一种联合中药激活扩增的间充质干细胞及制备方法和应用
【专利摘要】本发明提供一种联合中药激活扩增的间充质干细胞，其制备方法包括以下步骤：（1）预处理：使用胰酶和Ⅳ型胶原酶消化组织块，分离原代间充质干细胞；（2）培养：将步骤（1）所得细胞加入成分为含50?80mg/mL的珍珠草提取物、50?80mg/mL的五倍子提取物、1.5?3mmol/mL的L?谷氨酰胺、1.5?3ng/mL bFGF的低糖DMEM培养基中，于37℃、5% CO2潮湿培养箱中培养，每隔3?4天换一次培养基；（3）收集细胞并传代培养。体外试验显示，使用中药激活的间充质干细胞能有效抑制HBV的复制，并促进受损肝细胞的修复。
【专利说明】
一种联合中药激活扩増的间充质干细胞及制备方法和应用
技术领域
[0001] 本发明属于间充质干细胞及其应用技术领域，具体涉及一种联合中药激活扩增的 间充质干细胞及制备方法和应用。
【背景技术】
[0002] 肝硬化（liver cirrhosis)是多种慢性肝病进展的重要阶段，在我国，病毒性肝炎 是引起肝硬化的主要原因，肝硬化患者的干细胞HBsAg阳性率高达76.7%。引起肝硬化的常 见病毒为乙肝HBV或丙肝病毒HCV，而我国的HBV感染率已经高达10%，据不完全统计，我国 慢性乙肝病人约为2000万人，其中近25-30万慢性乙肝病人可发展为肝硬化，其中5-20万可 能发展为肝癌。肝硬化主要发病机制是基于病毒侵犯肝脏后导致肝细胞长期慢性炎症、肝 细胞死亡，并由肝脏组织进行纤维化发展而来，它是机体对慢性肝损的一种修复反应，故如 何有效控制肝纤维化的发生和发展是防治慢性肝炎发展成为肝硬化的重要环节。
[0003] 目前临床上肝纤维化的治疗方法主要有以下几种：（1)去除伤害性刺激；（2)运用 化学药物来阻止胶原的合成和促进其降解；（3)运用中药抗纤维的免疫调节疗法；（4)肝移 植等。但是这些方法都存在一定的缺陷，尚缺乏特异有效的治疗方法，预后不良。
[0004] 近年来运用成体干细胞移植治疗受损组织和器官成为热点。间充质干细胞作为一 类成体干细胞存在于多种组织中，其在体外具有很强的克隆形成和扩增能力以及炎症趋化 特性。但现有的方法培养出的间充质干细胞在细胞活性和抗HBV感染能力方面不强，不能很 好的修复受损肝细胞，减少肝损伤。
【发明内容】
[0005] 针对现有技术中存在的上述问题，本发明提供一种联合中药激活扩增的间充质干 细胞及制备方法和在制备肝纤维化细胞移植治疗药物中的应用，可有效解决间充质干细胞 活性和抗HBV感染能力不强，不能很好的修复受损肝细胞的问题。
[0006] 为实现上述目的，本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：
[0007] -种联合中药激活扩增的间充质干细胞的制备方法，包括以下步骤：
[0008] (1)预处理：在无菌条件下，将含有间充质干细胞的组织用PBS缓冲液清洗2-3次 后，切碎，获得组织碎块，然后将组织碎块按1:3的体积比与含有胰酶和IV型胶原酶的低糖 DMEM(Gibco)混合液混合，在37 °C下消化l_2h，再加入终浓度为25ug/mL的透明质酸酶消化 5-10min，100_200r/min下离心5-10min，弃上清，用含10%FBS的低糖DMEM培养基清洗沉淀1 次，于100_200r/min下离心5-10min，去除上清液得沉淀；
[0009] (2)培养:将步骤（1)所得沉淀加入培养基中，于37°C、5%⑶2潮湿培养箱中培养， 每隔3-4天换一次培养基;其中培养基成分为含50-80mg/mL的珍珠草提取物、50-80mg/mL的 五倍子提取物、1.5-3mmol/mL的L-谷氨酰胺和1.5-3ng/mLbFGF的低糖DMEM;
