVT-510(CVTherapeutics).[J]Curr Opin Investig Drugs，2002 Jan；Vol.3(1)，pp.96-100)。
到目前为止，6-氯嘌呤核苷(6-chlro-purine riboside)仅有化学合成法的报道(Shigetada Kozai，Satoshi Takamastsu，KunisukeIzawa，Introduction of a Benzoyl Group onto Riboside in AqueousSolutionOne-Step Synthesis of 6-Chloropurine2’，3’-di-o-benzoylriboside[J]Terahedron Letters 1999，40，4355-4358)，化学法合成路线一般都是通过鸟苷或腺嘌呤核苷为原料，经酰化，取代，氨解三步化学反应合成，收率都比较低，摩尔总收率都在30-35％左右；化法生产周期长，涉及有毒、易爆有机试剂，反应中需要对核糖进行保护和去保护，副产物多，立体选择性不佳，收率较低，而且对环境也很不友好，不符合现在倡导的绿色友好化学的主题。
发明内容
本发明需要解决的技术问题在于提供一种6-氯嘌呤核苷的酶法合成方法，以解决现有技术中存在的生产周期长、合成率低、对环境有污染等缺点。
本发明的6-氯嘌呤核苷的酶法制备方法如下将0.01-0.2mmol鸟苷和0.1-0.5mmol 6-氯嘌呤加入10ml水中，然后加入0.5-2ml的脱氧核糖转移酶液，再加入5毫升缓冲液进行碱基交换反应，反应温度为37-40℃，反应20-30h，将反应器皿在沸水中沸煮5-10min以中止反应，反应液被冷冻干燥，残留物用10-30ml甲醇萃取，萃取液中物质即为6-氯嘌呤核苷。
其中缓冲液是5毫升的0.1mol/L H3PO4---KH2PO4缓冲液(Ph＝6.0)、0.1mol/L柠檬酸缓冲液(pH＝6.3)或0.1mol/L磷酸缓冲液(pH＝6.0)中的一种。
而脱氧核糖转移酶EC 2.4.2.6制备如下在500ml三角瓶中装入上述培养基200ml，于110℃灭菌10分钟，冷却后接种。于40℃空气摇床培养24h。将培养液离心10000r/min×10min冷冻离心搜集菌体，菌体以液氮冷冻干燥，再分别以少量柠檬酸缓冲液(pH 6.5)和磷酸缓冲液(pH 6.0)洗涤，再离心，取上清液作为酶源备用。
其反应式为 采用酶法催化合成核苷类似物，工艺简单，反应条件温和，成本低，收率高，且不易造成污染。该方法的优点是可以避免在化学合成中的基团保护和去保护的操作，使反应条件温和化和简单化。反应用溶剂为水或缓冲液，极大的减少了对环境的危害。
具体实施例方式
实施例1在10ml水中，分别加入底物(0.1mmol鸟苷和0.3mmol 6-氯嘌呤)，0.1M磷酸缓冲液5ml(pH 6.0)，1ml自制的脱氧核糖转移酶液于25ml的锥形瓶中，在40℃恒温水浴中以120r/min振荡发应20h。沸水中沸煮5min以中止反应。反应液被冷冻干燥，残留物用10ml甲醇萃取，萃取液用TLC展开进行薄板制备，获得产物6-chloro-purineriboside，Y49.58％。
实施例2在10ml水中，分别加入底物(0.1mmol鸟苷和0.3mmol 6-氯嘌呤)，KH2PO4缓冲液5ml(pH 6.0)，1ml自制的脱氧核糖转移酶液于25ml的锥形瓶中，在40℃空气摇床中以120r/min振荡发应30h，结束后在沸水煮10min以中止反应。反应液被冷冻干燥，残留物用30ml甲醇萃取，减压浓缩得固体混合物。固体混合物过硅胶层析柱(5％CH3OH/CH2Cl2，v/v)纯化，得到产物6-chloro-purine riboside，Y53.57％。
