专利名称：鸡传染性贫血病检测试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及鸡传染性贫血病检测试剂盒，特别是一种用PCR方法快速诊断鸡传染性贫血病的检测试剂盒。
背景技术：
鸡传染性贫血是由鸡贫血病毒(Chicken infectious anemia virus，CIAV)引起的鸡病。鸡贫血病毒是一个新的病毒科一圆环病毒科的代表，可引起小鸡严重贫血，皮下肌肉出血，骨髓内成红细胞受到破坏，淋巴细胞，特别是胸腺萎缩。目前，鸡贫血病已被当作重要的世界性禽病。
目前常用的CIAV检测方法主要有以下几种(一)血清学检测方法如荧光抗体试验和酶联免疫吸附试验，可检测血清样品中的CIA特异性抗体及其效价，以及CIA疫苗的免疫效果。但由于抗体产生的滞后性，此法不能精确反映鸡群CIA即时感染状况。在酶联免疫吸附试验中需大量生产高度纯化的CIAV抗原，成本较高。
(二)组织学检测方法1、中和试验可检测CIAV病原或抗体，敏感性及特异性都较强，但耗时长，一般需几天时间；2、斑点杂交法可检测CIAV病原，特异性强，但操作繁琐；3、聚合酶链式反应(PCR反应)可检测CIAV病原，敏感性和特异性很强(参见文献B.W.Calnek etl，Diesases of Poultry(tenth edition).749和文献Todd，D，.K.A.Maawhinney，and M，S.McNulty.1992.Detection and differentiantion ofchicken anaemia virus isolates by using the polymerase chain reaction.J ClinMicrobiol 301661-1666)。但现有技术的PGR反应操作中需用有机溶剂，如用苯酚、氯仿等提取DNA，以去除蛋白，这些有机溶剂具有毒性，会造成环境污染，并影响操作人员健康。且反应液中各种试剂成分需要单独保存，反应液必须在使用时现配，携带、贮存和操作均较为繁琐。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种用PCR方法快速诊断鸡传染性贫血病的检测试剂盒，该试剂盒中的检测试剂使用方便，不造成环境污染。特别是制备抽提样品DNA模板的提取液和制备包含针对鸡传染性贫血病毒(chicken infectious anemia virus CIAV)的特异性引物(primers)并可进行PCR反应的反应液。
PCR(聚合酶链反应)技术利用病毒DNA在不同温度下变性和复性的原理，在适当的反应条件下，能使目的DNA的拷贝数几乎呈几何级数增长，20次PCR循环将产生100万倍的扩增产物，使样品中痕量存在病毒粒子经PCR反应变为肉眼可见的结果。
本发明提供的鸡传染性贫血病检测试剂盒，包括有组织DNA提取液、PCR反应液、TaqDNA聚合酶及CIAV PCR阳性对照模板。
所述组织DNA提取液是由三羟甲基氨基甲烷、乙二胺四乙酸、十二烷基磺酸钠、蛋白酶K和RNA酶(RNaseA)组成。
所述PCR反应液是由三羟甲基氨基甲烷、氯化钾(KCl)、氯化镁(Mgcl2)、辛基苯氧基聚乙氧乙醇、脱氧核苷三磷酸及CIAV特异性引物组成。
所述CIAV PCR阳性对照模板是经过抽提的CIAV标准毒株CUX-1株的基因组DNA，可直接用于PCR反应并作为检测PCR反应正常与否的标记。
所述CIAV特异性引物是根据发表的CIAV基因组序列设计，上下游引物分别位于基因组358bp和1042bp处，引物序列分别为5′-ATACTCGAGGCGGTCCGGGTGGATGC-3′及5′-GGTGCGGCCGCCTCACACTATACGT-3′，扩增片段大小为684bp。
