专利名称：：抗严重急性呼吸综合征相关冠状病毒的中和单克隆抗体的制作方法抗严重急性呼吸综合征相关冠状病毒的中和单克隆抗体相关申请的交叉参者本申请要求2005年2月8日提交的美国系列申请No.60/651，046的优先权，并且是2005年5月31日提交的美国系列申请No.11/141，925的部分继续申请，该申请要求2004年6月2日提交的美国系列申请No.60/576，118的优先权。在整个申请中引用了各种出版物。这样，这些参考文献及其相应的公开内容全部引入本申请作为参考，从而更为全面地阐述本发明所属领域的技术发展水平。
背景技术：
：严重急性呼吸综合征(SARS)是近来被认识的发热性严重下呼吸道疾病，它是由于感染一种新的冠状病毒(SARS-CoV)而导致的(1-5)。全球性的SARS爆发虽然得到了控制，但是对其未来再出现的可能性的关注却仍然存在，尤其是近期关于实验室获得的感染的报导(6)。无论如何，目前尚未获得能够有效地治疗或预防该致命性病毒感染的方法(7,8)。类似于其他冠状病毒，SARS-CoV是一种包膜病毒，含有一个大的、正链RNA基因组，该基因组编码病毒的复制酶蛋白以及包括剌突(S)蛋白、膜(M)蛋白、包膜(E)蛋白、核衣壳(N)蛋白在内的结构性蛋白和若干尚未表征的蛋白(4,5，9)。系统发育分析表明，SARS-CoV不同于冠状病毒的三个已知抗原组。因此，SARS-CoV的后基因组特征对于开发抗SARS疗法和疫苗是重要的(10,11)。冠状病毒感染起始于S蛋白附着到特异性的宿主受体，从而触发S蛋白内的构象改变。SARS-CoV的S蛋白为预测长度为1,255个氨基酸的I型跨膜糖蛋白，其氨基酸序列包括前导区(残基1-14)、胞外域(残基15-11卯)、跨膜结构域(残基1191-1227)以及短的细胞内尾部(残基1227-1255)(5)。与许多其他的冠状病毒例如小鼠肝炎病毒(MHV)(12,13)不同，在所述其他冠状病毒中，S蛋白被后期翻译性切割为S1和S2亚单位，而在SARS-CoV的S蛋白中并没有典型的切割基序被确定(5)。其S1和S2结构域则可通过与其它冠状病毒S蛋白的序列对齐而被预测(5,14)。该SARS-CoVS蛋白的S2结构域(残基681-1255)包含一种推定的融合肽和两个介导病毒和靶细胞膜之间的融合的七残基重复序列(HR1和HR2)区域。已经发现HR1和HR2区域可以结合形成一种六螺旋束结构(15-18),类似于艾滋病病毒fflVgp41(19)和MHVS蛋白(20,21)的融合活性核心结构。该SARS-CoV的S蛋白的S1结构域介导病毒与血管紧张素转化酶2(ACE2)的结合，ACE2是SARS-CoV在易感性细胞上的功能性受体(22-25)。近来，一个在S1结构域之中的193个氨基酸的小片段(残基318-5IO)被确定为一种足以与ACE2结合的受体结合结构域(RBD)(26-28)。冠状病毒S蛋白是主要的诱导中和抗体产生的抗原决定嚴(29，30)。因此，逻辑上可以使用S蛋白作为疫苗开发的抗原(30)。近来已经证明SARS-CoV的S蛋白是一种在结构蛋白中的保护性免疫的主要诱导物(31)。Yang等人(32)报导了一种编码S蛋白的DNA疫苗能在小鼠中诱导SARS-CoV的中和(中和抗体效价范围为1:25至1:150)以及保护性免疫，并且已证实该保护作用是由中和抗体而不是由T细胞依赖性机制所介导的。Bisht等人(33)证实，通过减毒的痘苗病毒(MVA)表达的SARS-CoV的S蛋白能够引起SARS-CoV-中和抗体效价为l:284的S-特异性抗体，并且保护免疫小鼠不被SARS-CoV感染。经过攻击感染后的小鼠呼吸道中SARS-CoV的滴度明显降低。Bukreyev等人(34)报导，将非洲绿猴通过表达该SARS-CoVS蛋白的减毒的副流感病毒(BHPIV3)进行粘膜免疫，诱导了中和效价为1:8到1:16的中和抗体，并且保护动物免受攻击性感染。这些数据显示，SARS-CoV的S蛋白是一种保护性抗原，该抗原能够诱导中和抗体，虽然其抗原决定簇仍然需要进一步确定。我们近来已经证实，SARS-CoV的S蛋白的受体结合结构域(RBD)是在SARS-CoV感染的患者体内和经灭活病毒或S蛋白(35,36)免疫的动物中诱导的中和抗体的主要耙点。因此，我们使用SARS-CoV的S蛋白的重组体RBD作为诱导中和单克隆抗体(mAb)的免疫原。发明筒述本发明提供一种分离的单克隆抗体，该单克隆抗体能够与严重急性呼吸综合征相关冠状病毒(SARS-CoV)刺突(S)蛋白的受体结合结构域(RBD)结合，从而竟争性地抑制SARS-CoV与宿主细胞结合。