[0010] (3)收集和传代：待细胞融合度为70-80%时，用0.25%(w/v)Trypsin-0.53mM EDTA消化液消化细胞，然后2000r/min离心3-5min，收集细胞，并进行传代培养。
[0011] 进一步地，步骤(1)中间充质干细胞的来源为人脐带或人胚胎羊膜。
[0012] 进一步地，步骤⑴中胰酶的浓度为〇.〇5%(w/v)，IV型胶原酶的浓度为卜2mg/mL。 [00 13] 进一步地，步骤(2)中培养基成分为含50mg/mL的珍珠草提取物、50mg/mL的五倍子 提取物、2mmol/mL的L-谷氨酰胺和2.5ng/mL bFGF的低糖DMEM。
[0014] 进一步地，步骤(2)中珍珠草提取物是这样获得的：取珍珠草，清洗干净后晾干，粉 碎至50-100目，将粉末与无水乙醇以重量比为1-2.5:1混合，然后进行C0 2超临界萃取，最后 离心除杂，得脂溶性萃取物，向萃取余物中加入20-25倍余物重量的蒸馏水，在90-95°C加热 6_8h，然后过滤，浓缩，最后真空冷冻干燥得水溶性萃取物，合并两次萃取物得珍珠草提取 物。
[0015] 进一步地，步骤(2)中五倍子提取物是这样获得的：取五倍子，清洗干净后晾干，粉 碎至50-100目，将粉末与无水乙醇以重量比为1-2.5:1混合，然后进行C0 2超临界萃取，最后 离心除杂，得脂溶性萃取物，向萃取余物中加入20-25倍余物重量的蒸馏水，在90-95°C加热 6_8h，然后过滤，浓缩，最后真空冷冻干燥得水溶性萃取物，合并两次萃取物得五倍子提取 物。
[0016] 通过上述方法获得的联合中药激活扩增的间充质干细胞在制备肝纤维化细胞移 植治疗药物中的应用。
[0017] 本发明提供的一种联合中药激活扩增的间充质干细胞及制备方法和应用，具有以 下有益效果：
[0018] (1)使用低糖DMEM作为胰酶和IV型胶原酶的稀释液，在组织消化过程中，可为细胞 提供基础营养，保证细胞的存活率，同时还能稳定细胞在分离和培养时的渗透压，使整个过 程处于一个温和状态。
[0019] ⑵珍珠草，又名阴阳草、假油柑、叶后株、叶下珠，为大戟科植物叶下珠的全草或 带根全草，具有平肝清热、利水解毒的功效，还有抗乙型肝炎病毒，抗肝纤维化作用，对肝损 伤有保护作用等;五倍子，又名百虫仓、百药煎、掊子，为同翅目蚜虫科的角倍蚜或倍蛋蚜雌 虫寄生于漆树科植物及其同属其他植物的嫩叶或叶柄，刺伤而生成一种囊状聚生物虫癭， 经烘焙干燥后所得。
[0020] (3)本发明在培养基中添加珍珠草提取液和五倍子提取液，培养出的间充质干细 胞的细胞活性强，能有效抵抗HBV的入侵，降低新生干细胞遭受HBV的感染，抗HBV感染能力 上有显著提高，且能更好的修复受损干细胞，减少肝损伤。
【附图说明】
[0021] 图1为中药处理组和对照组间充质干细胞分泌细胞因子(TGFI3和IL-10)的ELISA检 测结果。
[0022] 图2为经中药处理组和对照组间充质干细胞中抗HBV相关microRNA相对表达量的 Q-PCR检测结果图；
[0023]图3为间充质干细胞培养上清对于HepG2-hNTCP-C4细胞抗HBV能力指标（HBV pgRNA和cccDNA)的Q-PCR检测结果图；
[0024]图4为间充质干细胞培养上清对于HepG2-hNTCP-C4和PHH细胞抗HBV能力指标 (HBeAg)的ELISA检测结果图。
【具体实施方式】
[0025] 实施例1联合中药激活扩增的间充质干细胞的制备
[0026] -种联合中药激活扩增的间充质干细胞，其制备方法包括以下步骤：
