一种经基因缺失改造的恰塔努加链霉菌及其应用
【专利摘要】本发明涉及一种经基因缺失改造的恰塔努加链霉菌及其应用。首次揭示一类与恰塔努加链霉菌生产纳他霉素过程中产生的杂质的生成有关的基因，并获得了相关基因敲除的恰塔努加链霉菌。CGMCC No. 947920140718
【专利说明】
一种经基因缺失改造的恰塔努加链霉菌及其应用
技术领域
[0001] 本发明属于生物技术领域，更具体地，本发明涉及一种经基因缺失改造的恰塔努 加链霉菌及其应用。
【背景技术】
[0002] 纳他霉素是一种多烯大环内酯类抗真菌抗生素，由于其高效、广谱、安全等优点被 广泛用于食品防腐剂和药物。它能有效抑制大多数酵母和霉菌的生长，阻止真菌毒素的形 成；由于其难溶于水和油脂，它很难被动物或人体的肠胃吸收，因而对哺乳动物细胞的毒性 极低。
[0003] 作为食品防腐剂，纳他霉素具有低剂量、高效率、抗菌时间长、不影响食品的口味 等优点。美国FDA(Food and Drug Administration)已经批准纳他霉素用作食品防腐剂， 并建议纳他霉素作为食品添加剂使用，还被归类为GRAS产品之列。1997年，我国食品添加 剂委员会对纳他霉素进行评价并建议批准使用，现已列入食品添加剂使用标准，其商品名 称为霉克（Natamycin TM)。纳他霉素还作为高效抗菌剂应用于滴眼液或软膏等药物中，用 来治疗真菌性角膜炎、脚藓等真菌性皮肤感染疾病。目前已有30多个国家批准使用它作为 天然生物性食品防腐剂和抗菌添加剂。
[0004] 国内外目前常用于生产纳他霉素的发酵菌有褐黄孢链霉菌、纳塔尔链霉菌、恰塔 努加链霉菌。上述菌株中，其中恰塔努加链霉菌产量较高，但是在其发酵过程中除了纳他霉 素之外还产生较大量的黄色素物质，此类黄色物质对纳他霉素的产品质量造成较大影响。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于提供一种经基因缺失改造的恰塔努加链霉菌及其应用。
[0006] 在本发明的第一方面，提供一种恰塔努加链霉菌基因工程菌，所述菌株中0RF1240 基因和0RF1241基因不表达。
[0007] 在一个优选例中，所述的恰塔努加链霉菌基因工程菌的基因组中敲除了 0RF1240 基因和0RF1241基因。
[0008] 在另一优选例中，所述的恰塔努加链霉菌基因工程菌中，SEQ ID NO: 1所示的核苷 酸序列缺失。
[0009] 在另一优选例中，SEQ ID NO: 1所示的核苷酸序列由SEQ ID N0:2所示的核苷酸 序列替换（包括全部替换或部分替换）。
[0010] 在另一优选例中，所述的恰塔努加链霉菌基因工程菌中，通过同源重组的方法进 行所述的敲除；较佳地，所述菌株的制备方法如下：
[0011] ⑴将预敲除0RF1240/1241基因的核苷酸序列片段导入含有0RF1240/1241基因 的cosmid的出发菌中，得到中间菌，提取所述中间菌的质粒，通过同源重组获得缺失基因 0RF1240/1241 的 cosmid ;
[0012] (2)将0RF1240/1241基因缺失的cosmid接合转导入恰塔努加链霉菌 (Streptomyces chattanoogensis)中，通过同源重组获得0RF1240/1241基因缺失的基因 工程重组菌。
[0013] 在另一优选例中，所述的恰塔努加链霉菌基因工程菌中，所述预敲除 0RF1240/1241基因的核苷酸序列片段的核苷酸序列如SEQ ID N0:2所示；或所述恰塔努加 链霉菌为恰塔努加链霉菌L10。
[0014] 在另一优选例中，所述的预敲除0RF1240/1241基因的核苷酸序列片段即使在适 于表达的条件下，也无法编码有活性的蛋白。
[0015] 在另一优选例中，所述的恰塔努加链霉菌基因工程菌在中国微生物菌种保藏管理 委员会普通微生物中心的保藏号为CGMCC No. 9479。