另外，本发明提供一种包括如上所述单克隆抗体的互补性决定区域的物质，该物质能够与如上所述5单克隆抗体相同的表位结合。在一个实施方案中，上述物质是抗体。在一种优选的实施方案中，所述抗体是中和的。本发明还提供单链抗体或抗体融合构建体；一种人源化抗体；和一种如上所述的嵌合抗体。本申请意图包括使用本发明抗体创建的不同的嵌合构建体。本发明也包括该抗体的所有人源化构建体。在一种实施方案中，上述分离抗体直接或间接地偶联到细胞毒素试剂。本发明还提供包括所述抗体的细胞。本发明另外提供一种编码上述抗体的核酸分子。本发明更进一步提供一种能够特异性杂交如上所述的分子的核酸分子。所述核酸分子包括，但不限于，合成DNA或RNA、基因组DNA、cDNA和RNA。本发明还提供一种包括上述核酸分子或其一部分的载体。在一种实施方案中，所述载体是表达载体，由此可以表达上述核酸分子编码的蛋白。本发明更进一步包括一种包含上述核酸分子的细胞。所述细胞可以用于表达。本发明提供一种制备抗体的方法，该抗体能够与SARS-CoV刺突(S)蛋白的受体结合结构域(RBD)结合，从而竟争性地抑制SARS-CoV结合到宿主细胞，该方法包括可操作地连接如上所述的核酸分子到适当的调控元件，从而表达所述抗体；将所述连接的核酸分子置于允许所述抗体表达的适宜条件下；回收所述表达的抗体，从而制得所述抗体。本发明还提供一种通过上述方法制备的抗体。本发明提供一种包括有效量的上述单克隆抗体和适宜载体的组合物。本发明进一步提供一种包括有效量的上述单克隆抗体和药学上可接受的载体的药物组合物。本发明还提供一种使用上述药物组合物来治疗SARS-CoV感染的方法。本发明更进一步提供一种使用上述药物组合物来预防SARS-CoV感染的方法。本发明还提供一种用于检测SARS-CoV(或SARS-CoV感染细胞)的方法，该方法包括接触能够结合所述病毒刺突(S)蛋白的受体结合结构域(RBD)的抗体或其衍生物，接触的条件是允许所述抗体或其衍生物与SARS-CoV的S蛋白的RBD形成复合物；检测形成的复合物。最后，本发明提供一种用于筛选能够通过阻断所述病毒与宿主细胞上受体的结合，从而抑制严重急性呼吸综合征相关冠状病毒(SARS-CoV)感染的化合物的方法，该方法包括如下步骤(a)建立一种用于使所述抗体结合到SARS-CoV刺突(S)蛋白的受体结合结构域(RBD)的体系；和(b)将待测所述化合物加入上述(a)的体系中，由此如果上述抗体与SARS-CoV的S蛋白的RBD结合降低，表明该化合物能够干扰抗体与RBD的结合，从而抑制SARS-CoV的S蛋白的RBD的感染。本发明进一步提供筛选得到的化合物。然后可将该化合物用于治疗或预防严重急性呼吸综合征(SARS)。本发明提供一种试剂盒，该试剂盒包括含有能够识别SARS病毒的抗体的隔室。本发明证实，所述RBD包含多个构象依赖性的中和表位，所述表位诱导一组有效的中和单克隆抗体(mAb),该抗体可用于治疗、诊断和预防SARS。附图简述图1.通逸霞盖S蛋白RBD的重叠肽确定的mAb4D5和17H9的表位图谱。每一肽段的包被浓度5jag/ml，mAb的检测浓度10jag/ml。图2.通过mAb抑制RBD-Fc与ACE2的结合。上图表示通过流式细胞术测定的、对RBD-Fc与在293T/ACE2细胞上表达的细胞相关性ACE2的结合的抑制作用；下图表示通过ELISA测定的对RBD-Fc与可溶性ACE2结合的抑制作用。RBD-Fc的用量为liag/m1,而mAb的用量为50yg/ml。计算出每一种mAb的抑制百分率.，图3.以mAb中和SARS假病毒。本图显示出了每组中的代表性mAb对293T/ACE2细胞中的SARS假病毒感染的抑制作用。在2倍系列稀释液中检测每一种mAb，并且计算中和百分率。发明详述本发明提供一种分离的单克隆抗体，该抗体能够与严重急性呼吸综合征相关冠状病毒(SARS-CoV)刺突(S)蛋白的受体结合结构域(RBD)结合，从而竟争性地抑制SARS-CoV与宿主细胞结合。本发明还提供一种包括上述单克隆抗体的互补性决定区域的物质，该物质能够与如上所述单克隆抗体相同的表位结合。该物质包括，但不限于，多肽、小分子、抗体或抗体片段。在一个优选的实施方案中，该抗体是中和的。在另外实施方案中，该抗体可以是单链抗体或抗体融合构建体；人源化抗体；或如上所述的嵌合抗体。本申请意图包括使用本发明抗体创建的不同的嵌合构建体。本发明也包括该抗体的所有人源化构建体。