所述Taq DNA聚合酶(Thermus aquaticus)是由大肠杆菌中提纯的基因工程酶，具有依赖于聚合作用的5‘-3’的外切酶活性，缺乏3‘-5’外切酶活性。
经敏感性和特异性试验证实，使用本发明的试剂盒对疑似CIAV感染鸡的组织病料进行检测，敏感性可达1fg/μl，大约相当于100个CIAV基因组拷贝。对于其它鸡常见病原，无论DNA病毒或RNA病毒，还是细菌，反应结果均为阴性，证明该试剂盒特异性较强。整个检测过程可在5小时内完成。
在检测人工感染鸡传染性贫血病毒雏鸡试验中，经与斑点杂交法比较表明用本发明的试剂盒进行检测，比斑点杂交法(dot blot hybridization)的敏感性高100倍，反应时间缩短30个小时。
具体实施例方式实施例1鸡传染性贫血病检测试剂盒成分30ml组织DNA提取液、5mlPCR反应液、100μl Taq酶、100μl阳性对照DNA。
组织DNA提取液保存于4℃，其它组分需保存在-20℃。有效期为10个月。
实施例2鸡传染性贫血病检测试剂盒的制备
(一)组织DNA提取液1.基础液1mol/L三羟甲基氨基甲烷(Tris，PH8.0)溶液在800ml水(H2O)中溶解121.1克三羟甲基氨基甲烷，加入浓盐酸(Hcl)调节PH值至8.0。加水定容至1000ml，高压15磅、20分钟灭菌，室温保存待用。
0.5mol/L乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid EDTA PH8.0)溶液在800ml水中加入186.1克二水乙二胺四乙酸二钠(EDTA-Na·2H2O)，在磁力搅拌器上剧烈搅拌，用氢氧化钠(NaOH)调节PH值至8.0(约需20克NaOH颗粒)然后定容于1000ml，高压15磅、20分钟灭菌，室温保存待用。
20％十二烷基磺酸钠(sodium dodecyl sulfatepolyacrylamide，SDS)溶液在900ml水中溶解200克电泳级SDS，加热至68℃助溶，加入几滴浓盐酸(HCL)调节溶液的PH值至7.2，加水定容于1000ml，室温保存待用。
200mg/ml蛋白酶K溶液将200mg蛋白酶K溶于10ml水中，-20℃保存待用。
10mg/ml胰RNA酶A(RNaseA)溶液将50mg胰RNA酶A(RNaseA)溶于5ml RNA酶贮存缓冲液中，于100℃加热15分钟，缓慢冷却至室温，分装成小份于-20℃保存待用。RNA酶贮存缓冲液在800ml水(H2O)中溶解1.21克三羟甲基氨基甲烷(10mmol/L)，8.77克氯化钠(Nacl，15mmol/L)加入浓盐酸(Hcl)调节PH值至7.5。加水定容至1000ml，高压15磅、20分钟灭菌，室温保存待用。
2.组织DNA提取液取2ml 1mol/L三羟甲基氨基甲烷(Tris，PH8.0)溶液(终浓度20mmol/L)；2ml0.5mol/L乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid EDTA PH8.0)溶液(终浓度10mmol/L)；50ml 20％十二烷基磺酸钠(sodium dodecyl sulfatepolyacrylamide，SDS)溶液(终浓度10％)；0.2ml 200mg/ml蛋白酶K溶液(终浓度400μg/ml)；20μl 10mg/ml胰RNA酶A(RNaseA)溶液(终浓度2μg/ml)，加水定容至100ml，4℃保存待用。每个样品用300μl组织DNA提取液。
