可同时鉴别猪繁殖与呼吸综合症病毒的rt-pcr技术的制作方法
【专利摘要】本发明属于重大动物疫病检疫检测领域，具体涉及到一组用于可同时区别猪繁殖与呼吸综合症野毒株（包括经典毒株、高致病性毒株）和疫苗毒株鉴别诊断的RT-PCR引物、操作方法及其临床应用；设计特异性引物、提取RNA、利用RT-PCR两步法得到产物、将产物进行凝胶电泳，于凝胶成像系统进行观察；本发明把疫苗毒株序列存在双缺失区域（TJM-F92），作为野毒株和疫苗株分子诊断的靶区域，选择最优保守区域设计RT-PCR引物。该引物特异性好，对PRRSV疫苗株和野毒株(高致病性和经典毒株)可以鉴别诊断，且对其他猪源性病毒均无扩增反应。该方法检测极限为3.5TCID50的PRRSV，对仪器要求不高，适用于基层检疫。
【专利说明】可同时鉴别猪繁殖与呼吸综合症病毒的RT-PCR技术
[0001]
【技术领域】 本发明属于重大动物疫病检疫检测领域，具体涉及到一组用于可同时区别猪繁殖与呼 吸综合症野毒株(包括经典毒株、高致病性毒株）和疫苗毒株区别诊断的RT-PCR引物、操作 方法及其临床应用。
[0002]
【背景技术】 猪繁殖与呼吸病毒PRRSV是一种单股正链RNA病毒，有囊膜，归属于冠状病毒科、动脉 炎病毒属。
[0003] 猪繁殖与呼吸综合征（porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS) 是由猪繁殖与呼吸综合症病毒（PRRSV)引起的急性热性高度接触性传染病，临床上引起妊 娠母猪繁殖障碍，仔猪和育肥猪呼吸症状。该病首次报道于美国（1987年），此后该病已呈 世界性分布，世界多国均见有PRRSV感染的报道，给世界养猪业造成巨大损失，已经被国际 兽医局（0ΙΕ)列为B类传染病，我国也将经典猪繁殖与呼吸综合症列为二类动物传染病； 2006年发生在中国的由变异毒株引起的高致病性蓝耳病，造成重大损失，被列为一类动物 传染病。鉴别诊断经典和高致病性猪繁殖与呼吸综合症具有重要的临床意义。
[0004] 对于PRRSV的防治，除了采用疫苗进行定期的免疫接种外，尚无特异性治疗方法。 而目前用于PRRSV防制的主要为弱毒疫苗，大规模应用弱毒疫苗使得区分动物发病与疫苗 免疫变得困难。鉴别疫苗毒和野毒是非常关键的，是判定疾病的前提，可用于引种和免疫净 化疾病。
[0005] 目前常用的PRRSV诊断方法有很多，包括病毒中和试验、酶联免疫吸附试验、间 接免疫荧光试验、免疫组织化学，但存在操作复杂费时，特异性不强的缺点，且又很难鉴别 PRRSV野毒感染和疫苗接种。而近年来发展起来的实时焚光定量PCR (realtime PCR)以操 作简单，灵敏度高、速度快为优点，但由于实验仪器及试剂昂贵，很难普遍用于基层实验室， 不利于疾病早发现和早处理。
[0006] 综上，迫切需要建立一种可以鉴别诊断PRRSV疫苗毒株和高致病性毒株、经典毒 株野毒感染的敏感而特异检测方法，对蓝耳病的监测防控和免疫净化发挥重要作用。
[0007]
【发明内容】
本研究建立了可以同时区别诊断PRRSV野毒(包括经典毒株、高致病性毒株）和疫苗毒 株感染的敏感而特异的RT-PCR引物和检测方法，可以普遍适用于基层检疫和临床应用。
[0008] 本发明所要解决的技术问题通过以下技术方案来实现： 用于区分检测猪繁殖与呼吸综合症病毒野毒株与疫苗株的RT-PCR引物包括正义引物 和反义引物：
【权利要求】
1.可同时鉴别猪繁殖与呼吸综合症病毒的RT-PCR技术，其特征在于，步骤为： 1) 用于区分检测猪繁殖与呼吸综合症病毒野毒株与疫苗株的RT-PCR引物包括正义引 物和反义引物，分别为：
2) 提取RNA : 用DEPC (0. 1%) H2O溶解疫苗毒株干粉，取20〇μ1疫苗，使用RNAiso plus提取RNA，用 2〇μ1 无 RNA 酶的 DEPC (0. 1%) H2O 溶解 RNA ; 3. RT-PCR两步法： 以上一步骤提取的RNA为模板，配制1〇μ1反转录体系进行反转录，1〇μ1反应体系的配 制：Random primer 终浓度为 2μΜ,2〇μΜ Random primer ?μ1、1〇μΜ dNTPs 0·5μ1、5χ M-MLV buffer 2Pl、RNase Inhibitor (4〇υ/μ1) 0·5μ1、 RTase M-MLV (RNase H-) 0.5Pl、RNA 模 板 5μ1、RNase-free H2O 0· 5ML ; 反转录程序为：30°C 10 min、42°C 60min、70°C 15min、4°C 5min,得到反转录产物； 配制PCR混合体系：2〇μΜ正义引物和反义引物各0. 5μ1，2. 5μΜ dNTPs 8μ1，10χΡΟ? buffer (Mg2+) 5μ1，TAKARA Taq (5υ/μ1) 0·5μ1，反转录产物2μ1，用灭菌去离子水补充至 25μ1，ΡΟ?反应程序：95 °C 5min，以 94 °C 30s、55 °C 30s 和 72 °C Imin 进行 30 个循环， 72 °C 10min，4 °C 5min，得到产物； 4) 电泳观察：取1〇μ1的上述产物，经3%琼脂糖凝胶电泳，于凝胶成像系统观察。
【文档编号】C12Q1/68GK104232789SQ201410416168
【公开日】2014年12月24日 申请日期:2014年8月21日 优先权日:2014年8月21日
【发明者】王钦富, 张雪梅, 王美辰 申请人:大连大学