-α^21.9缺失型α-地中海贫血基因检测试剂盒的制作方法

-α^21.9缺失型α-地中海贫血基因检测试剂盒的制作方法
【专利摘要】本发明提供一种可快速检测?α21.9缺失型α?地中海贫血基因型的试剂盒，通过在?α21.9缺失型α?地贫的断裂点上游5’端和下游3端’高保守区分别设计引物21.9?F(即引物A1)和引物21.9?R(即引物A3)，21.9?F结合于α?globin蛋白基因簇的5’端位置，21.9?R结合于α?globin蛋白基因簇的3’端位置，在?α21.9缺失型α?地贫的3’断裂点上游设计正常引物α?F，正常引物α?R与21.9?R序列相同，根据PCR扩增产物电泳条带的大小就可以判断检测样本是?α21.9的纯合子、杂合子或正常样本，使得本发明试剂盒可以直接检测出?α21.9缺失型α?地贫基因缺陷。
【专利说明】
-a21 9缺失型a-地中海贫血基因检测试剂盒
技术领域
[0001] 本发明属于生物与新医药技术领域，设及一种在临床样本中快速检测-O2I'9缺失 型a-地中海贫血基因的试剂盒。
【背景技术】
[0002] 1、关于a-地中海贫血
[0003] a-地中海贫血(Thalassemia, W下简称a-地贫），是一组因 a-珠蛋白链合成减少或 不能合成，Q-链/非Q-链比例失衡为特征的遗传溶血性血红蛋白病。地贫是世界上最常见的 人类单基因遗传血液病之一，被世界卫生组织列入危害人类健康的6种常见病，也是中国南 方各省最常见、危害最大的遗传病。在我国南方O-地贫的高发区，90万人的流行病学调查得 出的总发病率为2.46 %，其中广西、广东、江西、四川和浙江各省（区）的发病率分别为 14.95%'4.11%'2.60%'1.92%和 1.20%。
[0004] 人的曰类珠蛋白基因位于16pl3.3,长约40化，整个a类珠蛋白基因簇共由7个基因 组成，包括4个可编码基因和3个假基因：端粒-C2-恥广恥12-恥[广日2-日广0-着丝粒。珠蛋白族基 因表达受着严格的时空调控，其中C-珠蛋白基因在胚胎期表达，曰2、曰1和0珠蛋白基因在胎儿 和成人期表达。每条染色体各有2个a珠蛋白基因，一对染色体共有4个a珠蛋白基因；大多数 a地贫是由于a珠蛋白基因的缺失所致，少数由基因点突变造成。若仅是一条染色体上的一 个Ct-基因缺失或缺陷，则O-链的合成部分受抑制，称为0+地贫;若有一条染色体上的2个a-基因均缺失或缺陷，称为0?也贫。
[0005] 重型a-地贫是地贫的纯合子状态，其4个a-珠蛋白基因均缺失或缺陷，W致完全 无口-链生成，因而含有Q-链的化A、Hb A2和化F的合成均减少。患者在胎儿期即发生大量 丫链合成丫 4化b S)。化Barl/ S对氧的亲合力极高，造成组织缺氧而引起胎儿水肿综 合症。
[0006] 中间型a-地贫是a呀日a+地贫的杂合子状态，是由3个a-珠蛋白基因缺失或缺陷所造 成，患者仅能合成少量Q-链，其多余的e链即合成化H(04)。化H对氧亲合力较高，又是一种 不稳定血红蛋白，容易在红细胞内变性沉淀而形成包涵体，造成红细胞膜僵硬而使红细胞 寿命缩短。
[0007] 标准型a-地贫(轻型)是a+地贫纯合子或地贫杂合子状态，它仅有2个a-珠蛋白基 因缺失或缺陷，故有相当数量的Q-链合成，病理生理改变轻微。
[000引静止型a-地贫是a+地贫杂合子状态，它仅有一个a-基因缺失或缺陷，a-链的合成 略为减少，病理生理改变非常轻微。
[0009] 根据a基因突变类型分类，地贫主要包括缺失型Q-地贫(DNA片段缺失）、突变型a-地贫(点突变）。我国最常见的缺失类型为-a3' 7、-a4'2、--SEA3种。随着a-地中海贫血机制的进 一步阐明，一些新的基因缺失类型相继被发现，例如一ii'i、-a 2'4、-a2'7、--PiL、--THAi、waa、- 等。
[0010] 自从Long等报道了-Q2I'9缺失型a-地贫W来，陆续有病例被检出。-a"'9缺失型a-地 贫5'断裂点位于a珠蛋白基因簇14373位置(NG_000006.1)，3'断裂点位于a珠蛋白基因簇 36298位置(NG_000006.1)，缺失了长为21926bp的一段序列，并在缺失部分中间插入一段长 29bp的序列。该基因型缺失片段覆盖了部分(2和整个WCi-Was-Wai-Q2基因，还剩余一个完 整的Oi基因，为〇+地贫基因型。该基因型的形成包括如下几个步骤:在a珠蛋白基因簇14370-14372(NG_000006.1 )CTG的复制过程中，与36308-36306(NG_000006.1)的反义序列CTG重 组;然后与 36305-36294(NG_000006.1)的反义序列GGGAAGGGTGGG 结合;之后 14356-14362 的 CCTTCCC和36299-36305的CCTTCCC重组，继续36299之后的复制过程;最后产生了-Q2L 9运个 新的基因型。插入序列TGGGAATAAC的形成发生在14306-14320(NG_000006.1)的正义和反义 序列重组的过程中。TGGG的形成由36297-36294(NG_000006.1)的反义序列重复复制而来， 序列AGCT能使插入序列重新连接到14350-14353(NG_000006.1)。