(二)CR阳性模板1.材料和方法病毒；CIAV病毒Cux-1标准株，经鸡马立克淋巴瘤细胞系(MDCC-MSB1)增殖后，由本实验室-40℃保存。
实验鸡1日龄SPF雏鸡，由中国兽药监察所实验动物中心提供。
2.病毒回鸡实验病毒准备将感染CIAV病毒Cux-1株的鸡马立克淋巴瘤细胞培养物，冻融三次，加等量氯仿充分振摇混匀，经3000rpm、20分钟离心后，取上清液于70℃水浴5分钟，3000rpm、20分钟离心后上清液经0.22μm滤膜过滤，分装后冻存备用。
回鸡实验取1日龄SPF雏鸡10只，每只大腿内侧肌注CIAV病毒液0.2ml，饲养于隔离器内。攻毒后第16天剖杀取留肝脏。
3.样品处理所取肝脏经组织研磨器研磨后加入PBS制成20％乳浊液，经反复3次冻融后10000rpm，5分钟离心，取上清液用于抽提DNA。
4.DNA提取上述样品取0.25ml，加入等体积的抽提缓冲液(20mM Tris-Cl(pH7.4)，200mM EDTA，40mM RNase，1％SDS)，37℃作用1hr，然后加入200μg/ml蛋白酶K，56℃消化2hr，分别用苯酚、苯酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)、氯仿各抽提一次，经乙醇沉淀后溶于10μl10mMTE(pH8.0)中。每次PCR反应取1μl作为阳性模板。
(三)PCR反应液1.10倍羟甲基氨基甲烷(Tris，PH9.0)缓冲盐溶液在80ml水(H2O)中溶解1.211克三羟甲基氨基甲烷(Tris，0.1mol/L)，加入浓盐酸(Hcl)调节PH值至9.0。溶解3.728克氯化钾(Kcl，0.5mol/L)；304.95克氯化钾(Mgcl·6H2O，15mol/L)，1ml TritonX-100(1％)加水定容至100ml，室温保存待用。
2.CIAV特异性引物根据发表的CIAV基因组序列设计一对引物，上下游引物分别位于基因组358bp和1042bp处，由上海生工生物工程公司合成，扩增片段大小为684bp。
引物序列分别为5′-ATACTCGAGGCGGTCCGGGTGGATGC-3′分子量＝8437 摩尔数＝195nmol溶于1950μl水中(终浓度10nmol/ml)，-20℃保存。
5′-GGTGCGGCCGCCTCACACTATACGT-3′分子量＝8112.5摩尔数＝20.25nmol溶于2025μl水中(终浓度10nmol/ml)-20℃保存。
10mM脱氧核苷三磷酸(depxunucleoside triphosphate，dNTP)市售10mM脱氧核苷三磷酸混合液，其中包括dATP，dCTP，dATP，dTTP各2.5Mm.购自北京希尔诚生物工程有限公司。-20℃保存待用。
4.PCR反应液取2ml 10倍羟甲基氨基甲烷(Tris，PH9.0)缓冲盐溶液，CIAV特异性引物各0.8ml，10mM脱氧核苷三磷酸(depxunucleoside triphosphate，dNTP)0.8ml，加水定容至20ml，-20℃保存待用，每个样品用50μl PCR反应液。
(四)Taq DNA聚合酶(Thermus aquaticus)为市售国产商品化酶，购自北京希尔诚生物工程有限公司。-20℃保存待用。
实施例3鸡传染性贫血病PCR诊断试剂盒操作方法