[0027] (1)预处理即间充质干细胞的分离:在无菌条件下，将人脐带用PBS缓冲液清洗2-3 次后，剪碎，获得l-3cm3组织碎块，然后将组织碎块按1: 3的体积比与含有胰酶（w/v为 0.05 % )和IV型胶原酶（1.5mg/mL)的低糖DMEM(Gibco)混合液混合，在37°C下消化l_2h，再 加入终浓度为25ug/mL的透明质酸酶消化5-10min，100-200r/min下离心5-10min，弃上清， 用含10%FBS的低糖DMEM培养基清洗沉淀1次，于100-200r/min下离心5-10min，去除上清 液，得沉淀即得原代华通氏胶来源的间充质干细胞；
[0028] (2)间充质干细胞的培养:将步骤（1)所得沉淀中加入培养基中，于37°C、5%C02潮 湿培养箱中培养，每隔3-4天换一次培养基;其中培养基成分为含50mg/mL的珍珠草提取物、 50mg/mL的五倍子提取物、2mmol/mL的L-谷氨酰胺和2.5ng/mL bFGF的低糖DMEM;对照组细 胞培养基中不含珍珠草和五倍子提取物；
[0029] 其中珍珠草提取物是这样获得的：取珍珠草，清洗干净后晾干，粉碎至100目，将粉 末与无水乙醇以重量比为2:1混合，然后进行C0 2超临界萃取，萃取压力为35MPa，萃取温度 为40°C，萃取时间为3h，C02流体流量为700L/h，然后离心除杂，得脂溶性萃取物，向萃取余 物中加入25倍余物重量的蒸馏水，在95°C加热6h，然后过滤，浓缩，最后真空冷冻干燥得水 溶性萃取物，合并两次萃取物得珍珠草提取物；
[0030] 五倍子提取物是这样获得的：取五倍子，清洗干净后晾干，粉碎至100目，将粉末与 无水乙醇以重量比为2:1混合，然后进行⑶ 2超临界萃取，萃取压力为35MPa，萃取温度为40 °C，萃取时间为3h，C02流体流量为700L/h，然后离心除杂，得脂溶性萃取物，向萃取余物中 加入25倍余物重量的蒸馏水，在95 °C加热6h，然后过滤，浓缩，最后真空冷冻干燥得水溶性 萃取物，合并两次萃取物得五倍子提取物；
[0031] (3)收集细胞和传代:待细胞融合度为70-80 %时，用0 · 25 % (w/v)Trypsin-o · 53mM EDTA消化液消化细胞，然后2000r/min离心3-5min，收集细胞并传代培养。
[0032]为了确定中药处理对间充质干细胞活性的影响，本发明先使用IFNy (100ng/mL) 激活间充质干细胞，然后运用ELISA法检测间充质干细胞培养上清中的细胞因子TGFi3和IL-10的含量，结果如图1所示，中药处理组(treated)和对照组(untreated)相比，释放更多量 的细胞因子。
[0033] 实施例2Q-PCR检测mi croRNAs的表达
[0034] 使用Taqman探针法检测实施例1中获得的联合中药激活扩增的间充质干细胞中抗 病毒相关 microRNAs(miR-122，miR-141，miR-199a，miR-210)的相对表达量。
[0035] 具体方法如下:分别提取实施例1中的中药处理组(本发明制备的联合中药激活扩 增的间充质干细胞)和对照组间充质干细胞的RNA，并逆转录得到cDNA;以cDNA为模板，在特 异性引物和探针引导下进行Q-PCR反应;使用Taqman?MicroRNA Assay试剂盒，反应体系 为：0.67yL cDNA,lyL 10XTaqman Universal PCR master mix，lyL primers and probe mix，7.33yL ddH20,总体积为10yL;反应条件为:95°C预变性5min，95°C变性15s，60°C退火 60s，共40个循环;所用试剂盒购自Thermo Scientifi公司，引物和探针序列如下：
[0052] 其中RNA的提取方法为:采用Trizol试剂(Life technology公司）提取间充质干细 胞（中药处理组和对照组）的RNA，首先离心收集细胞（lX107cells)，加入lmL Trizol进行 提取，RNA沉淀用50yL DEPC-H20溶解，并测定其浓度。