[0011] 在中国人群中，主要的ae地贫是--SEA和-THAI，主要的〇+地贫(包括缺失型和非缺失 型）是-曰3' 7、-曰4'2、曰^、曰95曰和曰''^由于中国大的人群和华南地区高的携带率，运些试剂盒 可W检测出主要的地贫基因型。然而，稀有地贫基因型会在产前诊断中漏检。
[0012] -Ci2I'9是一个新的缺失型a+地贫基因型，与〇嘴!贫基因型结合会造成化H病。在传 统的地中海贫血筛查过程中，如果一个人带有运种基因型-a 2i'9/aa，通过筛查无法被检测 至1]。如果运个人与带有〇*^基因型的配偶生育一个小孩，应用传统的检测试剂盒就可能导致 错误的产前诊断结果，导致化H病患儿出生。由于大的人群和华南地区高的携带率，在地中 海贫血筛查时，应该仔细检查易患者的血常规数据、高效液相色谱电泳和基因型是否相互 匹配。如果常规筛查结果为一个缺失型或非缺失型的纯合个体，应该考虑该个体是否携带 了-O 2I'9等稀有缺失基因型，W确保分型的准确性。
[0013] 目前，-Q2I'9缺失型a-地贫还没有有效的根治方法，主要W预防为主。因此开展-O 2I'9缺失型a-地贫的检测，提早发现地贫异常基因的携带者对指导婚前及产前诊断具有重 要的意义。但目前尚未有直接检测-O 2I'9缺失型O-地贫的产品。
[0014] 2、现有常见地贫基因检测技术
[0015] 目前对地贫筛查方法主要有血常规测定、红细胞脆性检测、血红蛋白电泳等，运些 方法的共同不足是只能对患者进行初步的地贫筛查，无法对患者基因型进行确诊，而且对 轻型地贫容易漏诊。随着技术的发展，出了基因诊断地贫的方法，主要包括W下几点： southern杂交、多重Gap-PCR、多重连接酶依赖探针扩增技术(MLPA)、PCR-寡核巧酸探针 (ASO)法、实时巧光定量PCR、斑点杂交、直接测序技术等。各种基因诊断技术特点如下：
[0016] (I)Southern印迹杂交-限制性酶谱分析法：曾是a-地贫基因诊断的主要方法，但 由于操作繁琐，所需时间较长，一般只适合研究使用，不适于临床的推广应用。
[0017] (2)WLP(限制性片段长度多态性)连锁分析:其先决条件是在该家庭中至少有一 个患儿或一个正常儿，W前是故也贫产前诊断最常用的方法，限制性片段长度的差异反应了 各种基因型的差异，是一种间接测试法，对部分家系不能诊断，且操作比较繁琐。
[0018] (3)寡核巧酸探针技术:可直接检出受试者的缺陷基因，鉴定出突变基因类型，弥 补了 RFLP连锁分析的不足，可快速简便地检测已知突变的地贫基因（qT和护），为地贫患者进 行基因诊断和产前诊断。该法具灵敏、简便、特异的优点，为地贫点突变基因的诊断提供了 直接而有效的方法，但要求严格的实验条件和相当数量的DNA。
[0019] (4)依赖探针连接扩增技术(MLPA) :MLPA是2002年发展起来的，该方法能对所有的 缺失基因型检测W及未知的基因型开展检测，具有高效、特异，在同一反应管内检测多达45 个不同核酸序列拷贝数变化;常用于a、e-地贫大片段缺失基因型的检测，但由于检测成本 高，操作繁琐，耗时较长，检测流程长达16小时，且需要特殊的仪器设备，一般只用于研究使 用，不便于分子筛查方法的推广应用。
[0020] (5)测序技术:测序技术直接对DNA序列的分析，一直被认为是临床检测的金标准； 目前测序技术面临着标本的处理(核酸提取)扩增标准化认证问题，信号检测、测序平台特 异的出错和纠错问题，W及生物信息学方面可能出现的问题，临床验证程序和标准化问题 等，一直没有有效的解决，因此还未能在临床中推广应用。
[0021] (6)反向斑点杂交(Reverse Dot Blot,RDB)法:运一方法具有灵敏度高、特异性好 和准确性高等优点，目前已广泛应用于a、e-地贫点突变的临床产前诊断和基因诊断。主要 原理:将大量寡核巧酸作为探针固定于固相支持物上，借助碱基互补，与经PCR扩增、与生物 素标记的样本祀分子进行杂交，经化学显色给出杂交信号，通过计算机分析获得信息。运种 方法灵敏，但耗时较长，一般用于点突变检测。
