专利名称：一种同时检测猪繁殖与呼吸综合征病毒经典株和变异株的试剂盒及其检测方法
技术领域：
本发明属于动物保护和质检领域，涉及一种猪繁殖与呼吸综合征病毒检测试剂盒 及其检测方法，尤其涉及一种猪繁殖与呼吸综合征病毒RT-PCR检测试剂盒及其检测方法。
背景技术：
2006年夏秋季节，江西、湖南、湖北、安徽及江苏南京、无锡、扬州、苏州等国内主 要养猪地区都会发生一种以高热、食欲下降、呼吸困难和繁殖障碍为主要特征的传染病，由 于病原尚未明确，根据病猪体温升高的临床特点，将该病称为“猪无名高热”或猪“高热病” 等。高热病广泛蔓延，流行数月。13 25周龄的生长育肥猪多发。发病率10% 80%不 等，死亡率20% 50%不等。共同症状表现为体温40. 5°C以上高烧不退，呼吸急促、咳嗽 或流鼻涕，多数病猪皮肤潮红。不同猪群尚表现便秘、腹泻、肢体麻痹、母猪流产和口鼻腔流 血等。所有病死猪都以表现严重的肺炎病变为典型特征，全身淋巴结水肿、出血，肝脏肿大 或有坏死点，脾脏肿大，皮下出血，胸腔和腹腔积水，胃底和小肠粘膜出血，心脏冠状沟出血 点，心包积液及膀胱粘膜出血点或斑等。以磺胺药为主或单纯地当蓝耳病、流感、猪瘟来防 治，结果均较差，对症治疗效果亦不佳。此次疫病的流行和发生给我国养猪业造成了巨大经 济损失，一些疫情严重的地区猪存栏量减少60%以上，不少中小型猪场因此而倒闭。此次疫 情的流行造成病死及淘汰猪数量达数千万头，这对中国的养猪业而言不能不说确是一场灾 难，这次灾难造成的损失要远大于1996年的猪繁殖与呼吸综合征病毒(蓝耳病)(PRRSV) 和2002年猪圆环病毒2型感染所致的断奶后多系统衰竭综合征(PMWS)，并引起了国务院、 农业部和社会的高度关注，而且世界动物卫生组织(OIE)及国外兽医界都投予了注视的目 光。2007年1月，猪“高热病”主要病原最终确定为变异PRRSV(NSP2 1594 1680变异株)， 并定名为高致病性猪蓝耳病。PRRSV变异株NSP2基因的第483位和535-563位氨基酸发生 缺失。目前临床诊断猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)变异株和经典株的方法主要 是采用RT-PCR，主要可分为两大类。一类是是分步检测，一次只能检测其中一种，譬如， 中国动物疫病预防控制中心的专利“猪繁殖与呼吸综合征病毒超强变异株RT-PCR试剂 盒” [200710086548]，这类方法重复操作、耗时较长、实验成本较高，容易带入人为误差，不 适合基层应用等特点。另一类是鉴别RT-PCR的方法，譬如，郝晓芳等建立的以NSP2为唯 一检测目的基因，以目标条带扩增大小为标准来鉴别PRRSV变异株和经典株[高致病性猪 繁殖与呼吸综合征病毒RT-PCR鉴别诊断方法的建立，中国预防兽医学报；2007，29(5) 704-709.]，何丹等建立的二重PCR诊断猪繁殖与呼吸综合征病毒美洲株与NSP2变异株 [猪繁殖与呼吸综合征病毒美洲株与NSP2变异株二重PCR诊断方法的建立及应用，广西农 业科学2009，40 (1) 84-87.]，这类方法以NSP2为唯一检测目的基因，但是NSP2是PRRSV基 因组中的高变区，存在较高的变异性，给实验结果带来潜在的不稳定性。非结构蛋白NSP9在不同PRRSV间同源性超过97. 5%，具有较高的保守性，可以作
4为PRRSV诊断的目的基因。本研究针对NSP2和NSP9基因序列设计两对引物，建立一种一 次反转录后多重PCR鉴定区分PRRSV变异株和经典株的方法。通过实验证明该方法具有敏 感性高、特异性好的特点，是一种快速准确检测PRRSV的方法。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种能准确、快速、灵敏、结果易于判读的用于 同时检测猪繁殖与呼吸综合征病毒经典株和变异株的引物对。本发明还要解决的技术问题是提供包含上述引物对的同时检测猪繁殖与呼吸综 合征病毒经典株和变异株的试剂盒。本发明最后要解决的技术问题是提供采用上述试剂盒同时检测猪繁殖与呼吸综 合征病毒经典株和变异株的方法。