专利名称：来源于猪的断奶后多系统消耗综合症病毒的制作方法
技术领域：
本发明总的来说涉及病毒。更具体地说，本发明涉及从表现断奶后多系统消耗综合症(PMWS)的猪体内分离出来的新的猪环状病毒(PCV)的分离和鉴定。
猪环状病毒(PCV)对猪造成广泛影响，且具有高度传染性。最初检测到的PCV认为是猪肾(PK15)细胞系的非致细胞病变性污染物。目前已经将PCV分类为一种新的病毒家族环状病毒科。这些病毒很小，无包膜物质，具有单链环DNA基因组。
已经在一定范围的动物种类中鉴定了多种环状病毒，包括PCV、鸡贫血病毒(CAV)、鹦鹉的喙和羽毛病病毒(BFDV)，植物病毒包括三叶草地下阻碍生长病毒(SCSV)、椰子叶腐烂病毒(CFDV)和香蕉串顶端病毒(BBTV)。对于目前认识的环状病毒，看来似乎不存在DNA序列同源性或共同的抗原决定簇。Todd等(1991)Arch.Virol.117:129-135。
已经显示环状病毒家族的成员导致贫血、免疫缺陷相关疾病，并且在体外感染巨噬细胞。也就是最近发现PCV涉及PMWS。参见，例如，Ellis等(1998)加拿大兽医杂志(Can.Vet.J.)39:44-51和Gopi等(1997)加拿大兽医杂志38:385-386。然而，由于PCV在猪群中普遍存在，对PCV与PMWS的病因学关系提出了质疑。另外，用来源于污染PK15细胞培养物的PCV接种物对猪进行的试验性感染没有引起临床疾病。参见，例如，Tischer等(1986)Arch.Virol.91:271-276。
猪的感染物质，尤其是病毒，不仅深重影响着畜牧业，而且由于应用猪器官对人进行异种移植的兴趣不断增长，故给人带来潜在的公共健康危险。以前诊断PMWS病一直基于组织病理学检查。因此，有必要改善诊断PMWS-相关病原存在的方法，以及预防PMWS病。
发明简述本发明基于一种新病毒的发现，本发明中该病毒被称为“PCVⅡ型”或“PCVⅡ”，其从受PMWS侵袭的猪崽的匀浆组织中分离出来。该病毒的特征在于它与从持续感染的PK15细胞中得到的非致病性猪环状病毒(本发明中称为“PCVⅠ型”或“PCVⅠ”)具有共同的特征。克隆了新PCV变异体的全长DNA基因组，PCVⅡ412，以及其它几种PCVⅡ分离体，并对它们进行了测序。这些DNA序列的片段可以用作探针诊断临床样品中是否存在该病毒，以及分离该病毒的其它天然存在的变异体。PCVⅡ基因组序列的明了也使病毒基因组开放读码框中编码各种蛋白质的多肽序列得以利用，使制备这些肽或其片段成为可能，而这些肽或其片段可用作诊断试验中的标准品或试剂和用作疫苗的成分。还可以由这些蛋白质生产保护性抗体，可以制备单克隆或多克隆形式的抗体。
因此全PCVⅡ序列的提供使下述多肽的设计和构建成为可能，所述多肽可以用作疫苗或诊断试剂，或者用作制备用于抗PMWS主动免疫治疗的单克隆抗体(Mab)制剂的中间体，或者用作制备用于诊断试剂的抗体的中间体。
因此，一方面本发明涉及用于制备PCVⅡ诊断试剂和疫苗的来源于PCVⅡ基因组的多核苷酸。在一个具体实施例中，多核苷酸能够选择性地与PCVⅡ核苷酸序列杂交，并且含有来源于或互补于图4A-4C(SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12和24)描述的PCVⅡ序列的至少大约8个连续核苷酸。在另一个实施方式中，多核苷酸编码一种免疫原PCVⅡ多肽，其与选自来源于(a)ORF 1(SEQID NO:3)、(b)ORF 2(SEQ ID NO:9)、(c)ORF 3(SEQ IDNO:7)、(d)ORF 4(SEQ ID NO:20)、(e)ORF 5(SEQ ID NO:21)、(f)ORF 6(SEQ ID NO:5)、和(g)含有至少约5个氨基酸的(a)-(f)的免疫原性片段多肽之一的多肽具有至少约85％的等同性。在一个优选的具体实施方式
中，多核苷酸编码ORF 6(SEQID NO:5)的多肽，或其免疫原片段。
因此本发明涉及应用这些多核苷酸序列或其部分作为寡核苷酸探针，用于制备能够作为诊断试剂或疫苗抗原的肽，以及用于诊断和治疗疾病的多克隆和单克隆抗体。
本发明的其它方面包括表达系统，其能够实现由来源于全基因组序列编码的所需蛋白质的生产；含有该系统或其部分的重组载体；用该载体转化的重组宿主细胞；由转化细胞生产的蛋白质；以及由该蛋白质制备的疫苗。另外，本发明涉及由基因组编码的代表表位的肽序列，以及共价连接与标记或载体蛋白质的该序列。本发明还包括PCVⅡ基因组的各种ORF，以及由这些ORF编码的蛋白质，和其片段。
本发明还涉及制备多肽组合物例如疫苗和免疫诊断组合物、以及免疫球蛋白的方法，还涉及免疫分析法和含有引物、探针、多肽、和/或免疫球蛋白的分析试剂盒。在一个实施方式中，本发明涉及检测生物样品中PCVⅡ抗体的方法，包括(a)提取生物样品；(b)将生物样品与上述免疫原PCVⅡ多肽在使PCVⅡ抗体(如果存在于生物样品中)结合PCVⅡ多肽的条件下反应，以形成抗体/抗原复合物；和(c)检测是否存在该复合物，由此检测样品中存在或缺乏PCVⅡ抗体。
在另一个实施方式中，本发明涉及检测生物样品中PCVⅡ同源序列的核酸杂交分析，包括(a)将生物样品与权利要求1的多核苷酸在促进多核苷酸和存在于生物样品中PCVⅡ核酸之间形成核酸复合物的条件下保温；和(b)检测含有多核苷酸的复合物。
当结合附图阅读本发明的下列详细描述后，将会更完全地理解本发明的上述和其它方面和特征。
附图简述
图1是PCVⅡ412的示意图，显示开放读码框的定位。
图2A-2C描述了PCVⅡ412基因组的核苷酸序列(SEQ ID NO:1)。两条链均被显示。也显示了如所示ORF 1(SEQ ID NO:3)；ORF 2(SEQ ID NO:9)；ORF 3(SEQ ID NO:7)；ORF 4(SEQ IDNO:20)；ORF 5(SEQ ID NO:21)；ORF 6(SEQ ID NO:5)的各种ORF对应的翻译产物的氨基酸序列。