[0022] (7)实时巧光定量PCR巧aqman探针法）：实时巧光定量PCR是目前临床诊断系统最 受欢迎的检测平台，是指在PCR反应体系中加入巧光基团，利用巧光信号累积，实时监测PCR 进程及连续分析扩增相关的巧光信号，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方 法。在地中海贫血检测中，报道的均只局限于一种基因型的检测，工作量大，由于探针需要 进行巧光标记，检测成本高。
[0023] (S)Gap-PCR及其改进的技术：由于其易操作，此技术广泛用于缺失地贫的分子诊 断，在缺失区域两端设计一对引物，正常情况下两引物扩增产物很长不属于扩增的范围，而 出现缺失区域的时候能出现特异性的扩增。1990年Lebo等应用PCR技术检测a-地中海贫血 1 ,Dode和Baysal等应用PCR技术检测a-地中海贫血2。目前市场上WGap-PCR开发的试剂盒 只能检测中国最常见的巧巾缺失型-a 3'7、-a4'2和--SEA，而不能检测-Ci 2I'9等非常见的缺失型 a-地贫。
[0024] 3、现有产品及专利
[0025] 尽管检测地贫的方法和产品很多，但是目前尚未有直接、快速检测-Ci2I'9缺失型地 贫的产品。本公司相关专利为《用于诊断地中海贫血的DNA忍片及其制备方法》（专利号 ZL02117287.0)、《诊断a-地中海贫血的核酸膜条及试剂盒》（专利号化200710074203.5)、 《用于诊断e-地中海贫血的核酸杂交膜条及试剂盒》(专利号化200510034015.0)和《a和朗;也 中海贫血基因检测的核酸膜条及试剂盒》（专利号化201210494748.2)，运些专利和现在本 公司申请发明专利不属于同一个技术平台，与本公司申请发明专利相关的已经公开或者有 权的专利相关统计对比如下，见表1。
[0026] 表 1
[002引
[0029] 目前，我国临床应用的诊断缺失型a地贫的试剂盒均采用多重Gap-PCR技术，主要 针对-SEA、-a3'哺-Q 4'2进行检测，如亚能生物技术(深圳巧限公司、深圳益生堂生物科技有 限公司和广州达安基因公司的Cl-地贫检测试剂盒;广东凯普生物科技股份有限公司基于 PCR与液相忍片杂交法结合开发的单管扩增同时检测a和朗:也中海贫血基因试剂盒也只外加 了口-地贫的巧巾突变基因型（CiEVa 9VaWSa)的检测，-a"'9缺失型a-地贫不在其检测的范 围。
[0030] 现有a-地贫检测产品专利技术中，未见直接进行-Ci2I'9缺失型a-地贫的检测，均只 出现基于一SEA、-a 3'7、-a4'2、一THAI、-a2' 8等的检测技术及方法。
[0031] 4、现有产品及其缺点：
[0032] (1)目前我国临床应用的诊断缺失型a地贫的试剂盒均是基于多重Gap-PCR原理开 发的，实现在同一PCR体系中对多种缺失地贫基因型(--SEVa 3'Va4'2)的检测，如亚能生物 技术(深圳)有限公司、深圳益生堂生物科技有限公司和广州达安基因公司各自开发的O-地 中海贫血检测试剂盒，运些产品均只能实现运巧巾常见的缺失地贫基因型的检测。
[0033] (2)广东凯普生物科技股份有限公司基于PCR与液相忍片杂交法结合开发的单管 扩增同时检测a和故也中海贫血基因试剂盒，包含了 O-地贫的巧巾缺失型和巧巾突变基因型的 检测W及e-地贫的19个点突变位点，而-Q2I'9缺失型a-地贫不在其检测的范围内。
[0034] (3)现有a-地中海贫血检测产品专利技术中，未见直接针对-Q2I'9缺失型a-地贫的 检测。
[0035] (4)目前-O2I'9缺失型a-地贫的检测均是根据现有地贫检测试剂盒检测结果异常， 并结合遗传分析父母基因型来实现的，没有一种快速、直接的用于检测稀有型地贫的方法。

【发明内容】

[0036] 本发明所要解决的技术问题是:提供一种可快速检测-Q2I'9缺失型a-地中海贫血 基因型的试剂盒。
[0037] 为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案为:-a2i'9缺失型a-地中海贫血基 因检测试剂盒，包括PCR反应液，所述PCR反应液包括：
[003引 引物Al,其碱基序列如沈Q ID NO: 1;
[0039] 引物A2,其碱基序列如沈Q ID NO:2;
[0040] 引物A3,其碱基序列如沈Q ID N0:3。
[0041 ]其中，每21体积份PCR反应液中含有：
[0042] 水:6.1体积份；
[0043] 5*Q buffer:5.0体积份；
[0044] 10*(：〇^化〇日(1?〇?8证'6。2.5体积份；