1.取2克(黄豆大小)待检病料(肝脏、脾脏)放入1.5ml离心管充分研究磨后用适量PBS稀释，5000rpm×5分钟离心，取300μl上清液加入等量DNA提取液，56℃消化2小时，95℃灭活10分钟后迅速冷却；2.10000rpm×5分钟离心，取上清液，转入另一个1.5ml离心管，加入两倍体积预冷的无水乙醇(实验室常规试剂，-20℃冻存)沉淀后，10000rpm×5分钟离心；3.去除上清液，加入50μl PCR反应液以及1μl Taq酶，轻弹管壁混匀后加入50μl(约两滴)液体石蜡。置于PCR仪上进行扩增反应；每次反应需设置阳性对照及阴性对照。本试剂盒提供阳性对照模板，每次反应取1μl加入50μl PCR反应液以及1μl Taq酶；阴性对照为50μl PCR反应液以及1μl Taq酶；反应程序为经94℃、5min变性后，进行94℃、1min→55℃；1min→72℃、2min共30个循环，最后经72℃、5min延伸后结束；4.用1％琼脂糖凝胶、40v电压、20min电泳检测。阳性样品应呈现一条0.68Kb的DNA条带，与阳性对照样品一致，阴性对照样品无条带。
实施例4鸡传染性贫血病PCR诊断试剂盒敏感性和特异性试验1.材料与方法1.1病毒CIAV病毒Cux-1标准株，于MDCC-MSB1细胞上增殖后备用。
1.2SPF试验鸡1日龄SPF雏鸡饲养于隔离器内，顶部皮下接种CIAV病毒Cux-1标准株，至16日龄出现典型症状时剖杀，分别取胸腺、骨髓、脾脏、肝脏、法氏囊、肾脏、血凝白细胞和粪便供检测用。
1.4模板DNA提取感染鸡不同组织分别取少量充分研究磨后用适量PBS稀释，5000rpm×5分钟离心，取300μl上清液加入等量DNA提取液，56℃消化2小时，95℃灭活10分钟，迅速冷却后，10000rpm×5分钟离心，取上清液，用两倍体积预冷的无水乙醇沉淀后，10000rpm×5分钟离心，除去上清液，沉淀溶于50μl反应液中。CIAV感染细胞按同样方法提取细胞毒DNA。
1.5PCR反应条件及程序将溶有样品DNA的50μl PCR反应液转移至PCR反应管中，加入Taq酶1μl，混匀后上覆2滴体石蜡油，置PCR仪上反应。具体程序为经94℃、5分钟变性后，进行94℃、1分钟→55℃；1分钟→72℃、2分钟共30个循环，最后经72℃、5分钟延伸后结束。每一组参加PCR反应的检测样品，必须包含有一个阳性对照(1μl阳性模板+50μl PCR反应液)和一个阴性对照(50μl PCR反应液)。
1.6电泳1.0％琼脂糖凝胶，40V电压，每个反应取10μl，电泳25分钟，294nm波长紫外线灯观察结果。当阳性对照扩增出特异性条带，而阴性对照未扩增出任何条带时，说明此组PCR扩增结果可信；当检测样品扩增出与阳性对照大小相同且无非特异性条带时，说明此检测样品被CIAV感染。反之说明未被感染。
1.6敏感性将Cux-1标准株感染细胞抽提核酸用水进行10倍系列稀释，不同稀释度核酸样品分别作为模板进行PCR反应，以能扩增出特异性条带的最高稀释度判定敏感性。
1.7特异性分别以含扩增片段的重组质粒、Cux-1株细胞毒、SR43株细胞毒、MDCC-MSB1细胞，及其它病原鸡新城疫病毒(NDV)、鸡马立克氏病病毒(MDV)、鸡传染性法氏囊病病毒(IBDV)、鸡传染性支气管炎病病毒(IBV)、减蛋综合症病毒(EDSV)和大肠杆菌核酸为模板进行PCR反应，检测扩增片段的特异性。
1.7实验感染鸡不同组织的检测取CIAV实验感染鸡不同组织样品，如肝脏、脾脏、胸腺、法氏囊、骨髓、肾脏、白细胞和泄殖腔棉拭等，分别提取模板DNA，进行PCR检测。
2.结果2.1PCR反应的敏感性CIAV Cux-1标准株感染细胞毒抽提核酸初浓度稀释为1ng/μl，经10×系列稀释至0.01fg/μl。结果显示肉眼可见条带的最低浓度为1fg/μl。
2.2PCR反应的特异性PCR结果显示，含扩增片段的重组质粒，Cux-1标准株及SR43分离株感染细胞毒核酸均能扩增出明显的特异性条带，而MDCC-MSB1细胞核酸、其它禽常见病原NDV、MDV、IBDV、IBV、EDSV及E.coli核酸扩增结果均为阴性。说明该PCR方法特异性较强。