图3A-3D是来源于PCVⅡ412开放读码框与从PK15细胞中分离出的PCVⅠ相应开放读码框的氨基酸序列比较。图3A显示PCVⅡ412ORF 1(上线，SEQ ID NO:3)与PCVⅠ的相应ORF(下线，SEQ IDNO:4)的氨基酸序列比较。图3B显示PCVⅡ412的ORF 6(上线，SEQ ID NO:5)与PCVⅠ的相应ORF(下线，SEQ ID NO:6)的氨基酸序列比较。图3C显示PCVⅡ412的ORF 3(上线，SEQ ID NO:7)与PCVⅠ的相应ORF(下线，SEQ ID NO:8)的氨基酸序列比较。图3D显示PCVⅡ412的ORF2(上线，SEQ ID NO:9)与PCVⅠ的相应ORF(下线，SEQ ID NO:10)的氨基酸序列比较。
图4A-4D是各种PCV分离体的核苷酸序列来源于PK15细胞的PCVⅠ(SEQ ID NO:2):PCVⅡ412(SEQ ID NO:1):PCVⅡ9741(SEQ ID NO:11):PCVⅡB9(SEQ ID NO:12，SEQ ID NO:24)。
图5显示用于检测PCV感染的多重PCR结果。该分析即鉴定了PCV感染，又鉴别了存在的PCVⅠ和PCVⅡ。1道是分子量标记。2-4道依次是PCVⅡ对照、PCVⅠ对照和阴性对照。5-13道是从PMWS-感染畜群的猪崽体内收集的血样。
图6显示对来源于PMWS-感染猪崽的各种组织样品进行的多重PCR的结果。1道两排是分子量标记。2道上排是阳性PCVⅡ对照，而3道是阴性对照。其余道是从PMWS-感染猪崽中收集的各种组织样品。
详细描述本发明的实践将应用，除非另有说明，分子生物学、微生物学、重组DNA技术、和免疫学的常规方法，它们均在本领域技术范围内。这些方法在文献中有充分描述。参见，例如Sambrook,Fritsch和Maniatis，分子克隆试验室指南，第Ⅰ、Ⅱ和Ⅱ卷，第二版(1989)；DNA克隆，第Ⅰ和Ⅱ卷(D.N.Glover编，1985)寡核苷酸合成(M.J.Gait编，1984)核酸杂交(B.D.Hames和S.J.Higgins编，1984)；动物细胞培养(R.K.Freshney编，1986)；固定化细胞和酶(IRL出版社，1986)；Perbal,B.，分子克隆操作指南(1984)；系列，酶学方法(S.Colowick和N.Kaplan编，Academic Press,Inc.)；和试验免疫学手册，第Ⅰ-Ⅳ卷(D.M.Weir和C.C.Blackwell编，1986,Blackwell Xcientific Publications)。在详细描述本发明之前，应当理解本发明不限于如所指的具体DNA、多肽序列或处理参数，当然可以改变。还应当理解，本发明使用的专有名词目的仅在于描述本发明的具体实施方式
，不是意图限制。
必须注意到，如本说明书和后附的权利要求中用到的，单数形式的“a”、“an”和“the”包括复数指示物，除非上下文已经清楚地有相反指示。因此，例如，提及的“一种抗原(an antigen)”包括两种或多种抗原的混合物。提及的“一种赋形剂(an excipient)”包括两种或多种赋形剂的混合，等等。
全文使用下列氨基酸简写丙氨酸Ala(A) 精氨酸Arg(R)天冬酰胺Asn(N)天冬氨酸Asp(D)半胱氨酸Cys(C)谷氨酰胺Gln(Q)谷氨酸Glu(E) 甘氨酸Gly(G)
组氨酸His(H)异亮氨酸Ile(I)亮氨酸Leu(L)赖氨酸Lys(K)蛋氨酸Met(M)苯丙氨酸Phe(F)脯氨酸Pro(P)丝氨酸Ser(S)苏氨酸Thr(T)色氨酸Trp(W)酪氨酸Tyr(Y)缬氨酸Val(V)A．定义除非另有说明，本发明使用的所有技术和科学术语与本发明涉及领域的常规技术人员通常理解的含义相同。虽然一些类似于或等同于本发明所述的方法和材料可以用于本发明的实践，但优选的材料和方法是本文描述的那些。
在描述本发明时，将用到下列术语，试图如下所述定义它们。
术语“PCVⅡ蛋白”“PMWS蛋白”或编码它们的核苷酸序列，应当分别是这样的蛋白质或核苷酸序列，它们来源于本发明所述的新的PCVⅡ分离体。几种PCVⅡ分离体的核苷酸序列在图4A-4B中显示，对应的六种被鉴定的PCVⅡORF的氨基酸序列在图2A-2C中显示。然而，本发明定义的PCVⅡ或PMWS蛋白、或编码它们的基因不限于上述序列。
另外，如本发明中用到的，“来源于”PCVⅡ基因组或其互补物的核苷酸序列指为期望目的保留例举多核苷酸的基本特性，代表其来源全序列的一部分的序列。一种具体的，但非限定的该衍生物的例子由这样一种序列代表，其编码相同或基本相同氨基酸序列，但因为密码简并性，使用不同的具体密码；另一个例子是与病毒DNA互补的序列。诊断试验中使用的探针或寡核苷酸必须保留所示序列的互补性，但可以比全序列短或可以删除其一部分。然而，对于操作或表达应用，通常需要改变核苷酸，以产生或删除限制性位点，提供加工位点，或以不产生不利效果功能的方式改变编码的氨基酸序列。术语“核苷酸序列”和“多核苷酸”均指核糖核酸和脱氧核糖核酸序列，包括基因组链和其互补序列。
因此“来源于”含有PCVⅡ分离体基因组的核苷酸序列的序列指其包括基因组核苷酸序列相应(或它互补链)区的序列，或用与该期望用途相同领域的已知方法改进的所述序列区段的组合。当然，这些序列不一定是物理来源于所述基因的核苷酸序列，而是指这样的多核苷酸，即通过基于由其来源区段中的碱基序列提供的信息的任何方式产生的多核苷酸。例如，典型DNA序列“来源”的区段包括编码特异表位的区段。同样地，“来源于”PCVⅡORF的肽指基本上等同于这些多肽或其部分的氨基酸序列，并具有与该部分具有同样生物学特性的氨基酸序列。
而且，衍生的蛋白质或核苷酸序列不一定物理来源于上述基因，而可以通过任何方式产生，包括例如，基于本发明提供的信息化学合成、分离(例如，从PCVⅡ分离体)或通过重组生产。另外，该术语意在指与该基因编码的连续氨基酸序列基本上具有氨基酸序列同源性(如下文的定义)，并表现免疫学活性的蛋白质。