[0016] 在本发明的另一方面，提供一种制备所述的恰塔努加链霉菌基因工程菌的方法， 所述方法包括：通过同源重组的方法，从恰塔努加链霉菌基因组中敲除0RF1240/1241基 因。
[0017] 在一个优选例中，所述方法如下：
[0018] (1)将预敲除0RF1240/1241基因的核苷酸序列片段导入含有0RF1240/1241基因 的cosmid的出发菌中，得到中间菌，提取所述中间菌的质粒，通过同源重组获得缺失基因 0RF1240/1241 的 cosmid ;
[0019] (2)将0RF1240/1241基因缺失的cosmid接合转导入恰塔努加链霉菌 (Streptomyces chattanoogensis)中，通过同源重组获得0RF1240/1241基因缺失的基因 工程重组菌。
[0020] 在另一优选例中，所述预敲除0RF1240/1241基因的核苷酸序列片段的核苷酸序 列如SEQ ID N0:2所示；或所述恰塔努加链霉菌为恰塔努加链霉菌L10。
[0021] 在本发明的另一方面，提供前面任一所述的恰塔努加链霉菌基因工程菌的用途， 用于生产纳他霉素。
[0022] 在本发明的另一方面，提供一种生产纳他霉素的方法，所述方法包括：
[0023] (1)培养前面任一所述的恰塔努加链霉菌基因工程菌，获得培养产物；
[0024] (2)从培养产物中获得纳他霉素。
[0025] 本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见 的。
【附图说明】
[0026] 图U0RF1240/1241基因敲除工程菌PCR扩增产物的电泳验证图，野生型相应扩增 片段长约1850bp，敲除株相应扩增片段长约1200bp。
[0027] 其中，1为阴性对照，2为0RF1240/1241敲除株外部引物验证，3为野生型外部引 物，4 为 DL2000Marker。
[0028] 图2、0RF1240/1241基因敲除工程菌发酵HPLC图。野生型及敲除株120h发酵液 黄色素检测。
[0029] 其中1#、2#、3#、4#为黄色素，从图上可以看出发酵120h敲除株无黄色素产生。
[0030] 图3、野生型及0RF1240/1241基因敲除工程菌发酵120h发酵液HPLC检测，从图上 可以看出敲除0RF1240/1241基因对纳他霉素产量基本无影响。
【具体实施方式】
[0031] 本发明人致力于利用恰塔努加链霉菌生产纳他霉素，经过深入的研究，首次发现 一类与恰塔努加链霉菌生产纳他霉素过程中产生的杂质的生成有关的基因，将所述基因敲 除之后，可以获得杂质减少、质量提高的纳他霉素产物。在此基础上完成了本发明。
[0032] 如本文所用，所述的"敲除"或"删除"指将目标基因从基因组中删除的技术。
[0033] 如本文所用，所述的"黄色素"或"黄色物质"是指恰塔努加链霉菌生产纳他霉素 过程中产生的化合物杂质，其呈现黄色，这种杂质与纳他霉素共存导致纳他霉素产物成色 不理想，降低产品质量，下游纯化困难。
[0034] 如本文所用，所述的"0RF1240/0RF1241"是指0RF1240基因和0RF1241基因。
[0035] 如本文所述，除非另外说明，所述的"目的基因"是0RF1240基因和0RF1241基因。
[0036] 本发明提供一种经过遗传改造的恰塔努加链霉菌，该菌株中0RF1240基因和 0RF1241基因基本上不表达。所述的"基本上不表达"是指恰塔努加链霉菌基因不表达或 低表达。其中，0RF1240基因和0RF1241基因低表达是指该菌株中0RF1240基因和0RF1241 基因的表达量低于野生型恰塔努加链霉菌的20% ;较佳的是低于野生型恰塔努加链霉菌的 10% ;更佳的是低于野生型恰塔努加链霉菌的5%或更低，最佳的低于2%。