[0053] cDNA的制备方法为：以lyg RNA为模板，进行逆转录反应，逆转录反应体系（20yL) 为：lyg RNA，lyL 01igo(dT)is，2yL dNTP Mix(10mM each)，lyL Revert Aid M-MuL V，lyL RNase Inhibitor，4yL 5XReaction Buffer，用DEPC-H2O补足体积至20yL;反应条件为42 °C，1小时。所用试剂盒购自Thermo Scientifi公司。
[0054] 抗病毒相关 microRNAs(miR-122，miR-141，miR-199a，miR-210)的相对表达量结果 如图2所示，与未经中药处理(untreated)的间充质干细胞相比，经中药处理(珍珠草和五倍 子提取物）的间充质干细胞表达更多的11^1?-122，1^1?-141，1^1?-199 &和1^1?-210，说明本发明 制备出的联合中药激活扩增的间充质干细胞抗病毒能力强。
[0055] 实施例3
[0056]中药处理的间充质干细胞增强肝细胞抗HBV体外实验分析，具体步骤如下：
[0057] (l)HBV侵染肝细胞体外模型
[0058] 使用原代人肝细胞(primary human hepatocytes，PHH)和HepG2-hNTCP_C4细胞株 作为实验对象，分别向细胞中加入l〇g. e/cell和100g.e/cel 1(genome equivalents per cell)的HBV，细胞培养基中加入4%PEG 8000,以及1/2体积未经中药处理的间充质干细胞 培养上清(MSC)或1/2体积的联合中药激活扩增的间充质干细胞上清(MSC-CM)，置于37°C培 养24小时；
[0059] (2)Q-PCR 检测 HBV 相关 DNA
[0060]具体方法为:收集步骤（1)中肝细胞，使用细胞裂解液(pH7.4，浓度为50mM的1>&-HC1，ImM EDTA，1 %NP-40)进行裂解，15000r/min离心5min(4°C )，收集上清；上清使用6mM Mg0Ac，DNase I(200mg/mL)和RNase A(100mg/mL)处理3h(37°C)，然后加入 10mM EDTA，于65 °C反应 15min以终止反应；再加入proteinase K(200mg/mL)，l%SDS和lOOmM NaCl，于37°C 反应2h，最后使用苯酚:氯仿:异戊醇(体积比为25:24:1)抽提，乙醇沉淀分离病毒核酸。 [0061 ]使用SYBR?Green法检测HBV DNA(pregenomic RNA(pgRNA)和covalently closed circular DNA(cccDNA))的拷贝数，所用特异性引物如下：
[0066] 检测结果如图3所示，经HBV侵染后，！tepG2-hNTCP-C4细胞中可以检测到HBV DNA的 表达(mock组），而加入未经中药处理的间充质干细胞培养上清处理后肝细胞中HBV DNA的 含量有所下降，特别是加入中药处理组的间充质干细胞培养上清后，肝细胞的抗病毒能力 最强。
[0067] (3)Elisa检测HBV相关抗原
[0068] 收集步骤（1)中细胞培养上清，使用Hepatitis B e Antigen(HBeAg)检测试剂盒 进行检测。检测结果如图4所示，在HepG2-hNTCP-C4和PHH肝细胞HBV侵染模型中，中药处理 组间充质干细胞培养上清预处理肝细胞后，可以明显降低HBV抗原的数量，增强肝细胞的抗 HBV能力。
[0069]实施例4中药处理的间充质干细胞移植实验
[0070]分别收集中药处理的间充质干细胞及未用中药处理的间充质干细胞，用生理盐水 调整其浓度为IX 1〇6个细胞/mL，并加入1-5%的人血白蛋白（成都蓉生药业），配置成间充 质干细胞注射液。