因此，该术语意指全长序列、以及免疫原性的、截短的和部分序列，以及该蛋白质的活性类似物或前体形式。该术语还包括该具体基因的核苷酸片段，包括该基因的至少约8个连续碱基对，更优选至少约25到50或75或更多的连续碱基对。该片段用作下面将要充分探讨的诊断方法，和重组蛋白质生产的探针。
该术语还包括天然形式的蛋白质，或制剂模式的碱性或酸性附加盐形式。该酸性附加盐可以涉及游离氨基，碱性盐可以通过游离羧基形成。下面将进一步探讨药物可接受的碱性或酸性附加盐。另外，可以将蛋白质与其它生物材料，例如脂类和糖组合，或通过侧链修饰，例如氨基的乙酰化、羟基侧链的磷酸酯化、巯基的氧化、氨基酸残基的糖化，以及其它对被编码的一级序列的修饰，来改进该蛋白质。
因此该术语意指该序列的缺失、添加和取代，只要该多肽能够发挥功能，产生本发明所述的免疫应答。在这点上，特别优选的取代通常是本质上保守的，即，在一族氨基酸之间发生的取代。例如，通常将氨基酸分成四族(1)酸性——天冬氨酸和谷氨酸氨；(2)碱性——赖氨酸、精氨酸、组氨酸；(2)非极性——丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、色氨酸；和(4)无电荷极性——甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸。苯丙氨酸、色氨酸、和酪氨酸有时被分类为芳香氨基酸。例如，可以理所当然地预测这样的分离取代亮氨酸到异亮氨酸或缬氨酸，反之亦然；天冬氨酸到谷氨酸，或相反；苏氨酸到丝氨酸或相反；或者用类似的结构相关氨基酸进行的氨基酸保守取代将不会对生物活性产生重大影响。与参照分子具有基本上相同的氨基酸序列，但含有少量氨基酸取代的蛋白质基本上不会影响蛋白质的免疫原性，因此该蛋白质在参照多肽的定义范围内。
“开放读码框”或“ORF”是编码一种多肽的多核苷酸序列区域。
至于“断奶后多系统消耗综合症”或“PMWS”指一种脊椎动物，特别是猪的疾病，其临床特征在于体重逐渐减轻、呼吸急促、呼吸困难和黄疸。其病理改变包括淋巴细胞到肉芽肿的间质性肺炎、淋巴结病，和，不常发生的淋巴细胞到肉芽肿的肝炎和肾炎。参见，例如，Clark,E.G.,Am.Assoc.Swine Pract.1997:499-501；和Harding,J.Am.Assoc.Swine Pract.1997:503。
“分离”的核酸分子是从自然界中发现该分子的完整生物体中分离或分泌出的核酸分子；或缺失通常与其天然形式相关的全部或部分序列的核酸分子；或这样一种序列，它天然存在，但具有与此相关的异源序列(如下定义)。
术语“疫苗组合物”意指含有抗原的任何药物组合物，该组合物可以用于预防或治疗受体的疾病或病症。因此该术语包括如下所述的两种亚单位疫苗，以及含有完全杀死、减毒或灭活的微生物。
至于“亚单位疫苗组合物”指含有至少一种免疫原性多肽，但不是所有抗原，来源于或同源于来自相关病原体抗原的组合物。该组合物基本上无完整病原体细胞或颗粒，或者细胞或颗粒的溶解物。因此，“亚单位疫苗组合物”由来自病原体的至少部分纯化(优选基本上纯化)的免疫原性多肽，或者其重组类似物制备。亚单位疫苗组合物可以包括亚单位抗原或基本上没有来自病原体的其它抗原或多肽的相关抗原。
术语“表位”指特异于B细胞和/或T细胞应答的抗原或半抗原上的位点。该术语还可以与“抗原决定簇”或“抗原决定位点”相互替换。可以用显示一种抗体阻断另一种抗体结合目标抗原能力的简单的免疫分析法鉴定识别相同表位的抗体。
对一种组合物或疫苗的“免疫应答”指在宿主体内形成细胞和/或抗体介导的对相关组合物或疫苗产生的免疫应答。通常，“免疫应答”包括但不限于一种或多种下列作用特异性地对包括相关组合物或疫苗的一种或多种抗原产生抗体、B细胞、辅助T细胞、抑制T细胞、和/或细胞毒性T细胞和/或γδT细胞。优选，宿主将表现治疗性或保护性免疫应答，以至于对新感染的抗性将被增强和/或疾病的临床严重度将被降低。该保护作用将通过感染的宿主通常表现症状的降低或缺乏，感染宿主较短的恢复时间和/或较低的病毒效价证明。
术语“免疫原性”蛋白质或多肽指诱导上述免疫应答的氨基酸序列。本发明提到的“免疫原性”蛋白质或多肽包括蛋白质的全长序列、其类似物、或其免疫原性片段。“免疫原性片段”指包括一种或多种表位，因此能够诱导上述免疫应答的蛋白质片段。该片段可以应用本领域已知的很多表位作图技术鉴定。参见，例如，分子生物学方法中的表位作图方案，第66卷(Glenn E.Moris，编，1996)Humana Press,Totowa,New Jersey。例如，可以通过例如，在固相支持物上同时合成大量肽，该肽对应蛋白质分子的一部分，使肽与抗体反应而肽仍然贴附于支持物，来确定线型表位。该技术是本领域已知技术，描述于例如美国专利4,708,871；Geysen等(1984)美国国家科学院科学进展81:3998-4002；Geysen等(1986)分子免疫学23:709-715。同样，可以通过确定氨基酸的空间构象，例如，通过X-射线晶体学和2-维核磁共振简单地鉴定构象表位。参见，例如，表位作图方案，同上。
上述概念还包括合成抗原，例如，多表位、旁侧表位、核其它重组的或合成的衍生抗原。参见，例如，Bergmann等(1993)欧洲免疫学杂志23:2777-2781；Bergmann等(1996)免疫学杂志157:3242-3249；Suhrbier,A(1997)免疫和细胞生物学75:402-408；Gardner等(1998)第12届世界AIDS会议，Geneva,Switzerland，1998年6月28日-7月3日。
用于本发明目的的免疫原性片段通常该分子包括至少约3个氨基酸，优选至少约10-15个氨基酸，更优选25或更多氨基酸。对于该片段的长度没有严格的上限，其可以包括几乎全长蛋白质序列，或甚至含有两种或多种蛋白质表位的融合蛋白质。