[0037] 0RF1240基因和0RF1241基因基本上不表达的菌株可以通过各种基因抑制、基因 沉默、基因敲除等技术来构建。例如，可以通过基于同源重组的基因敲除技术来将0RF1240 基因和0RF1241基因从染色体上敲除，从而使得0RF1240基因和0RF1241基因缺失；可以针 对0RF1240基因和0RF1241基因设计干扰性RNA或反义核苷酸来使0RF1240基因和0RF1241 基因表达抑制或沉默。
[0038] 作为本发明的优选方式，一种使得0RF1240基因和0RF1241基因缺失的方法是基 因敲除技术，在本发明的优选实施方式中，体外构建用于敲除目的基因的质粒，通过同源重 组的方法，把恰塔努加链霉菌染色体上的0RF1240基因和0RF1241基因敲除。在含阿布拉 霉素的培养基上，可以生长的即为基因组中发生了同源重组的菌株，在其中进行筛选同源 双交换的菌株。
[0039] 当本发明人将0RF1240基因和0RF1241基因与黄色素的生成之间的相关性揭示之 后，本领域人员可以多种方法来对〇RF 1240基因和0RF1241基因进行下调其表达的改造，这 些改造以及改造后获得的菌株均应包含在本发明中。例如，当采取基因敲除的方法来实施 改造时，除了上面详述的基因敲除方法外，本领域技术人员可根据本发明提供的目的基因， 选择0RF1240基因和0RF1241基因上其它的敲除区域（包括在这些区域插入外源片段，或 使这些区域缺失或删除），也可通过插入阿布拉霉素以外的其它片段来实施敲除。此外，也 可引入关键性的突变使得基因表达产物丧失功能，总之，让基因低表达或不表达或表达产 物无活性的方法属于本领域技术人员所掌握的知识，这些方法都可被引入到本发明中。
[0040] 应理解，可采用本领域熟知的各种转化技术将含有预敲除片段的构建物（如质 粒）转入宿主菌中。在优选的实施例中，将质粒电转入宿主菌中。可采用本领域周知的方 法鉴定所转化的宿主菌是否为所需的宿主菌。例如，可采用PCR方法进行鉴定。
[0041] 在本发明的一个具体实施例中，上述敲除恰塔努加链霉菌基因组中的 0RF1240/1241基因通过同源重组的方法实现。更具体地，上述同源重组的方法包括如下步 骤：
[0042] (1)将含有预敲除0RF1240/1241基因的片段导入含有0RF1240/1241基因的 cosmid的出发菌中，得到中间菌，提取所述中间菌的质粒，得到缺失基因0RF1240/1241的 cosmid ；
[0043] (2)将0RF1240/1241基因缺失的cosmid接合转导入恰塔努加链霉菌中，得到 0RF1240/1241基因缺失的基因工程重组菌。
[0044] 上述出发菌按照包括如下步骤的方法制备：将含有0RF1240/1241基因的cosmid 导入大肠杆菌E. coli BW25113/PIJ790中，得到出发菌；上述0RF1240/1241基因缺失的 cosmid通过E. coli ET12567/PUZ8002接合转导入恰塔努加链霉菌中。
[0045] 在具体实施例中，SEQ ID NO: 1所述恰塔努加链霉菌为恰塔努加链霉菌L10。
[0046] 本发明的经过遗传改造的恰塔努加链霉菌，可被应用于生产纳他霉素。实验证明， 该菌株与野生型恰塔努加链霉菌相比，发酵产物不产生黄色物质，方便了纳他霉素的分离 纯化，以及提高了纳他霉素产品质量。
[0047] 下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明 而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条 件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社，2002中所述的条件， 或按照制造厂商所建议的条件。
[0048] 下述实施例中应用的培养基配方如下：
[0049] LB培养基培养：
[0050] 蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 10g，加水定容至1000mL，若为固体培养基则添 加1.5 %琼脂粉。