实施例3在10ml水中，分别加入底物(0.1mmol鸟苷和0.3mmol 6-氯嘌呤)，柠檬酸缓冲液5ml(pH 6.0)，1ml自制的脱氧核糖转移酶液于25ml的锥形瓶中，在37℃空气摇床中以120r/min振荡发应25h，结束后在沸水煮5min以中止反应。反应液被冷冻干燥，残留物用30ml甲醇萃取，减压浓缩得固体混合物。固体混合物过制备薄板纯化二氯甲烷—甲醇—水(CH2Cl2∶CH3OH＝9∶1∶0.25)为展开剂，得产物6-chloro-purine ribos ide，Y52.81％。
反应过程中定性分析采用薄层层析法(TLC-UV法)。以活化硅胶板为载体，二氯甲烷—甲醇—水(9∶1∶0.25v/v)为展开剂，紫外显色。鸟苷，6-氯嘌呤，鸟嘌呤，6-氯嘌呤核苷的Rf参考值分别为0.10，0.23，0.46，0.73。
底物和产物定量分析采用HPLC法进行检测，高效液相色谱仪为waters 510，紫外检测器为waters 2487，色谱条件为色谱柱Diamonsil C18，Φ250×4.6mm；流动相为甲醇∶水＝1∶2，流速为0.9ml/min；进样量为20μl；检测波长225nm。其中鸟苷，6-氯嘌呤，鸟嘌呤，6-氯嘌呤核苷的tR参考值分别为5.0min，6.3min，11.8min，7.8min。HPLC分析所用样品均取自反应液，并根据反应液中的底物初始浓度和产物浓度计算产率。
谱图分析数据如下1HNMR(D2O，400M HZ)8.599(S，1H，H-2)，8.596(S，1H，H-8)，6.036(m，1H，H-1′)，4.667(m，1H，H-3′)，4.296(m，1H，H-2′)，4.124(m，1H，H-4′)，3.753(m，2H，H-5′)UV(H2O)max 235nm。
权利要求
1.一种6-氯嘌呤核苷的酶法合成方法，其特征在于该方法为将0.01-0.2mmol鸟苷和0.1-0.5mmol 6-氯嘌呤加入10ml水中，然后加入0.5-2ml的脱氧核糖转移酶液，再加入5毫升缓冲液进行碱基交换反应，反应温度为37-40℃，反应20-30h，将反应器皿在沸水中沸煮5-10min以中止反应，反应液被冷冻干燥，残留物用10-30ml甲醇萃取，萃取液中物质即为6-氯嘌呤核苷；其中缓冲液是的0.1mol/L H3PO4-KH2PO4缓冲液、0.1mol/L柠檬酸缓冲液或0.1mol/L磷酸缓冲液中的一种。
2.根据权利要求1所述的6-氯嘌呤核苷的酶法合成方法，其特征在于该方法为将0.1mmol鸟苷和0.3mmol 6-氯嘌呤加入10ml水中，然后加入1ml的脱氧核糖转移酶液，再加入5毫升缓冲液进行碱基交换反应，反应温度为40℃，反应20-30h，将反应器皿在沸水中沸煮5min以中止反应，反应液被冷冻干燥，残留物用10-30ml甲醇萃取，萃取液中物质即为6-氯嘌呤核苷；其中缓冲液是的0.1mol/L H3PO4-KH2PO4缓冲液、0.1mol/L柠檬酸缓冲液或0.1mol/L磷酸缓冲液中的一种。
全文摘要
本发明公开了一种6－氯嘌呤核苷的酶法合成方法，该方法是将鸟苷和6－氯嘌呤在脱氧核糖转移酶的作用下合成6－氯嘌呤核苷。采用酶法催化合成核苷类药物，可以避免在化学合成中的基团保护和去保护的操作，工艺简单，反应条件温和，成本低，收率高，且不易造成污染。
文档编号A61P9/00GK1763214SQ20051002942
公开日2006年4月26日 申请日期2005年9月6日 优先权日2005年9月6日
发明者朱利民, 樊华伟 申请人:东华大学