生产嵌合抗体或人源化抗体的技术是众所周知的。参见嵌合抗体的例子(37,38)和人源化抗体的例所述的〗奮饰可以包括，在;述片段中增加、减少或突变某些氨基酸序列。制备抗体的一般方法在本领域普通技术人员的知识范围之内。参见，例如Ed.Harlow的"使用抗体实验室手册便携式方案l(UsingAntibodies:ALaboratoryManual:PortableProtocolNo.1)，，(1998)。在一个实施方案中，如上所述的分离抗体直接或间接地与一种或多种细胞毒素试剂偶联。所述的细胞毒素试剂包括，但不限于，放射性核苷酸或其它毒素。本发明还提供包括所述抗体的细胞。本发明另外提供一种编码上述抗体的核酸分子。一旦所述抗体被分离，编码所述抗体的基因即可被分离，并且该核酸序列将被确定。因此，本发明进一步提供一种能够特异性杂交如上所述分子的核酸分子。所述核酸分子包括，但不限于，合成DNA或RNA、基因组DNA、cDNA和RNA。本发明还纟是供一种包括上述核酸分子或其一部分的载体。该部分可以是执行某种功能的功能性部分。片段或部分序列能够编码一种功能性的蛋白的功能性结构域。在一种实施方案中，所述载体是表达载体，由此，可以表达核酸分子编码的蛋白。本发明更进一步包括一种包含上述核酸分子的细胞。所述细胞可以用于表达。载体是本领域中众所周知的。参见例如，Graupner，美国专利No.6，337，208,"CloningVector",2001年1月8日授权。也可参见，Schumacher等人,美国专利No.6，l卯，906,"ExpressionVectorfortheRegulatableExpressionofForeignGenesinProkaryotes",2001年2月20日授4又。在一个实施方案中，所述载体是质粒。本发明提供一种制备抗体的方法，该抗体能够与SARS-CoV刺突(S)蛋白的受体结合结构域(RBD)结合，从而竟争性地抑制SARS-CoV结合到宿主细胞，所述方法包括可#:作地连接如上所述的核酸分子到适当的调控元件，从而表达所述抗体；将所述连接的核酸分子置于允许所述抗体表达的适宜条件下；和回收所述表达的抗体，由此制得所述抗体。本发明还提供了一种通过上述方法制备的抗体。杂交瘤细胞系32H5(Conf1)、31H12(Conf11)、18D9(ConfIII)、30F9(ConfIV)、33G4(ConfV)和19B2(ConfVI)于2005年1月13日保存入美国典型培养物保藏中心(ATCC),10801UniversityBlvd.,Manassas,VA20110,美国。该中心是根据布达佩斯条约规定的用于专利程序中的国际上认可的微生物保藏机构。细胞系32H5(Conf1)、31H12(Conf11)、18D9(ConfIII)、30F9(ConfIV)、33G4(ConfV)和19B2(ConfVI)分别获得ATCC保藏号PTA-6525、PTA-6524、PTA-6521、PTA-6523、PTA-6526和PTA-6522。本发明也提供通过上述单克隆抗体识别的表位。在序列上或构象上，所述表位对诊断或治疗的用途很重要。本发明提供一种包括有效量的上述单克隆抗体和适宜载体的组合物。该有效量可以通过常规实验测定。本发明另外提供一种包括有效量的上述单克隆抗体和药学上可接受的载体的药物组合物。用于此处的药学上可接受的载体是指任何标准药用载体。适宜载体的例子是本领域众所周知的，其可以包括，但不限于，任何标准药用载体，例如磷酸盐緩冲的盐水溶液，包含Polysorb80的磷酸盐緩冲液，水，乳剂例如油/水乳剂，以及各种润湿剂。其它的载体还可以包括无菌溶液、片剂、包衣片剂和胶嚢。典型地，这样的载体包含赋形剂，例如淀粉、乳、糖、特定类型的粘土、凝胶、硬脂酸或其盐、硬脂酸镁或硬脂酸朽、滑石粉、植物脂或油、树胶、二醇或其它已知的赋形剂。所述载体还可包括风"^未和颜色添加剂或其它成分。根据众所周知的常规方法配制包含所述载体的组合物。本发明还提供一种使用上述药物组合物治疗SARS-CoV感染的方法。本发明另外提供一种使用上述药物组合物预防SARS-CoV感染的方法。本发明还提供一种用于检测SARS-CoV(或SARS-CoV感染细胞)的方法，该方法包括，在允许能够结合所述病毒刺突(S)蛋白的受体结合结构域(RBD)的抗体或其衍生物，与SARS-CoV的S蛋白的RBD之间形成复合物的条件下，接触所述抗体或其衍生物；并且检测形成的复合物。