[0051] 2XYT培养基配方：
[0052] 蛋白胨16g，酵母提取物10g，NaCl 5g，加水定容至1000mL，ρΗ7· 0。
[0053] MS培养基：
[0054] 甘露醇20g，黄豆粉20g，琼脂15g，加水定容至1000mL。
[0055] YEME液体培养基：
[0056] 酵母提取物3g，蛋白胨5g，酵母提取物3g，葡萄糖10g。
[0057] 下述实施例中，0RF1240/1241基因的核苷酸序列如SEQ ID NO: 1。
[0058] 实施例1、PCR-Targeting技术构建0RF1240/1241基因敲除工程菌
[0059] 1、预敲除0RF1240/1241基因的片段获得
[0060] 根据恰塔努加链霉菌0RF1240/1241基因序列以及质粒pHY773的阿布拉霉素抗性 序列设计一对长59nt和58nt的引物（引物1和引物2)，其中引物1包含20nt的阿布拉 霉素抗性基因上游的FRT序列，以及0RF1240/1241基因上游的一段39nt序列，引物2包含 19nt的阿布拉霉素抗性基因下游的FRT序列，以及0RF1240/1241基因下游的39nt的互补 序列。
[0061] 两引物序列如下：
[0062] 引物 1:
[0063] 5' gcggttcaccccccagggccgccgcgaggacgtccagcaATTCCGGGGATCCGTCGAC C 3'（SEQ ID NO :3)
[0064] 引物 2:
[0065] 5' cgaccggtgtcttggcgagcttctcggtttcctgcgcggTGTAGGCTGGAGCTGCTTC 3' （SEQ ID NO :4)
[0066] 以含有阿布拉抗性的质粒pHY773为模板，利用引物1和引物2进行PCR扩增，得 到的PCR产物为用于预敲除0RF1240/1241基因的片段，其核苷酸序列为序列表中的SEQ ID N0:2〇
[0067] 2、含有 0RF1240/1241 基因的 cosmid 转进 E. coli BW25113/PIJ790
[0068] 接种 1% E.coli BW25113/PIJ790 于 5yL 含 25yg/mL 氯霉素的液体 LB 培养基 中，30°C，200rpm培养过夜。取100yL摇匀的菌液接种于10mL含20mM MgS04以及25yg/L 氯霉素的SOB培养基中，30°C，200rpm培养3~4h至0D600约0. 4。离心收取菌体，后用预 冷的灭菌10%甘油吹洗使菌体悬浮并离心再收取菌体，重复洗3次后加入100 μ L预冷的灭 菌10%甘油，混合均匀后取5(^1^加入电击杯中，同时加入100即（：〇81^(1::01^1240/1241 混勾，电转化仪200 Ω，25 μ mF，2. 5KV电转4ms。电转后立即加入lmL预冷的液体LB培养 基30°C震荡孵育lh。菌液均匀涂布在含有50 μ g/mL氨苄霉素，25 μ g/mL氯霉素的LB固 体培养基上，30°C培养过夜，得到的菌落为转入0RF1240/1241 cosmid的E. coli BW25113/ PIJ790,命名为 Ε· coli BW25113/pIJ790/1240。
[0069] 3、0RF1240/1241 基因缺失的 cosmid 的获得
[0070] 取震荡培养过夜的上述2得到的E. coli BW25113/pIJ790/1240 100 yL于含有 50 μ g/mL氨苄霉素，25 μ g/mL氯霉素的SOB培养基中，加入100 μ L的浓度为1M的L-阿拉 伯糖溶液，30°(：，200印111培养3~411至00600约0.4，菌体用2所述方法离心并10%甘油 洗3次后加50 μ L至电击杯中，并加入100ng步骤1中制备的SEQ ID N0:2片段（预敲除 0RF1240/1241基因的片段），电转化仪200 Ω，25 μ mF，2. 5KV电转4ms。电转后加入lmL预 冷的液体LB培养基0°C震荡孵育lh，菌液均匀涂布在含有50 μ g/mL氨苄霉素，50 μ g/mL阿 布拉霉素的LB固体培养基上，37 °C培养过夜。