“天然”蛋白质或多肽指从蛋白质自然发生的来源分离出来的蛋白质或多肽。“重组”多肽指通过重组DNA技术制备的多肽；即，从用编码所需多肽的外源DNA构建体转化的细胞中制备的多肽。“合成”多肽是通过哈合成制备的多肽。
“载体”是一种复制子，例如质粒、噬菌体、或粘粒，其中另一种DNA片段可以贴附于其上，以使贴附片段发生复制。
DNA“编码序列”或“核苷酸序列编码”的特定蛋白质是在体外或体内处于适当调控元件的控制之下被转录和翻译成多肽的DNA序列。编码序列的界限通过5′(氨基)末端的起始密码和3′(羧基)末端的翻译终止密码确定。编码序列可以包括但不限于，原核细胞序列、来自真核细胞mRNA的cDNA、来自真核细胞(例如，哺乳动物)的基因组DNA序列，以及合成的DNA序列。转录终止序列通常定位于编码序列的3′端。
DNA“控制元件”指启动子、核糖体结合位点、多腺苷酸化信号、转录终止序列、上游调控区、增强子等的总称，其总体提供编码序列在宿主细胞中转录和翻译。不是所有这些控制序列都必须总是存在于重组载体中，只要所需的基因能够被转录和翻译即可。
“有效地连接”指元件的排列，其中所述成分如此布局以至能发挥它们的常规功能。因此，控制元件有效地连接于编码序列能够实现编码序列的表达。控制元件不必与编码序列相邻，只要它们发挥指导其表达的功能。因此，例如，启动子和编码序列之间可以插入不翻译但转录的序列，启动子仍然能够认为是“有效地连接”于编码序列。
控制元件，例如启动子，“指导编码序列在细胞中的转录”，其中RNA聚合酶将结合启动子，编码序列将被转录成mRNA，其然后翻译成由编码序列编码的多肽。
“宿主细胞”是被外源核酸分子转化的，或能够转化的细胞。
当该外源DNA被导入细胞膜内部，则细胞被外源DNA“转化”。外源DNA可以，也可以不整合(共价连接)到构成细胞基因组的染色体DNA中。例如，在原核细胞和酵母中，外源DNA可以保留在游离基因元件(例如质粒)上。对于真核细胞，稳定转化细胞是一种外源DNA已经整合到染色体上，以至其经染色体复制被遗传到子代细胞中的细胞。这种稳定性通过真核细胞建立包括含有外源DNA的子代细胞群的细胞系或集落的能力证明。
“同源性”指两种多核苷酸或两种多肽之间的等同百分率。当两种DNA，或两种多肽序列在分子的指定长度之间表现至少约80-85％、优选至少约90％，最优选至少约95-98％序列等同性时，则二者彼此“基本上同源”。如本发明提到的，基本上同源还指与特定DNA或多肽序列完全相同的序列。
可以通过直接比较两种分子之间的经排列序列后的序列信息，计录两种排列序列之间完全匹配的数目，除以较短序列的长度，得到的结果再乘以100。方便提供的计算机程序可以用于辅助分析，例如ALIGN,Dayhoff,M.O.(蛋白质序列和结构图集，M.O.Dayhoff编，5增刊，3:353-358，国家生物医学研究基因，Washington,DC)，其对Smith和Waterman((1981)，应用数学进展(Advances in Appl.Math.)2:482-489)的用于肽分析的局部同源性运算法则进行了改编。确定核苷酸序列等同性的程序在Wisconsin序列分析包，8版(来自Genetics Computer Group,Madison,WI)中提供，例如，BESTFIT、FASTA和GAP程序，也依赖于Smith和Waterman运算法则。这些程序应用生产商推荐的和在上面指出的Wisconsin序列分析包中描述的缺省参数，易于使用。
或者，可以通过在同源区域之间形成稳定双链的条件下使多核苷酸杂交，然后用单链特异性核酸酶消化，确定消化片段的大小来确定同源性。基本上同源的DNA序列可以在Southern杂交试验中，在，例如，该特定系统定义的严紧条件下，鉴定。确定合适的杂交条件在本领域技术技术范围内。参见例如，Sambrook等，同上；DNA克隆，同上；核酸杂交，同上。
如果两种核酸片段能够与PCVⅡ核酸或其变异体特异性杂交(例如，与PCVⅡ核酸杂交但不与来自环状病毒家族其它成员的多核苷酸杂交)，或特异性引导聚合酶链式反应(ⅰ)在如，例如，Sambrook等(同上)和核酸杂交(同上)中所述的典型杂交和清洗条件下；(ⅱ)应用降低严紧度的清洗条件下，该条件允许最多约25-30％碱基对错配，例如2×SSC、0.1％SDS，室温两次，每次30分钟；然后2×SSC、0.1％ SDS,37℃一次，30分钟；然后2×SSC，室温两次，每次10分钟；或(ⅲ)选择在标准条件下(例如，Saiki等(1988)科学239:487-491中所述)典型聚合酶链式反应(PCR)中应用的引物，其导致PCVⅡ或其变异体序列特异性增殖，则认为这两种核酸片段与PCVⅡ多核苷酸“可选择性杂交”。
术语“功能等同”意指与参照氨基酸序列或其免疫原性部分诱导的应答相比，该蛋白质的氨基酸序列将诱导基本上相同或增强的前面定义的免疫应答的蛋白质。
DNA构建体的“异源”区是一种在另一种DNA分子中或贴附于另一种DNA分子的可鉴定的DNA片段，其与天然存在的其它分子没有发现相关性。因此，如果异源区编码一种病毒基因，则该基因通常将由其来源病毒基因组中不贴附病毒基因的DNA贴附。异源编码序列的另一个例子是编码序列本身不是天然发现(例如，具有与天然基因不同密码子的合成序列)的构建体。如本发明中涉及的，等位基因变异或自然发生的突变事件不会提高DNA的异源区。
本发明提及的术语“治疗(treatment)”指(Ⅰ)防止感染或再感染(预防)，或(ⅱ)相关疾病症状的缓解或消除(治疗)。
如本发明提及的，“生物样品”指从受体中分离出的组织和液体样品，包括但不限于，例如，血液、血浆、血清、粪便、尿、骨髓、胆汁、脊髓液、淋巴组织和淋巴液、皮肤样品、皮肤、呼吸系统、肠道、和泌尿生殖器道的外分泌物、眼泪、唾液、乳汁、血细胞、器官、活检，以及体外细胞培养物的样品，包括但不限于，在培养基中使细胞和组织生长的条件培养基，例如，重组细胞和细胞成分。