最后，本发明提供一种用于筛选能够通过阻断所述病毒与宿主细胞上受体的结合，从而抑制SARS-CoV感染的化合物的方法，所述方法包括如下步骤(a)建立一种用于使所述抗体结合到SARS-CoV及刺突(S)蛋白的受体结合结构域(RBD)的体系；和(b)使所述化合物上述(a)的体系接触，由此，上述抗体与SARS-CoV的S蛋白的RBD结合的降低表明所述化合物能够干扰所述的结合，由此抑制SARS-CoV的S蛋白的RBD的感染。本发明进一步提供筛选得到的化合物，该化合物可用于治疗或预防严重急性呼吸综合征(SARS)。本发明提供一种包括隔室的试剂盒，所述隔室含有能够识别SARS病毒的抗体和/或一种能够竟争性地抑制所述抗体的结合的物质。本发明证实，所述受体结合结构域(RBD)包含多个构象依赖性的中和表位，所述表位诱导一组有效的中和单克隆抗体(mAb),该抗体可用于治疗、诊断和预防SARS。参考随后的实验描述，能够更好地理解本发明，但是本领域技术人员将很容易地明白，这些具体实验的描述仅仅是说明性的，并不意味着限制在此描述的本发明，本发明将通过随后的权利要求被定义。实验详述通过SP2/0骨髓瘤细胞与Balb/c小鼠脾细胞的融合而制备27个杂交瘤克隆，该Balb/c小鼠脾细胞通过一种包含连接到人IgGlFc片段的SARS-CoV刺突(S)蛋白的受体结合结构域(RBD)的融合蛋白(命名为RBD-Fc)来免疫。在这27个由所述杂交瘤克隆产生的单克隆抗体(mAb)中，除了与相邻的线性表位结合的2个mAb外，全部其它mAb均识别构象依赖性表位。基于结合竟争实验的结果，这25个构象特异性的mAb可以被分成6组，定义为Confl-VI。ConfIV和ConfV的mAb能够显著性地阻断RBD-Fc与ACE2的结合，该ACE2为SARS-CoV的受体，揭示它们的表位与S蛋白中的受体结合位点相重叠。大多数识别该构象性表位的mAb(23/25)具有有效的抗SARS假病毒的中和活性，其50。/o中和剂量(ND5o)范围为0.005到6.569jug/ml。这些SARS-CoV中和mAb可用于l)作为用于SARS-CoV感染早期治疗的免疫治疗剂；2)作为用于诊断SARS-CoV感染的生物试剂；和3)作为用于研究SARS-C:oV的S蛋白的免疫原性、抗原性、结构与功能的探针。此外，这些鼠mAb可以被人源化而用于治疗和预防SARS-CoV感染。材料和方法V、扃Wi瘦^m^W,4:在MLP+TDM佐剂系统(Sigma,SaintLouis,MI)存在下用20|ig如前所述(35)制备的蛋白A琼脂糖凝胶纯化的RBD-Fc皮下免疫五只Balb/c小鼠(4周龄)，然后每隔3周使用10jLig同样的抗原加MLP+TDM佐剂进行加强免疫。收集小鼠的抗血清以检测抗RBD抗体和SARS-CoV中和抗体。用于制备抗RBD的mAb的杂交瘤用标准方法来生产。筒而言之，获取来自于所述免疫小鼠的脾细胞，并将其与SP2/0骨髓瘤细胞融合。使用如前所述制备的SK9(3$)作为包被抗原，通过酶联免疫吸附测定法(ELISA)筛选来10自于包含杂交瘤克隆的孔的细胞培养上清液。扩增并再检测来自阳性孔的细胞。亚克隆所述保持阳性的培养物，以产生稳定的杂交瘤细胞系。所有的mAb是通过蛋白A琼脂糖凝胶4速流仪(ProteinASepharose4FastFlow)(AmershamBiosciences)从培养物上清液中纯化的。通过ELISA测定小鼠血清或mAb与各种抗原的反应性。简而言之，在0.1M碳酸盐緩冲液(pH值9.6)中分别使用1Mg/ml的重组蛋白(RBD-Fc或Sl-C9)或纯化的人IgG(Zymed，SouthSanFrancisco,CA)包被96孔微量滴定板(CorningCostar,Acton，MA),于4。C过夜。在使用2%的脱脂乳阻断后，加入系列稀释的小鼠血清或mAb,并在37。C孵化1小时，接着用含0.1。/。吐温20的PBS液洗涤四次。通过HRP-联结的山羊抗小鼠lgG(Zymed)于37。C下检测结合的抗体1小时，然后洗涤。加入3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)基质来显示反应，并使用酶标平板阅读仪(ELISAplatereader)(TecanUS,ResearchTrianglePark,NC))测定450纳米下的吸光度。为了检测RBD中二硫键还原对结合RBD特异性mAb的影响，用重组RBD-Fc或Sl-C9在llig/ml浓度下包^ELISA平板，然后以10mM浓度的二硫苏糖醇(DTT)在37。C下处理1小时，然后洗涤。