为解决上述技术问题，本发明的思路如下目前临床RT-PCR诊断猪繁殖与呼吸综合征病毒经典株，主要是针对0RF7 (N蛋白) 设计的引物，而RT-PCR诊断猪繁殖与呼吸综合征病毒变异株，则需要针对NSP2基因，两者 在基因上距离约13-14kb，而常见的反转录酶只能有效扩增8kb左右，所以无法一次反转录 后同时检测变异株和经典株。非结构蛋白NSP9在不同PRRSV间同源性超过97.5%，具有较 高的保守性，可以代替0RF7作为PRRSV诊断的目的基因。而且0RF7在基因组上距离NSP2 约6kb，常见反转录酶能够达到这个长度。本研究针对NSP2和NSP9基因序列设计两对引 物，建立一种一次反转录后多重PCR鉴定区分PRRSV变异株和经典株的方法。通过实验证 明该方法具有敏感性高、特异性好的特点，是一种快速准确检测PRRSV的方法。本发明采用的技术方案如下一种用于同时检测猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)经典株和变异株的引物对， 如 SEQ ID NO 1 和 SEQ ID NO :2、SEQ ID NO 3 和 SEQ ID NO 4 所示的核苷酸序列。一种同时检测猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)经典株和变异株的试剂盒，包括 如 SEQ ID NO 1 和 SEQ ID NO :2、SEQ ID NO 3 和 SEQ ID NO 4 所示的引物对。一种同时检测猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)经典株和变异株的试剂盒，包 括(1)猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)变异株阳性对照细胞灭活毒和猪繁殖与呼 吸综合征病毒(PRRSV)经典株阳性对照细胞灭活毒；(2)猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)变异株和经典株特异性引物对针对NSP2基因上游引物Pl -M SEQ IDNO 1所示；下游引物P2 如SEQ ID NO 2所示；针对NSP9基因上游引物P3 如SEQ IDNO 3所示；下游引物P4 如SEQ ID NO 4所示；(3) RNA 提取试剂由 Trizol 12mL,无菌 DEPC 水 500 μ L, RNA 酶抑制剂 24 μ L 组 成；(4) RT-PCR反应试剂由RT反应液200 μ L，其中含反转录引物序列RT引物如SEQ ID NO :4 所示，RNA 酶抑制剂 24 μ L，AMV 反转录酶 12 μ L，5 Xbuffer 60 μ L, dNTP25y L, 2 X PCR Master Mix 200 μ L 组成；
(5)电泳检测试剂由50 X TAE电泳缓冲液20mL, GoldView 100 μ L组成。利用上述试剂盒同时检测猪繁殖与呼吸综合征病毒经典株和变异株的方法，包括 如下步骤(I)RNA 的提取(Ia)取待检组织0. 5g，置于勻浆器或者研钵研碎后用1. 5mL D-Hanks液稀释；取 已研磨好的待检组织液，置1. 5mL灭菌离心管中，6000rpm离心5min ；(Ib)取步骤(Ia)离心得到的上清液300yL于1.5mL灭菌离心管中，加入ImL Trizol混勻，室温下放置IOmin ；再加入200 μ L氯仿混勻，室温下放置2min ；(Ic)将步骤(Ib)的灭菌离心管12000rpm离心lOmin，取600 μ L上层水相到另一 1.5mL灭菌离心管中，加入600 μ L异丙醇混勻，室温下放置IOmin ；(Id)将步骤(Ic)的灭菌离心管12000rpm离心lOmin，去上清，加入_20°C预冷的 75 % (ν/ν)乙醇溶液500 μ L，旋涡震荡混勻，7500rpm离心3min ；(Ie)去除步骤(Id)离心后的上清，37°C干燥，用30 μ L DEPC水溶解即用或_70°C 保存；(2)反转录取16 μ L mRNA 和如 SEQ ID NO 4 所示的 RT 引物 25pmol/U，0. 