2.3实验感染鸡不同组织样品检测PCR检测结果显示，肝脏、脾脏、胸腺、骨髓、法氏囊、肾脏、白细胞和泄殖腔棉拭等各组织样品为模板均能扩增出特异性条带，扩增条带的亮度强弱可反映不同组织样品中的CIAV含量。
目前CIA的诊断方法主要有病毒的分离培养、血清学方法和分子生物学方法。鉴于病毒分离培养费时费力，血清学方法常用于检测抗体，因而研究者更倾向于应用省时省力、准确性和敏感性均较高而组织病毒含量的高低。其中肝脏和脾脏扩增条带的亮度最高。且能直接检测抗原的分子生物学方法。核酸杂交和PCR方法在CIAV诊断中报道较多，与核酸杂交相比，PCR方法加省时省力，而且敏感性提高10-100倍，因而在CIAV诊断中得到广泛的应用。
在此PCR方法中，我们选用CIAV核衣壳蛋白VP1基因作为扩增的目的片段，因该基因为CIAV主要结构蛋白基因，在CIAV不同毒株间序列相对保守，因而扩增该片段有助于检测CIAV不同毒株，同时我们也可利用扩增的基因进行结构分析和蛋白表达，对CIAV防治也具有意义。
本试剂盒中PCR反应的敏感性可达1fg/μl，大约相当于100个CIAV基因组拷贝，这在所有可见报道的PCR方法中也是较高的，因而不但可用于检测CIAV感染MDCC-MSB1细胞培养物，而且可用于检测感染鸡组织样品。在该PCR方法特异性试验中，我们选用鸡常见病原，既有DNA病毒，又有RNA病毒，还有细菌，反应结果均为阴性，证明该方法特异性较强，完全可用于野外混合感染组织样品的检测。
实施例5本发明试剂盒PCR方法和斑点杂交法在检测人工感染鸡传染性贫血病毒雏鸡试验中的比较1.材料和方法1.1病毒CIAV病毒Cux-1标准株，为本室保存。
1.2试验鸡1日龄SPF雏鸡，由中国兽药监察所实验动物中心提供。
1.3攻毒试验1.3.1病毒准备将已知CIAV病毒Cux-1株攻毒鸡所采肝脏剪碎，用组织研磨器充分研磨后加0.01MPBS(pH7.4)制成20％(W/V)的肝乳液，冻融三次，加等量氯仿充分振摇混匀，经3000rpm、20分钟离心后，取上清液于70℃水浴5分钟，3000rpm、20分钟离心后上清液经0.22μm滤膜过滤，分装后冻存备用。
1.3.2攻毒试验取1日龄SPF雏鸡75只，分成2组，实验组50只，每只大腿内侧肌注CIAV病毒液0.2ml，饲养于一隔离器内；对照组25只，每只肌注PBS 0.2ml，饲养于另一隔离器中。攻毒后每隔4天剖鸡采样一次，1个月后每隔7天采样一次。实验组鸡每次剖杀4只，分别取血液、胸腺、脾脏、肝脏、肾脏、法氏囊、骨髓和泄殖腔棉拭子；对照组每次剖杀2只，同样采取组织样品。
1.4样品处理雏鸡心脏采血5ml，加抗凝剂，1000rpm，1分钟离心，吸取白细胞层用于抽提DNA；各取小块组织脏器分别研磨后加入PBS制成20％乳浊液，经反复3次冻融后10000rpm*5分钟离心，取上清液用于抽提DNA；用棉拭子刮取泄殖腔少量分泌物，溶于PBS中，用于抽提DNA。
1.5PCR检测按上述PCR试剂盒操作方法操作。
1.6斑点杂交1.6.1DNA提取上述样品分别取0.25ml，加入等体积的抽提缓冲液(20mM Tris-Cl(pH7.4)，200mM EDTA，40mM RNase，1％SDS)，37℃作用1hr，然后加入200μg/ml蛋白酶K，56℃消化2hr，分别用苯酚、苯酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)、氯仿各抽提一次，经乙醇沉淀后溶于10mM TE(pH8.0)中。