[0071]选取30例乙肝肝纤维化的住院病人，分为模型组、对照组、实验组，每组10人，模型 组输入50mL生理盐水，对照组输入50mL未经中药处理的干细胞注射液，实验组输入50mL中 药处理的间充质干细胞，每组输入3次，每次间隔1周，分别于回输前及最后一次输完后第14 天抽取患者静脉血，采用免疫法测定血清透明质酸(HA)、血清m型前胶原(pc-m-p)、血清 IV型胶原(CV-IV)、血清层粘连蛋白（LN)的水平，测定结果见下表：
【主权项】
1. 一种联合中药激活扩增的间充质干细胞的制备方法，其特征在于，包括以下步骤： (1) 预处理:在无菌条件下，将含有间充质干细胞的组织用PBS缓冲液清洗2-3次后，切 碎，获得组织碎块，然后将组织碎块按1:3的体积比与含有胰酶和IV型胶原酶的低糖DMEM混 合液混合，在37°C下消化l_2h，再加入终浓度为25ug/mL的透明质酸酶消化5-10min，100-200r/min下离心5-10min，弃上清，用含10%FBS的低糖DMEM培养基清洗沉淀1次，于100-200r/min下离心5-10min，去除上清液得沉淀； (2) 培养:将步骤(1)所得沉淀加入培养基中，于37 °C、5% C02潮湿培养箱中培养，每隔3-4天换一次培养基;其中培养基成分为含50-80mg/mL的珍珠草提取物、50-80mg/mL的五倍子 提取物、1.5-3mmol/mL的L-谷氨酰胺和1.5-3ng/mL bFGF的低糖DMEM; (3) 收集：待细胞融合度为70-80%时，用0.25%(w/v)Trypsin-0.53mM EDTA消化液消化 细胞，然后2000 r/min离心3-5min，收集细胞。2. 根据权利要求1所述的联合中药激活扩增的间充质干细胞的制备方法，其特征在于， 步骤(1)中间充质干细胞的来源为人脐带或人胚胎羊膜。3. 根据权利要求1所述的联合中药激活扩增的间充质干细胞的制备方法，其特征在于， 步骤(1)中所述的胰酶的浓度为0.05%( w/V)，IV型胶原酶的浓度为1 -2mg/mL。4. 根据权利要求1所述的联合中药激活扩增的间充质干细胞的制备方法，其特征在于， 步骤（2)中所述的培养基成分为含50mg/mL的珍珠草提取物、50mg/mL的五倍子提取物、 2mmol/mL的L-谷氨酰胺和2.5ng/mL bFGF的低糖DMEM。5. 根据权利要求1所述的联合中药激活扩增的间充质干细胞的制备方法，其特征在于， 步骤(2)中所述的珍珠草提取物是这样获得的：取珍珠草，清洗干净后晾干，粉碎至50-100 目，将粉末与无水乙醇以重量比为1-2.5:1混合，然后进行C0 2超临界萃取，最后离心除杂， 得脂溶性萃取物，向萃取余物中加入20-25倍余物重量的蒸馏水，在90-95 °C加热6-8h，然后 过滤，浓缩，最后真空冷冻干燥得水溶性萃取物，合并两次萃取物得珍珠草提取物。6. 根据权利要求1所述的联合中药激活扩增的间充质干细胞的制备方法，其特征在于， 步骤(2)中所述的五倍子提取物是这样获得的：取五倍子，清洗干净后晾干，粉碎至50-100 目，将粉末与无水乙醇以重量比为1-2.5:1混合，然后进行C0 2超临界萃取，最后离心除杂， 得脂溶性萃取物，向萃取余物中加入20-25倍余物重量的蒸馏水，在90-95 °C加热6-8h，然后 过滤，浓缩，最后真空冷冻干燥得水溶性萃取物，合并两次萃取物得五倍子提取物。7. 如权利要求1-6任一项方法制得的联合中药激活扩增的间充质干细胞。8. 如权利要求7所述的联合中药激活扩增的间充质干细胞在制备肝纤维化细胞移植治 疗药物中的应用。
【文档编号】A61P1/16GK105985930SQ201610430959
【公开日】2016年10月5日
【申请日】2016年6月15日
【发明人】王仲
【申请人】王仲