本发明提及的术语“标记”和“可检测标记”指能够检测的分子，包括但不限于，放射性同位素、荧光剂、化学发光剂、酶、酶底物、酶辅因子、酶抑制剂、发色团、染料、金属离子、金属溶胶、配体(例如，生物素活半抗原)等。术语“荧光剂”指在检测范围内能够发射荧光的物质或部分。本发明中可以应用的标记的具体实例包括荧光素、若丹明、丹酰、伞花内酯、Texas红、发光氨、NADPH和α-β-半乳糖苷酶。
至于“脊椎动物受体”指心形亚门(subphylum cordata)的所有成员，包括单不限于，哺乳动物例如牛、羊、猪、山羊、马、和人；家畜类动物例如狗和猫；以及鸟，包括家养的、野生的和猎鸟例如公鸡和母鸡包括小鸡、火鸡和其它鸡类鸟。该术语没有指示具体年龄。因此，意图覆盖成年和新生动物，以及胎儿。B．一般方法本发明的核心是发现了一种从PMWS感染猪体内分离出来的新的环状病毒，本发明命名为“PCVⅡ”。本发明应用的材料和方法使发现发现一个家族的核苷酸序列(它们各自含有新PCVⅡ病毒的一个完整基因组)成为可能。该家族核苷酸序列的可应用性，首先使较小异源性差异的该基因组家族的其它成员的分离成为可能，其次，使DNA片段的构建和蛋白质应用于诊断成为可能。例如，至少约8-10个或更多核苷酸的低聚物，优选包括至少约15-20个核苷酸的低聚物用作疾病诊断的杂交探针。该探针可以用于检测，例如，怀疑携带病毒的受试者的血清中，病毒基因组的存在。同样，编码蛋白质的基因可以被克隆和用于设计探针，以检测和分离其它病毒分离体中的同源基因。
PCVⅡ序列还能够用于设计和生产PCVⅡ-特异性多肽，其用作诊断血清或血液中PCVⅡ引起的抗体是否存在的试剂。抗这些多肽的抗体也可用作诊断试剂。因为可以解码完全基因组范围中的几个开放读码框，所以能够推测PCVⅡ-相关蛋白质的一级结构。最后，该基因序列的信息还能够设计和生产有效抗PCVⅡ的疫苗，因此用于预防PMWS和用于生产保护性抗体。
来自基因组的序列信息能够推测由病毒基因组编码的各种多肽的氨基酸序列和鉴定其适当表位。能够利用独立获得和表达的相关DNA片段生产由PCVⅡ基因组中鉴定的几种ORF编码的全长蛋白质，或其适当部分，因此利用重组技术提供所需的多肽。原核宿主和真核宿主都可以被用于该表达。短多肽片段也可以被化学合成并被连接到载体蛋白质上用作疫苗。另外，可以生产连接于赋予免疫原性的蛋白质的表位。由此生产的蛋白质本身可以用作疫苗，或者可以用于诱导宿主中免疫活性B细胞，然后该B细胞可以用于生产在被动免疫治疗中应用的分泌抗体的杂交瘤。
更具体地说，三种PCVⅡ分离体——PCVⅡ412(SEQ ID NO:1)、PCVⅡ9741(SEQ ID NO:11)、和PCVⅡB9(SEQ ID NO:12,SEQID NO:24)的完全基因序列如土4A-4B所示。各PCVⅡ分离体之间核苷酸序列同源性百分率超过99％等同性。新发现的病毒基因组与感染的PK15细胞分离出的PCV(本发明中称为“PCVⅠ”)在核苷酸水平上具有约76％的等同性。如实施例中的进一步描述，在三个区段中发现核苷酸插入和缺失(插入缺失，indel)。
如图1所示，新病毒含有至少六个潜在的开放读码矿(ORF)，它们编码含有多于50个氨基酸残基的蛋白质，而来源于PK15的PCVⅠ具有七个潜在的ORF。代表性PCVⅡ分离体的ORF出现在下列核苷酸位置(应用图4A-4B所示的PCVⅡ分离体的编号)ORF 151-992ORF 2671-360ORF 3565-389ORF 4553-729ORF 51016-1174ORF 61735-1037由这六种ORF编码的多肽如图2A-2C所示。
PCVⅡ靶向的主要细胞是外周血中的单核细胞，象巨噬细胞，当然感染动物的各种组织和器官中也发现了病毒。感染的巨噬细胞丧失了其正常功能，使宿主免疫系统损害，导致死亡。
新环状病毒的克隆和测序提供了有关PMWS病因物质的信息。如上面的解释，测序信息、以及克隆和其基因产物在诊断和研制疫苗中是有用的。特别是，PCR和基于抗体的诊断方法用于诊断疾病，以及在本发明中用于专属地将本发明的新PCVⅡ病毒与来源于持续感染的PK15细胞的PCVⅠ鉴定和区别开来。测序信息还用于设计特异性引物，以表达病毒-特异性基因产物，用于研究病毒结构，生产特异性抗体，以及鉴定猪环状病毒相关疾病的致病基因。B.1．PCVⅡ基因序列的制备从PMWS感染猪的组织中分离出的病毒得到新PCVⅡ病毒基因组。从各种来源提取病毒DNA，包括感染的Dulac和Vero细胞小球、外周血暗黄色膜细胞、来自感染动物的组织和血清。应用实施例中更充分描述的方法从样品中提取DNA。
通过比较环状病毒家族中已知病毒之间的序列和结构相似性，利用保守茎环结构的互补序列设计独特引物。然后进行单引物PCR，并克隆产物。在两个方向上对插入质粒载体的不同取向的两种全长病毒基因组进行测序。制备其它PCR产物，并测序以确保引物/茎环区的可靠性。
利用类似引物，其它PCVⅡ分离体，得到包括PCVⅡ 9741、和PCVⅡ B9。这可能是首次从病毒颗粒而不是从DNA复制形式克隆出环状病毒。
提取PCVⅡ基因组的方法的描述当然大多数是已经公知的。本发明提供了得到的序列，也可以利用合成法或通过合成法与应用类似于本发明所述方法的部分序列修补组合制备全序列或其任何部分。B.2．PCVⅡ蛋白质的制备PCVⅡ基因组序列的提供使来源于PCVⅡ基因组的编码病毒多肽和其抗原活性区的表达载体的构建称为可能。编码所需蛋白质的片段可以利用常规限制性消化从cDNA克隆得到或通过合成法得到，并被连接到载体中，例如含有融合序列部分例如β-半乳糖苷酶。任何含有一个开放读码框的所需的PCVⅡ基因组部分可以作为一种重组蛋白质得到，例如一种成熟或融合蛋白质，或者能够通过化学合成或一般的重组方法得到。