[0045] 5M甜菜碱:2.5体积份；
[0046] DMSO :0.5 体积份；
[0047] 2.5mM dNTP:2.0体积份；
[004引 IOiiM引物Al: 0.5体积份；
[0049] 1 OiiM 引物A2:0.5体积份；
[0化0 ] 1 OiiM引物A3:0.9体积份；
[0051]抓/化 Hots1:a;r-l'aq DNA polymerase:0.5体积份。
[0052]本发明的有益效果在于:通过在-Ci2I'9缺失型a-地贫的断裂点上游5'端和下游3 端'高保守区分别设计引物21.9-F(即引物Al)和引物21.9-R(即引物A3)，21.9-F结合于a-globin蛋白基因簇的5'端位置，21.9-R结合于a-globin蛋白基因簇的3'端位置，在-Q 2I'9缺 失型曰-地贫的3'断裂点上游设计正常引物a-F(即引物A2)，正常引物Q-R与21.9-R序列相 同，根据PCR扩增产物电泳条带的大小就可W判断检测样本是-Q 2I'9的纯合子、杂合子或正 常样本，使得本发明试剂盒可W直接检测出-O"'9缺失型O-地贫基因缺陷，较在产前诊断利 用巢式PCR结合遗传分析操作简单、省时、节约成本，为更全面的进行地贫筛查创造条件，为 婚前、产前检测和孕期胎儿的地中海贫血诊断提供科学的依据。
【附图说明】
[00对图巧本发明实施例1中各引物位置及Gap-PCR检测-a"'9缺失型a-地贫原理图解。
[0054]图2为本发明实施例3中对2例-O2I'9缺失型a-地贫样本检测结果，图中泳道M为 化2000Markers，泳道I、2为(-a"'9)样本，泳道3为阳性质控，泳道4为阴性质控。
【具体实施方式】
[0055] 为详细说明本发明的技术内容、所实现目的及效果，W下结合实施方式并配合附 图予W说明。
[0056] 本发明最关键的构思在于:在-Q2I'9缺失型a-地贫的断裂点上游5'端和下游3端' 高保守区分别设计引物21.9-F(即引物Al)和引物21.9-R(即引物A3)，21.9-F结合于a-globin蛋白基因簇的5'端位置，21.9-R结合于a-globin蛋白基因簇的3'端位置。在-Q 2I'9缺 失型曰-地贫的3'断裂点上游设计正常引物a-F(即引物A2)，正常引物Q-R与21.9-R序列相 同，根据PCR扩增产物电泳条带的大小就可W判断检测样本是-Q 2I'9的纯合子、杂合子或正 常样本。
[0057] 发明人针对本发明试剂盒的PCR体系及PCR增强剂做了大量的筛选与优化工作后， 成功筛选到5XQ buffer与DMSO和甜菜碱的最佳增强剂组合，加入到反应液中进行进一步 的体系优化，最终确定的浓度配方，可针对多重PCR体系中不同GC含量模板达到较高的扩增 效率。
[005引本发明设及的术语和缩略语：
[0059] PCR:Polymerase Qiain Reaction聚合酶链式反应。
[0060] a-地贫:a-地中海贫血的简称(英文thalassemia)，是一组因 a-珠蛋白链合成减少 或不能合成，Q-链/非Q-链比例失衡为特征的遗传溶血性血红蛋白病。
[0061 ] --SEA:东南亚a-地贫，a-珠蛋白基因簇缺失了约20化序列，缺失部分包含日1、曰2基 因。
[0062] -a3'7:为a-地贫的一种，a-珠蛋白基因簇缺失了约3.化b序列，缺失部分包含1/2的 口2和1/2的ai融合基因。
[0063] -a4'2:为a-地贫的一种，a-珠蛋白基因簇缺失了约4.化b序列，缺失部分包含全部 口 2基因。
[0064] -a2'8:为a-地贫的一种，a-珠蛋白基因簇缺失了约2.8化序列，缺失部分包含全部 口 2基因。
[0065] -a2'4:为a-地贫的一种，a-珠蛋白基因簇缺失了约2.Skb序列，缺失部分包含全部 口 1基因。
[0066] --FIL:菲律宾a-地贫，a-珠蛋白基因簇缺失了约32化序列，缺失部分包含日1、曰2基 因。
[0067] -THAI:泰国型a-地贫，口-珠蛋白基因簇缺失了约33. Skb序列，缺失部分包含日1、口2 基因。
[006引 一11'1:中国国内发现的新缺失型a-地贫，a-珠蛋白基因簇缺失了约11.化b序列， 缺失部分包含01、02基因。
[0069] -Q2I'9:为a-地贫的一种，a-珠蛋白基因簇缺失了约21.9化序列，缺失部分包含全 部口2基因。
[0070] 实施例1
[0071] 1、引物的设计及筛选
[0072] 本发明利用文献报道的缺失型引物对收集的临床已知基因型阳性样本进行确认， W此阳性样本作为阳性对照模板，进行引物筛选及PCR程序优化。