接着在37。C下用50mM碘乙酰胺处理所述的孔l小时。洗涤后，如上所述进行标准ELISA^r测。用竟争性的ELISA来测定RBD特异性mAb对生物素标记的mAb与RBD-Fc结合的抑制活性。简而言之，该ELISA平板孔用如上所述的1jig/ml的RBD-Fc包被。加入一种包含50)ig/ml的未标记mAb和l|ig/ml生物素标记的mAb的混合物，然后在37。C下孵化1小时。依次加入HRP结合的链酶亲和素(Zymed)和TMB后，检测所述生物素标记的mAb的结合。根据厂家的方案，使用EZ-linkNHS-PEO固相生物素标记试剂盒(Pierce，Rockford,IL)进行mAb的生物标记。SJiS痕病善^袭的^和使用活的SARS-CoV的常规中和试验较为繁瑣并且必须在BSL-3设备中进行。我们为此在本实验室中建立了一种SARS-CoV假病毒体系(27，32,42,43)。该试验敏感而且定量，并且可以在BSL-2设备中进行。如前所述，制备带有SARS-CoV的S蛋白和一种表达荧光素酶作为报道基因的缺陷型HIV-1基因组的SARS假病毒(27,42,43)。简而言之，通过编码密码子最佳化的SARS-CoV的S蛋白的质粒和一种编码Env-缺失的、荧光素酶-表达性HIV-1基因组(pNL4-3.1uc.RE)以Fugene6试剂(BoehringerMannheim)共同转染"3T细胞。收获48小时后转染的包含SARS假病毒的上清液，并将其用于ACE2转染的293T(293T/ACE2)细胞的单循环感染。简而言之，在96孔组织培养板中以10"细胞/孔浓度培养293T/ACE2细胞，并且生长过夜。在加入细胞前，将包含假病毒的上清液用2倍系列稀释的小鼠血清或mAb于37。C下预孵化1小时。随后以新鲜培养基再次喂饲所述培养物24小时，并且再孵化48小时。用PBS洗涤细胞并使用溶解试剂将其溶解，所述溶解试剂包含在一种荧光素酶试剂盒(Promega,Madison,WI)中。细胞溶解产物的等分试样被转移到可在发光计中检测的96孔平底板(CorningCostar,Coming,NY)中，接着加入荧光素酶基质(Promega)。立即在Ultra384发光计(TecanUS)中测定相对光照单位(RLU)。m」6对i^Z)-Fc々爱傳^潜合通过流式细胞术^r测mAb对RBD-Fc与ACE2-表达细胞结合的抑制。简而言之，分离并收集到1(^的293T/ACE2细胞，并且用Hank's平衡盐溶液(HBSS)(Sigma,St,Louis,MO)洗涤。在存在或不存在50|ag/ml的mAb的情形下，将RBD-Fc加入所述细胞至终浓度为ljiig/ml，接着在室温下孵化30分钟。用HBSS洗涤细胞，并且以抗人IgG-FITC轭合物(Zymed)于l:50稀释度在室温下再孵化30分钟。洗涤后，用含有1。/。曱醛的PBS固定细胞，然后使用CellQuest软件在BectonFACSCalibur流式细胞仪(MountainView,CA)中分析。通过ELISA检测mAb对RBD-Fc与可溶性ACE2结合的抑制。简而言之，在0.1M碳酸盐緩沖液(pH9.6)中，将2jig/ml重组的可溶性ACE2(R&Dsystems,Inc.,Minneapolis,MN)包被至96孔ELISA板(ComingCostar)，4。C过夜。以2%脱脂牛奶封闭后，在存在或不存在50iag/ml小鼠mAb的情形下，将liig/mlRBD-Fc加入到所述孔内，并且在37。C下孵化1小时。洗涤后，加入HRP-结合的山羊抗人IgG(Zymed)，且再孵化l小时。洗涤后，使用基质TMB来检测。结果7^Z)#;^/i^^6W为、岸及初始或在在293T细胞中短暂表达，并以蛋白A纯化得到均一的RBD-Fc融合蛋白。在Ribi佐剂存在下，以RBD-Fc免疫五只小鼠(A到E)4次。初次加强免疫化后，所有动物均显示出可被观察到的抗RBD-Fc的抗体反应，并且其抗体效价随着之后的免疫而增加。第三次加强免疫后，收集4天的抗血清，显示出高度有效的抗SARS-CoV和带有SARS-CoVS蛋白的假病毒的中和活性。通过RBD-Fc免疫小鼠脾细胞与Sp2/0骨髓瘤细胞融合制备一组27个RBD特异性mAb,并且随后以Sl-C9作为抗原筛选杂交瘤。该mAb的表位特异性通过ELISA而最初确定，该ELISA使用RBD-Fc、DTT-还原的RBD-Fc、Sl-C9、DTT-还原的Sl-C9以及纯化的人IgG作为包被抗原(表I)。