由上述DNA序列、活性片段、类似物编码的PCVⅡ蛋白质合和来源于它们的嵌合蛋白质能够通过很多方法制备是显而易见的。重组产物可以采用部分蛋白质序列形式、全长序列、包括信号序列的前体形式，物信号序列的成熟形式、或甚至融合蛋白质(例如，具有合适的重组宿主的引导物，或具有另一种病原的另一种亚单位抗原序列)。
可以构建基因文库，得到的克隆用于转化合适的宿主细胞。收集克隆，利用多克隆血清或单克隆抗体筛选PCVⅡ蛋白。
或者，当确定氨基酸序列后，可以制备含有已确定氨基酸序列部分密码子的寡核苷酸探针，并用于筛选编码受试者蛋白质的基因的基因组或cDNA文库。制备寡核苷酸太镇合DNA文库，以及通过核酸杂交筛选它们的基本策略对本领域普通技术人员是公知的。参见，例如，DNA克隆第Ⅰ卷，同上；核酸杂交，同上；寡核苷酸合成，同上；Sambrook等，同上。当从筛选文库中鉴定出阳性杂交的克隆后，可以通过限制性酶分析和DNA测序确定特定文库插入体含有PCVⅡ蛋白质基因或其同源物。然后可以利用标准方法进一步分离该基因，如果需要，应用PCR方案或限制性酶删除全长序列的一部分。
同样，可以应用已知方法，例如酚提取法直接从病毒中分离基因，然后进一步对序列操作，已产生任何所需的改变。参见，例如，本发明的实施例和Hamel等(1998)病毒学杂志72:5262-5267，属于用于得到和分离病毒DNA的方法的描述。
或者，可以通过合成而不是克隆制备DNA序列。如果DNA序列将要用于制备蛋白质，可以用特定氨基酸序列的合适密码子设计DNA序列。通常，如果序列将被用于表达，那么技术人员将选择用于预期宿主的优选密码子。通过重叠经标准方法制备的寡核苷酸来组合全序列，并组合成完全的编码序列。参见，例如，Edage(1981)自然292:756；Nambair等(1984)科学223:1299；Jay等(1984)生物化学杂志259:6311。
一旦制备或分离出所需蛋白质的编码序列后，可以将它们克隆到任何适当载体或复制子中。本领域技术人员已知大量克隆载体，适当克隆载体的选择是一件选择的问题。克隆重组DNA载体并能够转化宿主细胞的实施例包括抗菌素(E.coli)、pBR322(E.coli)、pACYC177(E.coli)、pKT230(革兰氏阴性细菌)、pGV1106(革兰氏阴性细菌)、pLAFR1(革兰氏阴性细菌)、pME290(非-E.coli革兰氏阴性细菌)、pHV14(E.coli和枯草杆菌)、pBD9(杆菌属)、pIJ61(链霉菌属)、pUC6(链霉菌属)、YIp5(酵母属)、YCp19(酵母属)和牛痘病毒(哺乳动物细胞)。参见，Sambrook等，同上；DNA克隆，同上；B.Perbal，同上。
基因可以处于启动子、核糖体结合位点(对于细菌表达)和，任选地，操纵基因(本发明中总称为“调控”元件)的操纵之下，以使编码所需部分的DNA序列在被含有该表达构建体的载体转化的宿主细胞中转录成RNA。编码序列可以含有也可以不含信号肽或引导序列。如果含有信号序列，则它可以是自身的同源序列或异源序列。引导序列可以由宿主在转录后的加工中除去。参见，例如，美国专利4,431,739；4,425,437,4,338,397。
也可能需要其它的调控序列，其使蛋白质序列的表达调控与宿主细胞的生长相关。调控序列是本领域技术人员已知的，实例包括使基因的表达响应化学或物理刺激物而开启或关闭的那些序列，包括调控化合物的存在。载体中还可以出现其它类型的调控元件，例如，增强子序列。
操纵序列和其它调控序列可以在插入载体(例如上述克隆载体)之前连接于编码序列。或者，可以将编码序列直接克隆到已经含有调控序列和适当限制性位点的表达载体中。
在某些情况下，可能需要改编编码序列，以使它按照适当的取向连接于控制序列；即，以便维持适当的读码框。还可能需要制备所需PCVⅡ蛋白质的突变体或类似物。可以通过删除蛋白质编码序列的一部分、或通过插入序列、和/或通过取代序列中一种或多种核苷酸制备突变体或类似物。在，例如，Sambrook等，同上；DNA克隆，同上；核酸杂交，同上中描述了改变核苷酸序列的方法，例如定点突变。
然后表达载体用于转化适当的宿主细胞。很多哺乳动物细胞系是本领域已知的，包括美国典型培养物收藏中心(ATCC)提供的无限增殖细胞系，例如但不限于，中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、HeLa细胞、小仓鼠肾(BHK)细胞、猴肾细胞(COS)、人肝细胞癌细胞(例如，Hep G2)、Madin-Darby牛肾(“MDBK’)细胞，以及其它细胞。同样，发现细菌宿主例如E.coli、枯草杆菌、和链球菌spp.将用于本发明的表达构建体。本发明中应用的酵母宿主特别地包括啤酒糖酵母、白色假丝酵母、麦芽糖假丝酵母、多形汉逊氏酵母、脆壁克鲁维氏酵母、乳克鲁维氏酵母、季也蒙氏毕赤氏酵母、巴斯德毕赤氏酵母、粟酒裂殖糖酵母和Yarrowia lipolytica。杆状病毒表达载体适用的昆虫细胞尤其包括Aedes aegypti、苜蓿银纹夜蛾、家蚕、Drosophilamelanogaster，草地夜蛾、和粉纹夜蛾。
根据选择的表达系统和宿主，在表达目标蛋白质的条件下培养经上述表达载体转化的宿主细胞，制备本发明的蛋白质。然后从宿主细胞中分离蛋白质并纯化。如果表达系统将蛋白质分泌到生长培养基中，可以直接从培养基中纯化单比知。如果不分泌蛋白质，则从细胞溶解物中分离。适当生长条件的选择和提取方法在本领域技术范围内。
也可以利用已知氨基酸序列或来源于目标基因的DNA序列得出的氨基酸序列，通过化学合成法，例如固相肽合成，制备本发明的蛋白质。这些方法是本领域技术人员公知的。参见，例如，J.M.Stewart和J.D.Young，固相肽合成，第2版，Pierce Chemical Co.,Rockford,IL(1984)和G.Barany和R.B.Merrifield，肽分析、合成、生物学，编者Gross和J.Meienhofer，第2卷，科学出版社，New York(1980)pp.3-254，用于固相肽合成技术；和M.BOdansky，肽合成原理，Springer-Verlag，Berlin(1984)和E.Gross和J.Meienhofer，编，肽分析、合成、生物学，同上，第1卷，用于典型溶液合成。如果所述抗原的小片段即可引起目标受试者的免疫应答，则化学合成肽可能是优选的。