[0073] 由于a基因簇之间的高度同源性和高GC含量，采用通常的PCR扩增是很困难的，常 常得不到预期产物或产量低、特异性差，特别是扩增高GC含量重复序列的大片段尤其困难。 其原因可能是由于此类模板烙点高，退火时引物与模板容易形成稳定的二级结构妨碍DNA 聚合酶在模板上的推进，W及模板上可能存在多个非特异性的引物局部复性位点，导致非 特异性扩增，而高GC含量的重复序列扩增又进一步加剧了非特异性扩增的产生。所W在进 行大片段的扩增时，如果模板为高GC含量的重复序列，会出现大量的非特异扩增现象或者 导致PCR反应无法正常进行。为了建立扩增高GC含量的长片段重复序列的有效方法，需要对 引物、Taq酶和反应体系中的促解链剂进行比较和选择。
[0074] 通过研究发现，为了有效地扩增高GC含量的长片段重复序列，引物设计除了要遵 循一般的原则外，还需要特别注意W下规则：1)引物结合部位要尽量远离GC富集区域;2)引 物链中GC含量占50%-70%左右;3)Tm值高于60°C ;4)在能保证PCR扩增的特异性和有效性 条件下，尽量增长引物的长度来提高PCR扩增效率。
[0075] 对人a-globin基因簇序列进行比对分析，-Q2I'9缺失型a-地贫的断裂点位置上游 为 14372-14373位置(Genebank No :NG_000006.1 )，下游为36298-36299位置(Genebank No: NG_000006.1)，在断裂点上游5'端和下游3端'高保守区分别设计引物(21.9-F和21.9-R)， 21.9-F结合于a-globin蛋白基因簇的5'端位置，21.9-R结合于a-globin蛋白基因簇的3'端 位置。在-日"' 9缺失型日-地贫的3'断裂点上游设计正常引物a-F，正常引物Q-R与21.9-R序列 相同。图1为各引物位置及Gap-PCR检测-Q 2I'9缺失型a-地贫原理图解。运样根据PCR扩增产 物电泳条带的大小就可W判断检测样本是-Q 2I'9的纯合子、杂合子或正常样本。如果电泳仅 出现正常条带，表明检测样本无该缺失基因；如果电泳仅出现-O 2I'9条带，表明检测样本为-a"'%纯合子;如果电泳出现正常条带和-a"'緣带，表明检测样本为-a"'%杂合子;如果 电泳没有任何条带，表明扩增失败，没有加入基因组或加入的基因组浓度在检测限W下。
[0076] 本发明的引物需注意：（1)首先，评估各条引物间的兼容性，排除复杂引物二聚体 的产生，降低非特异性扩增，（2)其次，将各条引物的退火溫度控制在同一个溫度范围内，避 免不同退火溫度引起的非特异性扩增和效率高低不等的现象，（3)最终，设计不同长度的扩 增片段对各个目的产物进行区分。最终确定的-O 2I'9缺失型O-地贫检测引物序列见表2。
[0077] 表 2
[0079] 2、PCR增强剂的筛选与优化
[0080] 通过合理设计，选择特异性好的扩增引物，为了达到引物扩增效率更高，本申请还 选择了一批不同的PCR增强剂或热稳定剂进行筛选优化。
[0081] PCR增强剂可增加所需PCR产物的产量或减少非特异性产物。有许多PCR增强剂，原 理各不相同，且不能对所有PCR反应都起作用，根据作用原理可大致分为S类：
[0082] (I)用于扩增高GC含量或形成复杂二级结构的模板(共溶剂）。甜菜碱(betaine)、 二甲基亚讽(DMSO)、甲酯胺(formamide)和甘油等适合于扩增高GC含量和形成复杂二级结 构的模板。
[0083] (2)用于保护DNA聚合酶的活性和稳定性。有的反应中，O.lmg/ml的BSA、0.1-10% 的明胶(gelatin)或非离子型的去污剂，可W解决一些扩增失败的问题，运类试剂可W增加 聚合酶的稳定性，减少试剂在管壁上的吸附。
[0084] (3)用于优化引物和模板的结合。锭离子的添加可W减少引物与模板的错配，提高 反应的特异性，可W让PCR对反应条件的要求更低，很多PC时式剂都包含了 10-20mM的硫酸 锭。
[0085] 本发明先选择商品化的PCR增强剂Qiagen的5XQ buffer进行扩增效率验证，同时 在PCR系统中测试上述几种类型的添加剂(甘油、乙醇、DMS0、甜菜碱等)及各种组合，摸索扩 增目的基因的最佳条件。结果发现:无或单一的添加剂都不能获得目的基因片段，只有当W Qiagen的5 X Q buffer作为主要的PCR增强剂，同时使用DMSO和甜菜碱做辅助增强剂运一组 合体系，并在适当浓度时才能够获得特异产物。因此5 X Q buffer与DMSO和甜菜碱为最佳增 强剂组合，加入到反应液中进行体系优化，最终确定甜菜碱浓度为0.5M和DMSO为2 %时扩增 效果最佳。
[0086] 3、引物浓度W及反应体系其他组分浓度确定