[0071] 挑取生长的单菌落，接种LB培养过夜，并抽提质粒，得到的即为0RF1240/1241基 因缺失的cosmid。
[0072] 4、0RF1240/1241基因缺失的恰塔努加链霉菌的构建
[0073] 将 0RF1240/1241 基因缺失的 cosmid 通过 E. coli ET12567/PUZ8002 结合转导进 入恰塔努加链霉菌L10中得到0RF1240/1241基因缺失的天蓝色链霉菌，具体构建如下：
[0074] 将 3 μ L 0RF1240/1241 基因缺失的 cosmid 加入 E. colil2567/PUZ8002 感受态细 胞中，冰上放置30min，42°C热激90s后立即放置冰上2min，加入lmL LB培养基37°C振荡孵 育lh，离心倒上清至约100 μ L涂布在含有50 μ g/mL阿布拉霉素，25 μ g/mL氯霉素，50 μ g/ mL卡那霉素的LB固体培养基上，37°C培养过夜，挑取单菌落于加上述抗生素的10mL液体 LB培养基上，37°C，200rpm培养3~4h至0D600约0. 4。离心收集菌体，等体积无抗生素 LB洗涤2~3次，离心收集菌体，用0. 5mL的2 X YT悬浮菌体。
[0075] 将恰塔努加链霉菌L10的孢子悬浮于0. 5mL的2XYT中，45°C水浴10min，取出冷 却至室温。
[0076] 含有 0RF1240/1241 基因缺失的 cosmid 的 E. colil2567/PUZ8002 悬浮液和链 霉菌孢子悬浮液混合，4000rpm离心收菌体，涂布于MS平板，30°C培养16~20h，后涂布 30"1^萘啶酮酸（3〇11^/1111^和30以1^阿布拉霉素（5〇11^/1111^，30<€培养3天，长出的单菌落 用设计的外部引物（引物4和引物5)进行PCR筛选，验证结果见图1。因此，获得最终的 0RF1240/1241基因敲除工程菌，命名为L10-YPK0。
[0077] 引物 4:
[0078] GCGAGCTTCTCGGTTTCCTG(SEQ ID NO:5)；
[0079] 引物 5:
[0080] CCACACGATGGAGGAGCGCTA(SEQ ID N0:6)〇
[0081] 实施例2、利用0RF1240/1241基因敲除工程菌的生产
[0082] 前述实施例1获得的0RF1240/1241基因敲除工程菌以及野生型菌株，进行如下发 酵：
[0083] YEME培养基接种（50mL三角瓶加10mL培养基，并加入5颗玻璃珠），30°C，200rpm， 24h后转接入新鲜的YEME培养基（50mL三角瓶加10mL培养基，并加入5颗玻璃珠）中，接 种量1 %，30°C，200rpm，发酵96h，取样加5倍体积甲醇震荡30min裂解菌体，离心取上清， 进行HPLC检测。
[0084] HPLC检测方法：A相（水+0· 1 %三氟乙酸），B相（甲醇+0· 1 %三氟乙酸），B相 从10% (Omin)升至100% (30min)。检测器设置：黄色素检测400nm，纳他霉素303nm。色 谱柱：agilent，XDB-C18 柱（5 μπι，4· 6*150mm) 〇
[0085] 0RF1240/1241基因敲除工程菌及野生型发酵液黄色素 HPLC检测见图2,表明 0RF1240/1241基因敲除工程菌确实不产黄色素，而野生型菌株的发酵产物中明显存在黄色 素。因此，本发明的0RF1240/1241基因敲除工程菌可以明显地降低发酵产物中杂质黄色素 含量，使得发酵产物质量显著提高。
[0086] 野生型发酵液纳他霉素的HPLC检测见图3,可见，敲除0RF1240/1241基因对纳他 霉素产量基本无影响。