5 μ L 混勻于 PCR管中，放于PCR仪中65°C IOmin立即冰浴5min，再加入如下试剂5Xbuffer 5μ L, dNTP2 μ L, RNA酶抑制剂O. 5 μ L、AMV反转录酶0. 5 μ L，置PCR仪中50°C反转录lh，95°C 3min灭活反转录酶后，_20°C保存备用；(3) PCR 25口1^体系2\卩0 Master Mix 12. 5μ L ；ddH20 6.5 yL;上游引物 Pl 1 μ L ； 下游引物Ρ2 IyL;上游引物Ρ3 1^1^下游引物？4 1 μ L和模板(即步骤2的反转录 产物)2μ L ;PCR 反应条件95°C 3min ；94 °C 30s, 60 °C 30s, 72 °C 4 Os，35 个循环；72°C 8min ；(4)琼脂糖凝胶电泳准确称取0. 3g琼脂糖，加入20mL TAE置锥形瓶于微波炉中完全溶解后加入核酸 染料GoldView 6. Ομ L并倒入已放梳子的槽中，待其凝固后将PCR扩增产物取8μ L点于已 凝固的琼脂糖凝胶孔中，以5V/cm电压于TAE中电泳Ih ；(5)判断结果如果扩增出约680bp和380bp特异性两条片段，则表明待检组织猪繁殖与呼吸综 合征病毒(PRRSV)变异株阳性；如果仅扩增出了约380bp特异性片段，则表明待检组织猪繁殖与呼吸综合征病毒 (PRRSV)经典株阳性；如果没有扩增出片段，则表明待检组织猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)阴性。有益效果由于本发明采用的引物来自PRRSV不同基因中高度保守的区域，采用 该引物对能准确、快速、方便的判别病料中是否含有猪繁殖与呼吸综合征病毒变异株和经 典株，灵敏度达IO2TCID5tl ；本研究针对NSP2和NSP9基因序列设计两对引物，建立一种一次 反转录后多重PCR鉴定区分PRRSV变异株和经典株的方法。通过实验证明该方法具有敏感 性高、特异性好的特点，是一种快速准确检测PRRSV的方法。
图1为特异性试验电泳图。其中，M:DL2000，1 :PRRSV变异株，2 :PRRSV经典株，3 阴性对照。图2为退火温度选择试验电泳图。其中，1 :62°C，2 :60°C，3 :58°C，4 :56°C，5 54°C，6 阴性对照，M :DL2000。图3 为敏感性试验电泳图。其中，M :DL2000,1 =IO4TCID50, 2 =IO3TCID50, 3 IO2TCID5。，4 =IO1TCID5。，5 IOciTCID5。，6 阴性对照。图4为已知阳性病料验证试验电泳图。其中，M :DL2000,1 6 :PRRSV变异株阳性 病料，7:阴性对照。
图5为已知阳性病料验证试验电泳图。
具体实施例方式根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实 施例仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。实施例1 试剂盒的制备。1病毒株1. 1阴性对照样品的制备取灭菌的DEPC水，置_20°C冰箱保存。1. 2猪繁殖与呼吸综合征病毒变异株阳性对照样品的制备1. 2. IRPMI-1640 培养基的配制RPMI-1640 粉一袋(10. 4g，购自 Invitrogen 公司)，溶于 IOOOmL 三蒸水中，加 Hepes 5. 96g，丙酮酸钠0. llg, NaHCO3 2. 2g，搅拌充分溶解后，N2正压滤过除菌，4°C保存备用。1. 2. 2细胞培养用试剂的配制(一)双抗称取青霉素lg，链霉素6.42g，溶于160mL双蒸水，0. 22 μ m滤菌器滤 过除菌，分装后-20°C保存备用。(二)0.2%胰酶溶液称取胰蛋白酶0. 2g，溶解于IOOmL双蒸水中，0.22 μ m滤菌 器过滤除菌，-20°C保存备用。(三)PBS缓冲液称取氯化钠 8. Og,氯化钾 0. 2g，Na2HPO4 · 12H20 5. 367g， KH2PO4O. 2g，溶于IOOOmL双蒸水，分装后高压灭菌，4°C保存备用。