大部分的mAb(25/27)与天然的RBD-Fc和Sl-C9呈反应性，但是与DTT还原的RBD-Fc和Sl-C9不反应。这表明它们是针对S蛋白RBD上表达的二硫键依赖性的构象性表位。其它两个mAb(4D5和17H9)则既识别天然的又识别还原的RBD-Fc和S1-C9,这表明它们是针对RBD上存在的线型表位。Sl-C9筛选到与人IgG不反应的mAb,而来自于RBD-Fc免疫小鼠的对照抗血清则可与人IgG起反应(表1)。由于mAb4D5和17H9可以与所述还原的RBD-Fc和Sl-C9起反应，它们的表位可以用合成肽来定位。通过ELISA,用一组27个覆盖S蛋白RBD的重叠肽来定位4D5和17H9的表位。如图1所示，4D5与肽435-45l(NYNYKYRYLRHGKLRPF)起反应，而17H9与两个重叠肽442-458(YLRHGKLRPFERDISNV)和449-465(RPFERDISNVPFSPDGK)起反应。17H9的表位被清楚地定位于肽442-458和449-465的重叠序列(RPFERDISNV)上，而4D5的表位需要肽435-451的大部分序列，其与肽442-458和449-465的部分序列重叠。因此，这两种mAb识别RBD内的邻近线型表位。构象依赖性mAb与任何被测试的肽段都不反应(未显示数据)。遞过潜合《爭试發源;Ci5D##遂^或在挣并^为了确定构象依赖性表位的特性，通过结合竟争试验将所述RBD特异性mAb分组(表11)。首先用生物素标记其中一个mAb(10E7),且测定27个mAb对10E7与RBD-Fc结合的抑制活性。mAb4D5和17H9识别通过上述肽定位的线型表位，在竟争试验中作为对照。约一半的构象依赖性rnAb(13/25)与生物素标记的10E7竟争，而其它的mAb并不阻断10E7与RBD-Fc的结合。随后用生物素标记另外四个非竟争性mAb(l1E12、33G4、45B5和17H9)，并且通过结合竟争试验进行类似的检测。与生物素标记的10E7竟争的13个mAb中的5个，也阻断生物素标记的45B5与RBD-Fc的结合，并且被定义为一个单独的组。由此，将25个构象特异性的mAb分为六个不同的竟争组(定义为ConI-VI)。两个线型表位特异性的mAb(4D5和17H9)不与任何构象特异性mAb竟争。这些结果表明，S蛋白的RBD包含多个抗原结构，这些抗原结构在小鼠体内诱导特异性的抗体反应。然而，RBD中的优势免疫表位是构象依赖性的。逸錄f糸潜合W^46W《在RBD-Fc能够有效地结合至表达在293T/ACE2细胞上的ACE2以及可溶性的ACE2，这可以分别通过流式细胞术和ELISA检测(未显示数据)。我们检测了RBD特异性的mAb是否抑制RBD-Fc与细胞相关性的或可溶性的ACE2的结合。如图2所示，以一种高度一致的方式，全部的来自于ConfIV(28D6、30F9和35B5)和ConfV(24F4、33G4和38D4)的mAb均能完全阻断RBD-Fc与细胞相关性的和可溶性的ACE2的结合。全部的两种ConfIII制RBD-Fc与表达在293T/AEC2细胞上的ACE2和可溶性的ACE2的结合。所有其他的mAbs，包括两个抗线性序列的mAb在内，对于受体的结合没有显著抑制作用。这些结果显示，ConfIV和ConfVmAb识别的表位可能与S蛋白内的构象性受体结合位点相重叠。虽然在结合竟争试验中，这些mAb并不彼此相互竟争对抗。ConfIIImAb和两种ConfVImAb(19B2和45F6)也可与所述参与受体结合的构象性表位结合。全部的ConfI和ConfIImAb均不阻断受体的结合，这表明它们识别的构象性表位与RBD中的所述受体结合位点重叠。这些结果揭示了RBD特异性mAb的表位异质性，并且进一步表明了S蛋白的RBD中包含多个抗原性构象。朋D挣并控附屈J^"才放的尹和法丝检测每个RBD特异性mAb的抗SARS假病毒的中和活性。值得注意的是，绝大多数的构象依赖性mAb(23/25)具有有效的中和活性,其50%中和剂量(NDso)范围为0.005至6.569(ig/ml(表ni),而两个直接抗线型表位(4D5和17H9)的mAb和一个来自于ConfVI的mAb(44B5)在浓度高达100"g/ml下不中和SARS假病毒感染。阻断该受体结合的来自ConfV的mAb33G4和14来自ConfIV的30F9具有最高的抗假病毒中和活性。有趣的是，甚至具有相对较低,￡病毒中和活性的来自ConfVI的45F6能部分地阻断RBD-Fc与ACE2的结合。每组中若干具代表性的mAb的剂量依赖性的中和活性列于图3。