基因组分析表明至少存在六个开放读码框，至少其中之一编码推测的DNA复制酶基因。B.3．抗原多肽和与载体结合物的制备肽的抗原区一般相对较小，通常位10个氨基酸或更短的长度。少至5个氨基酸的片段通常即可表现抗原区的特征。因此，利用PCVⅡ基因组作为基础，编码任何来源于PCVⅡ的多种ORF，例如ORF 1-6，特别是ORF 6的短多肽片段的DNA可以重组表达为融合蛋白质或分离肽。另外，可以化学合成短氨基酸序列。在合成肽被正确配置从而能提供正确表位，但因为太小而不具有免疫原性的例子中，可以将肽连接到适当的载体上。
本领域已知很多获得该连接的方法，包括利用从Pierce Company,Rockford,Illinois得到的N-琥珀酰亚胺-3-(2-吡啶-硫)丙酸盐(SPDP)和琥珀酰亚胺-4-(N-马来酰亚胺-甲基)环己烷-1-羧酸盐(SMCC)形成二硫键。(如果该缺乏巯基，可以通过加入半胱氨酸残基提供。)这些试剂在它们自身之间和一种蛋白质上的半胱氨酸残基肽之间形成二硫键，通过赖氨酸上的ε-氨基或其他氨基酸上的其它游离氨基形成酰胺键。大量这类二硫化物/酰胺形成试剂是已知的。参见，例如，免疫研究(1982)62:185。其它双功能偶联试剂形成硫醚键而不是二硫键。商业提供了很多这类硫醚-形成试剂，包括6-马来酰亚胺己酸、2-溴乙酸、2-碘乙酸、4-(N-马来酰亚胺-甲基)环己烷-1-羧酸等。可以通过将羧基与琥珀酰亚胺或1-羟基-2-硝基-4-磺酸钠盐混合活化羧基。上述列表并不详尽，显然可以对所述化合物进行改动。可以使用任何载体，只要其自身不诱导对宿主有害的抗体产生，例如各种血清白蛋白，破伤风类毒素、或匙孔冒贝血蓝蛋白(KLH)。
当结合物注射到受试者体内，将产生抗血清，其含有不仅与结合物而且与运载该序列类似部分的融合蛋白质，以及全长PCVⅡ的适当决定簇特异性反应的免疫球蛋白。B.4．抗体的产生由本发明的新病毒编码的蛋白质，或其片段可以用于生产抗体，包括多克隆和单克隆抗体。如果需要多克隆抗体，可以用本发明的抗原或其片段或突变抗原免疫经选择的哺乳动物(例如，小鼠、兔、山羊、马等)。收集免疫动物的血清，按照已知程序处理。参见，例如，Jurgens等(1985)色谱杂志348:363-370。如果适用含有多克隆抗体的血清，可以通过免疫亲合色谱，应用已知程序纯化多克隆抗体。
本领域技术人员也可以容易地制备蛋白质和其片段的单克隆抗体。利用杂交瘤技术制备单克隆抗体的一般方法是公知的。可以通过细胞融合，也可以通过其它技术，例如用致瘤DNA直接转化B淋巴细胞，或者用Epstein-Barr病毒转化，来制备无限增殖的抗体生产细胞系。参见，例如，M.Schreier等，杂交瘤技术(1980)；Hammerling等，单克隆抗体和T-细胞杂交瘤(1981)；Kennett等，单克隆抗体(1980)；还参见美国专利4,341,761；4,399,121；4,427,783；4,444,887；4,452,570；4,466,917；4,472,500；4,491,632；和4,493,890。抗所需蛋白质或其片段的产生的单克隆抗体的拼接可以筛选各种性质；即同种型、表位、亲合性等。利用免疫亲合技术，单克隆抗体可以用于纯化它们对抗的个体抗原。多克隆和单克隆抗体还可以用于主动免疫或者可以与亚单位疫苗制剂组合，以增强免疫应答。多克隆和单克隆抗体也可以用于诊断目的。B.5．疫苗制剂和给药本发明的新病毒蛋白质可以配制成疫苗组合物，单独或与其它抗原一起用于免疫下述受试者。例如，Remington′s药物科学，MackPublishing Company,Easton,Pennsylvania,18版，1990中描述了制备这类制剂的方法。通常，本发明的疫苗配制成可注射的液体溶液或悬浮液。也可以配制成注射前溶解于或悬浮于液体载体的适当固体形式。制剂还可以被乳化或将活性成分包封于脂质体载体中。活性免疫原成分通常于相容性药物载体，例如，水、盐水、葡萄糖、甘油、乙醇等，以及它们的组合物混合。另外，如果需要，载体可以含有少量辅料例如保湿剂或乳化剂和pH缓冲剂。
制剂中还可以加入增强疫苗有效性的佐剂。这类佐剂包括，没有限制，由铝盐(明矾)形成的佐剂，例如氢氧化铝、磷酸铝、硫酸铝等；水包油和油包水型乳剂，例如完全弗氏佐剂(CFA)、不完全弗氏佐剂(IFA)、avridine和二甲基二十八烷基溴化铵(DDA)；由细菌细胞壁成分构成的佐剂，例如包括单磷脂酰脂类A(MPL)(Imoto等(1985)Tet.Lett.26:1545-1548)、海藻糖二霉菌酸酯(TDM)、和细胞壁骨架(CWS)；来源于ADP-核糖酸化细菌毒素，例如来源于白喉毒素(例如，CRM197，一种非毒性白喉毒素突变体(参见，例如，Bixler等(1989)试验医学生物学进展(Adv.Exp.Med.Biol.)251:175；和Constantino等(1992)疫苗)、百日咳毒素(PT)、霍乱毒素(CT)、E.coli热不稳定毒素(LT1和LT2)、假单胞菌内毒素A、肉毒杆菌C2和C3毒素、以及来自产气荚膜梭菌、螺状梭菌、艰难梭菌的毒素；皂甙佐剂例如Quil