1.6.2核酸探针制备将PCR阳性模板扩增产物经苯酚∶氯仿∶异戊醇抽提，乙醇沉淀后溶解于纯水中，直接用于地高辛标记。参照Boehringer Manheim公司标记试剂盒操作程序进行。
1.6.2.1探针特异性分别将PCR阳性产物，Cux-1株组织毒，其它病原NDV、MDV、IBDV、IBV、EDSV和大肠杆菌核酸点于醋酸纤维(NC)膜上与探针进行杂交，检测探针的特异性。
1.6.2.2探针敏感性将PCR阳性产物和Cux-1株组织毒抽提核酸用TE缓冲液进行10倍系列稀释，不同稀释度核酸样品分别点于NC膜上与探针进行杂交，检测探针的敏感性。
1.6.3实验感染鸡不同组织样品检测取CIAV实验感染鸡肝脏、脾脏、胸腺、法氏囊、骨髓、肾脏、白细胞和泄殖腔棉拭等不同组织抽提的DNA，分别点于NC膜上与标记探针进行dot blotting，检测实验感染雏鸡CIAV的动态分布。
2.结果2.1组织病理学变化 实验攻毒后第12天开始出现明显的组织病理学变化，胸腺出现萎缩，骨髓开始变黄，其它脏器变化不明显，第16天时病理变化及其显著，胸腺全部萎缩，骨髓也变成黄色，同时脾脏和法氏囊也出现稍微萎缩，至攻毒后第24天病变逐渐不明显，28天后肉眼观察完全恢复正常，这与文献报道的结果(1)是相符的。
2.2PCR检测结果攻毒后第4天即可从不同脏器中检出CIAV-DNA，至第16天检出率达到高峰(90％)，24天时检出率下降至50％，然后于32天时检出率又增至近80％，随后检出率逐渐降低，而60天时检出率再次升高至近80％.从不同脏器的检出率来看，胸腺和脾脏最高，其次是肾脏、骨髓，肝脏、白细胞、法氏囊次之，泄殖腔棉拭检出率最低。结果见表1.
2.3斑点杂交检测结果2.3.1特异性探针只与PCR阳性产物和Cux-1株组织毒杂交呈明显阳性斑点，而与其它病原核酸杂交均未出现斑点，证明探针具有特异性。
2.3.2敏感性探针对PCR阳性产物的敏感度可达1pg/μl，对Cux-1株组织毒核酸敏感度为100pg/μl。
2.3.3实验感染鸡不同组织样品检测自感染后第8天可从胸腺、脾脏和骨髓中检出CIAV-DNA，至20天时检出率最高(45％)，然后下降至10％，28天时升至22％，然后又逐渐下降，39天时降至0，随后又逐渐上升，至53天时为31％.从不同脏器看，胸腺和脾脏检出率最高，其次为骨髓和肝脏，肾脏、法氏囊、白细胞和泄殖腔棉拭检出率较低。结果见表2.这与PCR的检测结果基本一致，只是检出率明显低于PCR方法。
两种检测方法均显示免疫器官依然是CIAV的主要靶器官，胸腺和脾脏在各种组织中检出率最高，因而应是临床检测中的首选样品。泄殖腔棉拭在临床应用中比较简单易行，可对饲养鸡进行普查，然而因其只有在感染高峰时检出率较高，因而尚不能代替组织样品的检测。
从PCR和斑点杂交两种检测方法比较看，PCR方法明显敏感性高，操作简便省时，可在较短时间内鉴定结果；斑点杂交方法特异性强，但操作较繁琐。
表1 人工感染后不同天数组织中CAV-DNA的PCR检测结果组织 4 8 12 16 20 24 28 32 39 46 53 60合计阳性率肝脏 2/43/44/45/53/52/42/42/43/44/42/43/4 35/5070％脾脏 2/43/44/45/55/52/43/44/43/44/44/44/4 43/5086％胸腺 2/44/44/45/55/52/43/44/43/44/44/44/4 44/5088％肾脏 1/42/44/45/54/52/43/44/42/44/43/42/4 36/5072％法氏囊1/43/44/45/54/52/42/42/42/43/41/42/4 