[0087] 生物材料保藏
[0088] 本发明中的恰塔努加链霉菌（Streptomyces chattanoogensis)，已被中国微生物 菌种保藏管理委员会普通微生物中心（中国，北京）保藏，保藏日期：2014年7月18日，保 藏号：CGMCC No. 9479。
[0089] 在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独 引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可 以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范 围。
【主权项】
1. 一种恰塔努加链霉菌基因工程菌，其特征在于，所述菌株中0RF1240基因和0RF1241 基因不表达。2. 如权利要求1所述的恰塔努加链霉菌基因工程菌，其特征在于，所述菌株的基因组 中敲除了 0RF1240基因和0RF1241基因。3. 如权利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，所述的菌株的基因组中，SEQ ID N0:1 所示的核苷酸序列缺失。4. 如权利要求1所述的恰塔努加链霉菌基因工程菌，其特征在于，通过同源重组的方 法进行所述的敲除；较佳地，所述菌株的制备方法如下： ⑴将预敲除0RF1240/1241基因的核苷酸序列片段导入含有0RF1240/1241基因 的cosmid的出发菌中，得到中间菌，提取所述中间菌的质粒，通过同源重组获得缺失基因 0RF1240/1241 的 cosmid ; (2)将0RF1240/1241基因缺失的cosmid接合转导入恰塔努加链霉菌（Streptomyces chattanoogensis)中，通过同源重组获得0RF1240/1241基因缺失的基因工程重组菌。5. 如权利要求4所述的恰塔努加链霉菌基因工程菌，其特征在于，所述预敲除 0RF1240/1241基因的核苷酸序列片段的核苷酸序列如SEQ ID N0:2所示；或所述恰塔努加 链霉菌为恰塔努加链霉菌L10。6. 如权利要求1所述的恰塔努加链霉菌基因工程菌，其特征在于，所述菌株在中国微 生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏号为CGMCC No. 9479。7. -种制备权利要求1所述的恰塔努加链霉菌基因工程菌的方法，其特征在于，所述 方法包括：通过同源重组的方法，从恰塔努加链霉菌基因组中敲除0RF1240/1241基因。8. 如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述方法如下： ⑴将预敲除0RF1240/1241基因的核苷酸序列片段导入含有0RF1240/1241基因 的cosmid的出发菌中，得到中间菌，提取所述中间菌的质粒，通过同源重组获得缺失基因 0RF1240/1241 的 cosmid ; (2)将0RF1240/1241基因缺失的cosmid接合转导入恰塔努加链霉菌（Streptomyces chattanoogensis)中，通过同源重组获得0RF1240/1241基因缺失的基因工程重组菌。9. 权利要求1-6任一所述的恰塔努加链霉菌基因工程菌的用途，其特征在于，用于生 产纳他霉素。10. -种生产纳他霉素的方法，其特征在于，所述方法包括： (1) 培养权利要求1-6任一所述的恰塔努加链霉菌基因工程菌，获得培养产物； (2) 从培养产物中获得纳他霉素。
【文档编号】C12N15/76GK105985924SQ201510041590
【公开日】2016年10月5日
【申请日】2015年1月27日
【发明人】李永泉, 郭远洋, 宋逸婷, 江辉, 樊伟明, 沈剑锋, 谢华丽
【申请人】浙江震元制药有限公司, 浙江大学