1. 2. 3病料的采集和处理无菌采集疑似高热病发病猪场送检的血液和脾脏、肺脏、淋巴结等组织，冷藏保 存，及时处理。血液离心后收集血清，无菌分装成至少3等份，每份不少于0.5mL，编号 后-70°C保存备用；实质脏器剪碎，用玻璃研磨器研磨后加入MEM培养基稀释至1 10的 悬液，-20°C和室温反复冻融2次，加双抗及两性霉素，3000r/min离心lOmin，取上清用 0. 45 μ m微孔滤器除菌，同上分装，编号后-70°C保存备用。1.2. 4细胞培养将培养好的Marc-145细胞用胰酶消化，用加入10%胎牛血清、适量的双抗及两性霉素的RPMI-1640培养基重悬至适当浓度，接种于24孔板，置37°C、5% C02条件下培养。1.2. 5病毒分离用Mcar-145细胞进行病毒分离Marc_145细胞放入37°C、5% CO2条件下培养2d 长成单层后，吸弃培养基，用PBS缓冲液洗两遍，然后将滤过的病料悬液接种于Marc-145细 胞上，每个样品接种4个孔，接种量为100 μ L/孔，同时做阳性对照孔，各孔补充50 μ L无血 清的培养基，封好放入CO2培养箱中吸附60min。之后取出，弃除上清，加入0. 5mL的含2% 血清的维持液，重新置于37°C、5% CO2条件下培养，48h后观察细胞病变，之后每天观察细 胞，将出现病变的细胞培养孔做上标记。5 6d后将培养板放入-20°C冻存，第二天取出将 出现病变以及未出现病变的细胞培养液都收获，分装-70°C保存备用。1. 2. 6病毒的RT-PCR初步鉴定用北京世纪元亨动物防疫技术有限公司生产的PRRSV(NSP21594-1680变异株) RT-PCR检测试剂盒检测1. 2. 5获得的细胞毒，操作方法和结果判断按照试剂盒说明书进 行。1. 2. 7PCR产物回收测序与序列分析利用小量胶回收试剂盒纯化PCR产物，然后按常规方法克隆于T载体，由大连宝生 生物工程公司测序，用Vector NTI和DNAStar软件分析所插入的基因序列。NSP2蛋白的 第482位和533-561位氨基酸发生缺失29个氨基酸的确定为猪繁殖与呼吸综合征病毒变 异株。1. 2. 8猪繁殖与呼吸综合征病毒变异株灭活苗的制备取1. 2. 7鉴定的猪繁殖与呼吸综合征病毒变异株1000 μ L，加入5 μ L甲醛溶液， 37°C作用12小时以上，-20摄氏度保存备用。1. 3猪繁殖与呼吸综合征病毒经典株阳性对照样品的制备1. 3. 1按照1. 2. 1至1. 2. 5方法操作分离病毒，_20°C保存备用；1. 3. 2病毒的RT-PCR初步鉴定用北京世纪元亨动物防疫技术有限公司生产的PRRSV(NSP2 1594-1680变异株) RT-PCR检测试剂盒和猪繁殖与呼吸综合征病毒RT-PCR检测试剂盒检测1. 3. 2获得的细胞 毒，操作方法按照试剂盒说明书进行。PRRSV (NSP2 1594-1680变异株)RT-PCR检测试剂盒 检测阴性，猪繁殖与呼吸综合征病毒RT-PCR检测试剂盒检测阳性的毒株确定为猪繁殖与 呼吸综合征病毒经典株阳性。1. 3. 3猪繁殖与呼吸综合征病毒变异株灭活苗的制备取1. 2. 7鉴定的猪繁殖与呼吸综合征病毒经典株1000 μ L，加入5 μ L甲醛溶液， 37°C作用12小时以上，-20摄氏度保存备用。2试剂盒中其他成分的制造2. ITrizol 的制备购自Invitrogen 公司，200mL/ 瓶。2. 2RNA酶抑制剂的制备购自Takara 公司，10 μ L/管，50U/μ L。2. 3无菌DEPC水的制备
购自 Takara 公司，ImL/ 管。