31/5062％骨髓 3/44/44/45/55/51/42/44/42/41/42/44/4 37/5074％白细胞2/44/44/45/55/53/42/44/42/40/42/43/4 36/5072％泄殖腔1/42/43/43/51/51/40/41/42/42/41/42/4 19/5038％合计 14/32 25/32 31/32 38/40 32/40 15/32 17/32 25/32 19/32 22/32 19/32 24/32阳性率44％ 78％ 97％ 95％ 80％ 47％ 53％ 78％ 59％ 69％ 59％ 75％
表2 人工感染后不同天数组织中CAV-DNA的斑点杂交检测结果组织4 8 12 16 20 24 28 32 39 46 53 60 合计阳性率肝脏0/40/41/40/54/51/41/40/40/41/41/42/411/5022％脾脏0/43/42/44/55/51/43/41/40/41/41/42/423/5046％胸腺0/43/42/45/54/51/43/42/40/41/41/43/425/5050％肾脏0/40/40/40/50/50/40/41/40/41/43/41/46/50 12％法氏囊 0/40/40/40/50/50/40/40/40/40/42/40/42/50 4％骨髓0/42/42/44/54/50/40/40/40/41/41/40/414/5028％白细胞 0/41/40/41/51/50/40/40/40/40/40/40/43/50 6％泄殖腔 0/40/40/40/50/50/40/40/40/40/41/40/41/50 2％合计0/32 9/32 7/32 14/40 18/40 3/32 7/32 4/32 0/32 5/32 10/32 8/32阳性率 0 28％ 22％ 35％ 45％ 9％22％ 13％ 0 16％ 31％ 25％
权利要求
1.一种鸡传染性贫血病检测试剂盒，包括有组织DNA提取液、PCR反应液、Taq DNA聚合酶及CIAV PCR阳性对照模板。
2.根据权利要求1所述的检测试剂盒，其中所述组织DNA提取液是由三羟甲基氨基甲烷、乙二胺四乙酸、十二烷基磺酸钠、蛋白酶K和RNA酶(RNaseA)组成。
3.根据权利要求1或2所述的检测试剂盒，其中所述PCR反应液是由三羟甲基氨基甲烷、氯化钾(KCl)、氯化镁(Mgcl2)、辛基苯氧基聚乙氧乙醇、脱氧核苷三磷酸及CIAV特异性引物组成。
4.根据权利要求1～3中任一项权利要求所述的检测试剂盒，其中所述CIAV PCR阳性对照模板是经过抽提的CIAV标准毒株CUX-1株的基因组DNA。
5.根据权利要求3所述的检测试剂盒，其中所述CIAV特异性引物是分别位于基因组358bp和1042bp处上下游的引物，其序列分别为5′-ATACTCGAGGCGGTCCGGGTGGATGC-3′5′-GGTGCGGCCGCCTCACACTATACGT-3′。
全文摘要
一种用PCR方法快速诊断鸡传染性贫血病的检测试剂盒，包括有组织DNA提取液、PCR反应液、Taq DNA聚合酶及CIAV PCR阳性对照模板。使用本发明的试剂盒进行鸡传染性贫血病检测，特异性较强，对于其它鸡常见病原反应结果均为阴性；敏感性可达1fg/μl；整个检测过程可在5小时内完成。
文档编号C12Q1/68GK1510149SQ0215790
公开日2004年7月7日 申请日期2002年12月20日 优先权日2002年12月20日
发明者杨兵, 王金洛, 徐福洲, 宋维平, 陈小玲, 杨 兵 申请人:北京市农林科学院畜牧兽医研究所