[0087] 引物终浓度范围在0.1-1咖，1旨亂终浓度选择1.511^-911^，等浓度的四种脱氧；憐 酸腺巧（dATP、dGTP、dCTP、dTTP)混合液dNTP终浓度选择1 OOnM-SOOnM，DNA聚合酶终浓度选 择1-7.5IU/反应，利用正交试验方法，通过大量实验对比，最终确定最优的PCR反应液配方 见表3。
[0088] 表 3 「AAOn1
[0090] 注:DNA加样量为化L，总反应体积为25化。
[0091] 4、PCR反应条件的确定
[0092] 本试剂采用常规PCR体系。反应条件分W下步骤优化：
[0093
[0094
[0095
[0096] 退火溫度和退火时间对PCR扩增效率和特异性扩增影响较大，上述条件优化结果 显示退火溫度偏低会有非特异性扩增条带，导致假阳性结果;溫度偏高扩增效率偏低，灵敏 度下降。本实验通过控制退火溫度和退火时间可W做到对其他基因型无非特异性扩增，特 异性好，扩增效率局，灵敏度可达lOng/yL。
[0097] 5、本发明用于缺失基因型的检测过程依次包括如下步骤：
[0098] (1)提取待检测样品DNA:从外周血白细胞、绒毛或羊水细胞提取基因组DNA，浓度 在10-500ng。
[0099] (2)PCR扩增：W提取的基因组DNA为模板进行PCR扩增，得到扩增产物。
[0100] (3)电泳检测鉴定PCR产物:取PCR扩增中的产物3. 点样于1.2 %的琼脂糖胶外 加0.005%核酸染料;在5V/cm电压下电泳约40分钟，取出于凝胶成像系统里观察结果并拍 照保存。
[0101] (4)结果判读:-Q2I'9缺失型a-地贫扩增产物长度96化P，正常基因型扩增产物长度 1598bp。如果电泳仅出现正常条带，表明检测样本无该缺失基因；如果电泳仅出现-Q 2I'9条 带，表明检测样本为-O2I'9的纯合子;如果电泳出现正常条带和-O 2I'9条带，表明检测样本为-曰2I'9的杂合子;如果电泳没有任何条带，表明扩增失败，没有加入基因组或加入的基因组浓 度在检测限W下。
[0102] (5)对检测为阳性的PCR产物进行直接测序验证，测序用引物为扩增用引物。
[0103] 实施例2
[0104] 本发明试剂盒对临床样品的检测情况
[010引使用本发明试剂盒对临床300例样本进行检测，结果2例为-a"'9缺失型a-地贫杂 合子，与测序结果进行对比，阳性符合率和阴性符合率均为100%，准确率达100%，本发明 试剂盒检测临床样本检测结果见表4,本发明试剂盒检测结果和测序结果对比统计结果见 表5。
[0106]表4
[0107]






[0114]
[0115]
[0116]
[0117]注:测序结果中阳性是指本发明试剂盒检测范围内基因型阳性，阴性是指本发明 试剂盒检测范围之外的其他基因型样本阳性或者阴性。
[011引本广品的性能指柄;：
[0119] (1)灵敏度:使用本发明试剂盒对10例-O2I'9缺失型O-地贫临床阳性样本进行灵敏 度分析，每个样本包含7个浓度梯度，确定各基因型能够稳定检出的基因组DNA最低浓度为 lOng/jil^;
[0120] (2)准确性：用10例-a"'9缺失型a-地贫临床阳性样本和20例临床阴性样本，选择 高、中、低3个浓度，每个浓度重复3次，分别用3批产品来检测，分别计算阳性符合率和阴性 符合率。结果显示相应的基因型，研究结果与测序结果完全符合，产品阳性符合率和阴性符 合率都达100 %;
[0121] (3)特异性:通过干扰筛查试验，临床正常剂量的构祿酸钢、EDTA不是本品的干扰 物质；服用过去铁胺的病人的样本用本品检测时不影响检测结果，说明去铁胺不是本品的 干扰物质；溶血样本（即使是完全溶血)不会干扰本试剂盒检测结果;脂血样本中甘油=醋 和黄痘样本中总胆红素的浓度分别为13. Smmo 1 /L和359.2祉mo 1 /L，均已达到临床的极高水 平，却对本品检测无干扰，所W当甘油S醋《13. Smmo 1 /L或总胆红素《3 59.28WHO1 /L对本 试剂盒的检测结果均无干扰，不是本品的干扰物质;肝素钢是本品的外源性干扰物质，干扰 效果评价试验结果表明，按15IU肝素钢抗凝ImL血液比例处理的全血样本不适用于本试剂 盒。用本产品检测8例本产品检测范围外的临床样本，包括1例a-地贫阴性样本(aa/aa)、3例 0-地中海贫血临床样本(41-42M/N、654M/N和-28M/N各1例）、1例G-6-PD临床样本、1例缺铁 性贫血临床样本、1例感染弓形虫的全血样本和1例乙肝病毒DNA临床样本，前7例结果均为 阴性，乙肝病毒DNA样本结果为无信号，即8例均无交叉反应。