取无水乙醇750mL，加入DEPC水250mL，混勻。2. 5AMV反转录酶的制备购自Promega 公司，100 μ L/ 管，IOU/ μ L。2. 62 X PCP master Mix 的制备购自南京博尔迪生物科技有限公司，ImL/管。2. 750 X TAE电泳缓冲液的制备0. 5mol/L乙铵四乙酸二钠((EDTA)溶液(pH8. 0)配制EDTA18. 61g灭菌双蒸水80mL氢氧化钠调pH至8. 0灭菌双蒸水加至100mL。50 X T AE电泳缓冲液配制三羟甲基氨基甲烷(Tris)242g冰乙酸57. ImL0. 5mol/L EDTA 溶液(ρΗ8· 0) IOOmL灭菌双蒸水加至lOOOmL。使用时灭菌双蒸水稀释50倍。2. 8Glodview核酸染料的制备购自上海赛百盛基因技术有限公司，ImL/管。2. 9上样缓冲液的制备购自南京博尔迪生物科技有限公司，ImL/管。2. 10引物的制备引物由上海英俊合成，20D/管实施例2:检测方法。利用实施例2的试剂盒同时检测猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)经典株和变异 株的方法，包括如下步骤(I)RNA 的提取(Ia)取待检组织0. 5g，置于勻浆器或者研钵研碎后用1. 5mL D-Hanks液稀释；取 已研磨好的待检组织液，置1. 5mL灭菌离心管中，6000rpm离心5min ；(Ib)取步骤(Ia)离心得到的上清液300yL于1.5mL灭菌离心管中，加入ImL Trizol混勻，室温下放置IOmin ；再加入200 μ L氯仿混勻，室温下放置2min ；(Ic)将步骤(Ib)的灭菌离心管12000印111离心101^11，取60(^1^上层水相到另一 1.5mL灭菌离心管中，加入600 μ L异丙醇混勻，室温下放置IOmin ；(Id)将步骤(Ic)的灭菌离心管12000rpm离心lOmin，去上清，加入_20°C预冷的 75 % (ν/ν)乙醇溶液500 μ L，旋涡震荡混勻，7500rpm离心3min ；(Ie)去除步骤(Id)离心后的上清，37°C干燥，用30 μ L DEPC水溶解即用或_70°C 保存；(2)反转录
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取16 μ L mRNA 和如 SEQ ID NO 4 所示的 RT 引物 25pmol/U，0. 5 μ L 混勻于 PCR管中，放于PCR仪中65°C IOmin立即冰浴5min，再加入如下试剂5Xbuffer 5μ L, dNTP2 μ L, RNA酶抑制剂0· 5 μ L、AMV反转录酶0. 5 μ L，置PCR仪中50°C反转录lh，95°C 3min灭活反转录酶后，_20°C保存备用；(3) PCR 25口1^体系2父？0 Master Mix 12. 5μ L ；ddH20 6.5 yL;上游引物 Pl 1 μ L ； 下游引物Ρ2 IyL;上游引物Ρ3 1仏；下游引物？4 1 μ L和模板(即步骤2的反转录产 物)2 μ L ；PCR 反应条件95°C 3min ； 94 °C 30s, 60 °C 30s, 72 °C 40s，35 个循环；72 °C 8min ；(4)琼脂糖凝胶电泳准确称取0. 3g琼脂糖，加入20mL TAE置锥形瓶于微波炉中完全溶解后加入核酸 染料GoldView 6. 0μ L并倒入已放梳子的槽中，待其凝固后将PCR扩增产物取8μ L点于已 凝固的琼脂糖凝胶孔中，以5V/cm电压于TAE中电泳Ih ；(5)判断结果如果扩增出约680bp和380bp特异性两条片段，则表明待检组织猪繁殖与呼吸综 合征病毒(PRRSV)变异株阳性；如果仅扩增出了约380bp特异性片段，则表明待检组织猪繁殖与呼吸综合征病毒 (PRRSV)经典株阳性；如果没有扩增出片段，则表明待检组织猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)阴性。实施例3:特异性试验。1 材料1.1 样品1. 1. 1其它猪易感病毒毒株日本乙型脑炎病毒(JEV)、猪瘟病毒(CSFV)、猪细小 病毒(PPV)、猪伪狂犬病毒(PRV)、猪圆环病毒(PCV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)，由本单 位保存。1. 1. 22份SPF猪肺和血清。1.1. 3PRRSV 北美型参考株(VR2332 毒株)。