这些结果表明，S蛋白的RBD主要诱导针对构象性表位的中和抗体。扭#论新近的研究显示，SARS-CoV的S蛋白是在感染期间引起免疫反应的主要抗原之一(44-46)。这表明S蛋白可以作为诱导中和mAb的免疫原。在该研究中，我们使用一种重组融合蛋白RBD-Fc作为免疫原来免疫小鼠，并且产生用于制备27种mAb的杂交瘤克隆。这些mAb中的大部分(25/27)识别构象性表位，其中23个mAb具有有效的中和活性。发现仅有两种mAb通过重叠肽映射到相邻的线型表位上，其不能中和SARS假病毒的感染。有趣的是，基于结合竟争实验，所述构象依赖性mAb可以被分成6个不同的组(即，ConfI-VI)，这揭示在可以引起中和抗体的RBD上，有若干种不同的构象性表位。用(ACE2为SARS-CoV的功能性受体)。然而，我们发现只有识别ConfIV和V的mAb能够有效地阻断RBD与ACE2的结合。一些与ConfIII和VI反应的mAb部分地抑制RBD与ACE2之间的相互作用，这表明其表位可能与RBD上的受体结合位点相重叠，或者这些mAb与RBD的结合可能导致该受体结合位点的构象改变，引起对RBD与ACE2的结合的抑制。识别ConfI和II的mAb对RBD与ACE2的结合没有显著性的影响，而且具有有效的中和活性，表明这些mAb抑制SARS-CoV感染而不干扰RBD-ACE2相互作用。这些mAb的作用机制需要进一步探索。这些数据表明，RBD诱导的中和抗体不仅对所述受体结合位点是特异的，而且对其它独特结构构象也是特异的，这阐明了其抗原异质性，并且揭示了SARS-CoV的S蛋白的RBD包含多个负责诱导有效的中和抗体反应的构象性表位。这里描述的SARS-CoV中和mAb的构象敏感性，与其它包膜病毒诱生的中和mAb的性能是一致的，而所述的其它包膜病毒一般要求更加天然的用于结合的构象(47，48)。尽管SARS-CoVS蛋白的RBD是一种193个氨基酸的小片段，但其包含七个半胱氨酸，并且其中五个对ACE2结合是必需的。这些半胱氨酸之间的二硫键可形成复杂的三级结构，以构建出多种抗原性构象。然而，选自非免疫性人抗体文库的中和人mAb能够与DDT-还原的S蛋白反应并且阻断受体的结合(49)。因此，需要进一步的特征来定义SARS-CoVS蛋白的RBD上的中和决定簇，并且这可提供用于开发抗SARS治疗剂和疫苗的关键信息。据报导，小鼠免疫血清的被动转输可减少SARS-CoV接种小鼠的肺病毒的复制(33，50)，中和mAb的预防性给药可在小鼠或雪貂(51,52)体内产生保护作用，这揭示了抗SARS抗体的被动免疫是一种控制SARS的可行策略。因此，具有高SARS-CoV中和活性的mAb可用于SARS-CoV感染的早期治疗。然而，由于人抗小鼠抗体(HAMA)反应(53-55)的存在，人体内的鼠mAb的应用将会受到限制。如果仅仅小剂量的鼠mAb被短期(一个到两个星期)用于早期的SARS-CoV感染中，可能不会导致严重的HAMA,而这紧急的治疗可能挽救SARS患者的生命。我们已经在Hantaan病毒(HTNV)感染的早期治疗中采取了相似的策略，即使用鼠抗HTNV的mAb(56)。此外，可以将所述的鼠中和mAb人源化作为治疗剂或免疫预防剂，为处于危险中的人群提供抗SARS-CoV感染的立即保护。本研究的重要意义有三层第一、生产了许多高效的RBD特异性中和mAb，其可开发为用于SARS紧急治疗的免疫治疗剂。第二、这些mAb可开发为用于检测SARS-CoV感染的诊断试剂。第三、这些mAb可用作研究SARS-CoVS蛋白的免疫原性、抗原性、结构和功能的探针。这些mAb可被进一步人源化而用于治疗和预防SARS。16表I、RBD特异性mAb抗不同抗原的反应性a<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>.使用的抗原为ljig/ml，被测mAb为10jag/迈l，且血清于l:IOO稀释度下检测。阳性反应以黑体字突出显示。表II、RBD特异性mAb对生物素化mAb与RBD-Fca的结合的抑制。/。