[0122] (4)重复性:不同批号产品，不同人(2人)操作，一天做2次，共做2天，每次试验每个 参考品重复3次检测。在不同实验条件下能多次重复稳定检测a-地贫基因型，结果显示一 致。
[0123] (5)稳定性:本发明试剂盒在有效期内使用完全可满足W上各指标。
[0124] 实施例3
[0125] 本发明试剂盒的临床应用
[0126] 1、预期用途
[0127] 对a-地中海贫血中的稀有基因型-Ci2I'9缺失型a-地贫进行检测，为地贫的遗传筛 查提供可靠的依据。在临床应用中，当使用传统地中海贫血检测试剂盒(检测--564，-〇 3'哺-曰4'2)检测结果为一SEA纯合，但是患者为成人或临床表现为化H病，a地贫点突变(检测aESa、 Q9VaWScO未检出，做遗传分析时，患者双亲只有一方携带一SEA基因，而另一方无-SEA基因， 可W进行-Q 2I'9缺失型Q-地贫的检测。同时，该试剂盒也可W用作-Q2I'9缺失型Q-地贫的大规 模人群筛查。
[012引 2、检验原理
[0129] 本试剂盒是基于PCR结合琼脂糖凝胶电泳的技术原理，在-O2I'9缺失型a-地贫断裂 点上下游位置相对保守区域进行特异性的扩增，实现对-O 2I'9缺失型a-地贫的检测。
[0130] 3、主要组成成分如表6
[0131] 表6
[0132]
[0133] 4、适用仪器
[0134] PCR基因扩增仪：ABI 9700、黑马9600、C1000Touch? Thermal 切Cler(Bio-RAD); 电泳仪:Powe巧ac Basic(Bio-RAD);凝胶成像分析系统:UV-3C(珠海黑马）。
[0135] 5、储存条件及有效期
[0136] 储存条件:试剂盒避光储存于-18°C W下，避免反复冻融。
[0137] 有效期:6个月。
[013引 6、样本要求
[0139] (1)本试剂盒样本来源为抗凝全血，所用抗凝剂为构祿酸钢或邸TA,不能使用肝素 抗凝。
[0140] (2)样本采集:抽取静脉血l-5mL入含有抗凝剂的管中，标记好样本信息。
[0141] (3)血样保存:抗凝全血在室溫放置不超过24小时，2-8°C保存不超过一个月，-18 °C W下保存不超过两年，-70°C可长期保存，冷冻保存时应避免反复冻融。
[0142] (4)血样运输:抗凝全血运输时需用冰壶或泡沫箱加冰袋密封，应保证冰袋不化 冻，且在途时限不宜超过72小时。
[0143] 7、检验方法
[0144] 7. IDNA的提取
[0145] 本试剂盒对人基因组DNA的提取方法没有指定要求，一般可用实验室常规方法 (酪-氯仿抽提法)或试剂盒提取人基因组DNA，推荐使用亚能生物技术(深圳)有限公司的全 血DNA提取试剂盒。若采用亚能生物技术(深圳)有限公司的全血DNA提取试剂盒，直接按说 明书加样;若用酪-氯仿或其它方法提取DNA，则要测定DNA浓度，必要时进行浓缩或稀释，将 DNA浓度调整至10-200ngAiL后才能进行检测实验。
[0146] 7.2PCR 扩增
[0147] 取出试剂盒的PCR反应液，在管壁或管盖上做好标记，于SOOOrpm短暂离屯、，然后分 别加入已提取的待测样本DNA化L，反应总体系为25化，设置阴、阳性对照，短暂离屯、后置于 PCR检测仪中进行扩增。
[0148] 扩增超序化下：
[0149]
[0150] 7.3电泳检测:取3.化L扩增产物直接点样电泳（已加电泳染料），1.2%的琼脂糖胶 外加适量核酸染料;5V/cm电压下电泳40分钟，电泳结束后，取出于凝胶成像系统里观察结 果并拍照保存。
[0151] 7.4实验成立条件的设定
[0152] (1)本产品要求每次检测都应设置一个阳性质控，W监测扩增条件，结果应为电泳 出现96化P条带。若无带，则说明实验失败，提示PCR扩增失败，应重新做检测。
[0153] (2)本产品要求每次检测都应设置一个阴性质控，W对污染进行监测，阴性质控的 结果应为电泳没有条带。若阴性质控有一条或多条带，则提示本次实验有污染，应消除污染 后重新检测。
[0154] (3)结果判读:-a2i'9缺失型a-地贫扩增产物长度96化p，正常基因型扩增产物长度 1598bp。如果电泳仅出现正常条带，表明检测样本无该缺失基因；如果电泳仅出现-Q2I'9条 带，表明检测样本为-O2I'9的纯合子;如果电泳出现正常条带和-O2I' 9条带，表明检测样本为-曰2I'9的杂合子;如果电泳没有任何条带，表明扩增失败，没有加入基因组或加入的基因组浓 度在检测限W下。检测结果如图2所示，泳道M为化2000Markers，泳道1、2为(-Q 2I'9)样本，泳 道3为阳性质控，泳道4为阴性质控。