A(美国专利5057540)、或者从皂甙制得的颗粒例如ISCOM(免疫复合物)；细胞因子，例如白细胞介素(例如，IL-1、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-12等)、干扰素(例如γ干扰素)、巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)、肿瘤坏死因子(TNF)等；胞壁酰肽例如N-乙酰-胞壁酰-L-苏氨酰-D-异谷氨酰胺(thr-MDP)、N-乙酰-正胞壁酰-L-丙氨酰-D-异谷氨酰胺(nor-MDP)、N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酰-D-异谷氨酰胺酰-L-丙氨酸-2-(1′-2′-二棕榈酰-sn-丙三氧基-3-羟磷酰氧基)-乙胺(MTP-PE)，等；来源于CpG家族分子的佐剂，含有CpG基元的CpG二核苷酸和合成的寡核苷酸(参见，例如，Krieg等，自然(1995)374:546和Davis等免疫学杂志(1998)160:870-876)；以及合成佐剂，例如PCPP(聚[二(羧酸酯苯氧基)膦腈](Payne等，疫苗(1998)16:92-98)。
这类佐剂由很多销售商商业提供，例如Accurate Chemicals；RibiImmunechemicals,Hamilton,MT；GIBCO；Sigma,St.Louis,MO。
如上所述，蛋白质可以连接于载体，以便增加其免疫原性。适当的载体包括大的、代谢缓慢的大分子，例如蛋白质，包括血清白蛋白、匙孔帽贝血蓝蛋白、免疫球蛋白分子、甲状腺球蛋白、卵清蛋白、和其它本领域技术人员已知的蛋白质；多糖，例如琼脂糖凝胶、琼脂糖、纤维素、纤维素小珠等；多聚氨基酸例如聚谷氨酸、聚赖氨酸等；氨基酸共聚物；以及灭活的病毒颗粒。
可以使用天然形式的蛋白质，或者可以通过例如赖氨酸残基的琥珀酰化或与半胱氨酸-硫内酯反应修饰它们的功能基团成分。还可以通过例如，将功能氨基与2-亚氨基硫羟烷或3-(4-二硫吡啶基)丙酸的N-羟基琥珀酰亚胺酯反应，将巯基引入载体(或抗原)。还可以修饰适当的载体，以引入空间手臂(例如己撑二胺或其它大小相似的双功能分子)用于连接肽。
其它适用于本发明蛋白质的载体包括轮状病毒的VP6多肽，或其功能片段，如美国专利5071651所公开的。利用美国专利4722840中公开的方法制备的病毒蛋白质和受试者免疫原的融合产物也是有用的。其它适用的载体包括细胞，例如淋巴细胞，因为以这种形式出现模拟在受试者体内出现的天然模式，故其促进被免疫的状态。或者，本发明的蛋白质可以与红细胞偶联，优选受试者自身的红细胞。偶联肽与蛋白质或细胞的方法对于本领域技术人员是公知的。
另外，蛋白质可以配制成中性或盐形式的疫苗组合物。药物可接受盐包括酸附加盐(通过活性肽的游离氨基形成)，其用无机酸，例如盐酸或磷酸，或例如乙酸、草酸、酒石酸、扁桃酸等有机酸形成。还可以用来源于无机碱例如，钠、钾、铵、钙或铁的氢氧酸根盐和例如异丙胺、三甲胺、2-乙基氨基乙醇、组氨酸、普鲁卡因等有机碱与游离羧基形成盐。
疫苗制剂将含有“治疗有效量”的活性成分，也就是说，能够诱导受试者对给药组合物产生免疫应答的量。该应答将通过感染宿主通常表现症状的减轻或消失和/或较短的恢复时间证明。
本领域技术人员通过标准试验很容易确定准确用量。蛋白质浓度通常约占组合物的1％到95％(w/w)，如果需要甚至更高或更低。
为了免疫受试者，通常非肠道给药疫苗，通常经肌肉内注射。然而其它给药方法，例如皮下、腹膜内和静脉注射也可以接受。给药量依赖处理动物、动物免疫系统合成抗体的能力、和所需的保护程度而定。本领域普通技术人员可以容易地通过建立量效曲线的常规试验确定有效剂量。给药疫苗免疫受试者至少一个剂量，优选两个剂量。而且，可以给动物给药需要维持对感染免疫状态的若干剂量。
适用于其它给药方式的其它疫苗制剂包括栓剂、有时可以是气溶胶、鼻内给药制剂、口腔给药制剂，以及缓释制剂。对于栓剂，载体组合物将包括常规粘合剂和载体，例如，polyalkaline glycol、或甘油三酸酯。该栓剂可以用含活性成分约0.5％-10％(w/w)，优选约1％-2％的混合物制备。口服制剂载体包括例如通常应用的赋形剂，例如药物级甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、纤维素、碳酸镁等。这些口服疫苗组合物可以配制成溶液、悬浮液、片剂、丸剂、胶囊、缓释制剂、或粉末剂形式，含活性成分约10％到约95％，优选约25％到约70％。
鼻内制剂通常包括即不对鼻粘膜产生刺激也不明显干扰临床功能的载体。稀释剂例如水、生理盐水或其它已知物质可以用于本发明的主题。鼻内制剂还可以含有防腐剂，例如但不限于，氯丁醇和洁尔灭。可以加入表面活性剂以增强试验蛋白质被鼻粘膜吸收的能力。
可以向蛋白质中加入载体或介质例如脂质体、不可重吸收的不渗透聚合物例如乙烯醋酸乙烯酯共聚物和Hytrel共聚物、溶胀性聚合物例如水凝胶、或者可重吸收的聚合物例如胶原和某些聚酸或聚酯例如用于制备重吸收结构的材料，制备控释或缓释制剂。本发明蛋白质还可以利用本领域已知的移植微型泵给药。
本发明的蛋白质还可以通过表达所述蛋白质的载体病毒给药。发现可用于本发明的载体病毒包括但不限于牛痘和其它痘病毒、腺病毒、和疱疹病毒。举例说明，可以如下构建表达新蛋白质的牛痘病毒重组体。首先将编码特定蛋白质的DNA插入适当载体，以使所述DNA连接于牛痘启动子并且旁侧牛痘DNA序列，例如编码胸苷激酶(TK)的序列。然后所述载体用于转染同时感染牛痘的细胞。同源重组使牛痘启动子加编码本发明蛋白质的基因插入病毒基因组。产生的TK重组体可以在存在5-溴脱氧尿苷的情况下培养细胞，然后筛选抗性病毒蚀斑，来筛选产生的TK重组体。
一种给药的替代途径涉及基因治疗或核酸免疫。因此，编码本发明蛋白质的核苷酸序列(连同调控元件)可以在其体内翻译之前直接对受试者给药。或者，可以通过转染受试者的离体细胞或组织，然后将转化材料重新导入宿主实现基因转移。可以将DNA直接导入宿主机体，即通过注射(参见美国专利号5580859和5589466；国际
发明者王利, 洛尔纳·A·巴比乌克, 安德鲁·A·波特, 菲利普·维尔松 申请人:萨斯喀彻温大学