a组竟争性mAb生物素化的mAb10E711E1233G445B517H9Confl9F784.5".7-13.322.316.410E791.05.6-12.921,09.912B11肪,819.3-0.219.821,018C284.919.34.918.119.424H893.724.07.025.622.126E1站.110.537.430.425.029G296.620.41.611.423.532H598.918.54.49,120.3Confll20E797.238.55.973,024.626A496.333.1-0.560.019.027C197,236.714.673.720.931H1297.518,77.158.419.730E1098.319.312.968.924.6Conflll11E1212.692.00.3"3.720.218D9-16.298.38-323.617.1ConflV28D639.799,613.867.426.630F928.7100.08.7沐032.435B534.999.910.064.733.6ConfV24F411.5-1.0诉.52.524.933G49.53.799.526.429.138D48.1-14-482.0-5.115.8ConfVI13B623.310.74.972.512.619B22.9-26.418.050.016.144B525.3-20.610.095.619.445F625.7-10.410.894.823.5线型4D513.010.6-11.11.0-10.517H917.833.3-5.825.097.8a于100jjg/ml下，通过ELISA检测竟争性mAb的阻断该生物素化mAb与RBD-Fc结合的能力。大于4(W抑制率被认为是阳性竟争的(数值见表)。负数表示增加生物素化试剂的结合。表III、抗SARS假病毒的RBD特异性mAb的—中和活性—<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>参考文献1.Drosten，C,S.Gunther，W.Preiser,W.S.VanDer,H.R.Brodt，S.Becker,H.Rabenau，M.Panning,LKolesnikova，R.A.Fouchier,A.Berger，A.M.Burguiere，J.Cinatl,M.Eickmann,N.Escriou,K.Grywna，S.Kramme，J.C.Manuguerra，S.Muller,V.Rickerts，M.Sturmer,S.Vieth，H.D.Klenk，A.D.Osterhaus,H.Schmitz,andH.W.Doerr.2003.Identificationofanovelcoronavirusinpatientswithsevereacuterespiratorysyndrome.N.EnglJ.Med.348:1967-1976.2.Ksiazek，T.G.，D.Erdman，CS.Goldsmith,S.R.Zaki，T.Peret,S.Emery,S.Tong,C.Urbani,J.A.Comer,W.Lim,P.E.Rollin，S.F.Dowell,A.E.Ling,CD.Humphrey,WJ.Shieh,J.Guarner，CD.Paddock,P.Rota,B.Fields,J.DeRisi，J.Y.Yang,N.Cox，J.M.Hughes,J.W.LeDuc，WJ.Bellini,andLJ.Anderson.2003.Anovelcoronavirusassociatedwithsevereacuterespiratorysyndrome.N.Engl.J.Med.348:1953-1966.3.Peiris,J.S.，S.T.Lai，L丄Poon，Y.Guan,L.Y.Yam，W.Lim,J.Nicholls，W.K.Yee，W.W.Yan,M.T.Cheung,V.CCheng,K.H.Chan，D.N.Tsang，R.W.Yung,T.K.Ng，andK.Y.Yuen.2003.Coronavirusasapossiblecauseofsevereacuterespiratorysyndrome.Lancet361:1319-1325.4.Marra，M.A.,SJ.M.Jones，CR.Astell，R丄Holt，A.Brooks-Wilson,Y.S.N.Butterfield，J.Khattra，J.K.Asano,S.A.Barber,S.Y.Chan,A.Cloutier，S.M.Coughlin,D.Freeman,N.Girn，0.L.Griffith,S.R.Leach，M.Mayo,H.McDonald,S.B.Mont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