[0K5] 8、检验结果的解释
[0156] 8. IPCR扩增没有产物：
[0157] (1)确认DNA提取及PCR过程无操作失误；
[015引 （2)提取的样品DNA浓度过低，PCR时应增力邮NA用量；
[0159] (3)患者基因型在本试剂盒检测范围外，本试剂盒无扩增。
[0160] 8.2扩增产物浓度太高：建议降低电泳检测时的上样量或者选取较大的点样孔进 行电泳。
[0161] 9、检验方法的局限性
[0162] 本试剂盒只检测-Ci2I'9缺失型a-地贫，作为a-地贫诊断的补充。其他稀有突变基因 型可结合相应的检测试剂盒或测序进行检测。
[0163] 10、产品性能指标
[0164] (1)灵敏度:使用本发明试剂盒对10例-O2I'9缺失型O-地贫临床阳性样本进行灵敏 度分析，每个样本包含7个浓度梯度，确定各基因型能够稳定检出的基因组DNA最低浓度为 IOng/化；
[0165] (2)准确性：用10例-a"'9缺失型a-地贫临床阳性样本和20例临床阴性样本，选择 高、中、低3个浓度，每个浓度重复3次，分别用3批产品来检测，分别计算阳性符合率和阴性 符合率。结果显示相应的基因型，研究结果与测序结果完全符合，产品阳性符合率和阴性符 合率都达100 %;
[0166] (3)特异性:通过干扰筛查试验，临床正常剂量的构祿酸钢、EDTA不是本品的干扰 物质；服用过去铁胺的病人的样本用本品检测时不影响检测结果，说明去铁胺不是本品的 干扰物质；溶血样本（即使是完全溶血)不会干扰本试剂盒检测结果;脂血样本中甘油=醋 和黄痘样本中总胆红素的浓度分别为13. Smmo 1 /L和359.2祉mo 1 /L，均已达到临床的极高水 平，却对本品检测无干扰，所W当甘油S醋《13. Smmo 1 /L或总胆红素《3 59.28WHO1 /L对本 试剂盒的检测结果均无干扰，不是本品的干扰物质;肝素钢是本品的外源性干扰物质，干扰 效果评价试验结果表明，按15IU肝素钢抗凝ImL血液比例处理的全血样本不适用于本试剂 盒。用本产品检测8例本产品检测范围外的临床样本，包括1例a-地贫阴性样本(aa/aa)、3例 0-地中海贫血临床样本(41-42M/N、654M/N和-28M/N各1例）、1例G-6-PD临床样本、1例缺铁 性贫血临床样本、1例感染弓形虫的全血样本和1例乙肝病毒DNA临床样本，前7例结果均为 阴性，乙肝病毒DNA样本结果为无信号，即8例均无交叉反应。
[0167] (4)重复性:不同批号产品，不同人(2人)操作，一天做2次，共做2天，每次试验每个 参考品重复3次检测。在不同实验条件下能多次重复稳定检测a-地贫基因型，结果显示一 致。
[0168] (5)稳定性:本发明试剂盒在有效期内使用完全可满足W上各指标。
[0169] 11、注意事项
[0170] (1)本试剂盒只用于体外检测。
[0171] (2)在运输过程中会有PCR反应液附着在管壁/盖上，因此请在使用前先离屯、，W保 证PCR反应体系的体积及防止潜在的污染。
[0172] (3)PCR Mix所含指示剂在扩增前有色差属正常现象，不影响扩增。
[0173] (4)保存溫度-18°CW 下。
[0174] W上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发 明说明书及附图内容所作的等同变换，或直接或间接运用在相关的技术领域，均同理包括 在本发明的专利保护范围内。
[0175：
【主权项】
1. -α21·9缺失型α-地中海贫血基因检测试剂盒，其特征在于:包括PCR反应液，所述PCR反 应液包括： 引物A1，其碱基序列如SEQ ID N0:1; 引物A2,其碱基序列如SEQ ID N0:2; 引物A3,其碱基序列如SEQ ID N0:3。2. 根据权利要求1所述的-α21·9缺失型α-地中海贫血基因检测试剂盒，其特征在于:每21 体积份PCR反应液中含有： 水:6.1体积份； 5*Q buffer:5.0体积份； 10*CoralLoad PCR BufTer:2.5体积份； 5M甜菜碱:2.5体积份； DMS0:0.5体积份； 2.5mM dNTP:2.0体积份； 1(^]?引物厶1:0.5体积份； 1(^]?引物厶2:0.5体积份； ΙΟμΜ引物A3:0.9体积份； 5U/yL Hotstar-Taq DNA polymerase:0.5体积份。
【文档编号】C12Q1/68GK105861661SQ201610232332
【公开日】2016年8月17日
【申请日】2016年4月14日
【发明人】李印淑, 未纪涛, 刘晶晶, 刘福平, 郑瑜
【申请人】亚能生物技术（深圳）有限公司