2 方法2.1特异性试验方法用新型猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV) RT-PCR检测试剂盒检测6株其它猪易感 病毒毒株，2份SPF猪肺和血清。考查试剂盒检测不同样品的特异性。3 结果3. 1检测其它猪易感病毒毒株、SPF猪样品和其它猪繁殖与呼吸综合征病毒结果用新型猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV) RT-PCR检测试剂盒检测其它猪易感病 毒毒株、SPF猪样品和其它猪繁殖与呼吸综合征病毒，结果均为阴性，PRRSV变异株扩增出 了约680bp和380bp特异性片段，经典株仅扩增出了约380bp特异性片段，表明该方法特异 性较好。结果见表1。表1特异性试验检测结果
10日本乙型脑炎病毒-猪瘟病毒-猪细小病毒-猪伪狂犬病毒-猪圆环病毒-猪传染性胃肠炎病毒-SPF猪肺-SPF猪血清-实施例4 退火温度选择试验。同实施例2的检测方法，所不同的是PCR反应条件为95°C 3min ；94°C 30s, 54-62°C 30s, 72°C 40s，35 个循环；72°C 8min ；在 PCR 仪上设定退火温度梯度54°C、56°C、 58°C、60°C、62°C。 紫外灯下观察，发现在54 V、56 °C、58 V、60 V、62 V均能清楚看见目的条带，但在 60°C时，条带最亮，且特异性最高(见图2)。实施例5:敏感性试验。用DEPC 灭菌水将 PRRSV 变异株病毒稀释成 IO0TCID50、IO1TCID50, IO2TCID50, IO3TCID50, IO4TCID50,检测方法同实施例2。结果在IO4TCID5Q、IO3TCID5Q、K^TCID5qUO1TCID5q时仍然可以扩增出明显目的条 带，IO0TCID50几乎看不见目的条带，表明该试剂盒敏感性较高。(见图3)。实施例6 阳性病料验证试验分别取6份采用北京世纪元亨动物防疫技术有限公司生产的PRRSV(NSP2 1594-1680变异株)RT-PCR检测试剂盒(生产批号PRRS200807)检测均为阳性的临床病料 和6份采用北京世纪元亨动物防疫技术有限公司生产的PRRSV RT-PCR检测试剂盒(生产 批号PRRS200807)检测均为阳性的临床病料，用实施例2的方法再次验证。发现结果和北 京世纪元亨动物防疫技术有限公司生产的试剂盒的结果完全一致，如图4、图5所示。SEQUENCE LISTING<110>金陵科技学院<120>—种同时检测猪繁殖与呼吸综合征病毒经典株和变异株的试剂盒及其检测 方法<130>JIT091020<160>4<170>PatentIn version 3.3<210>1<211>21<212>DNA<213>Artificial<220><223>针对NSP2基因的上游引物Pl
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<400>1aaagaccaga tggaggagga t 21<210>2<211>21<212>DNA<213>Artificial<220><223>针对NSP2基因的下游引物P2<400>2gatgatggct tgagctgagta21<210>3<211>24<212>DNA<213>Artificial<220><223>针对NSP9基因的上游引物P3<400>3atcttcttta tgaactcgcc tgtg24<210>4<211>20<212>DNA<213>Artificial<220〉<223>针对NSP9基因的下游引物P4<400>4tcttctttgg gtccgtctgg20
权利要求
一种用于同时检测猪繁殖与呼吸综合征病毒经典株和变异株的引物对，其特征在于如SEQ ID NO1和SEQ ID NO2、SEQ ID NO3和SEQ ID NO4所示的核苷酸序列。
2.一种同时检测猪繁殖与呼吸综合征病毒经典株和变异株的试剂盒，其特征在于包括 权利要求1所述的引物对。
3.根据权利要求2所述的同时检测猪繁殖与呼吸综合征病毒经典株和变异株的试剂 盒，其特征在于包括(1)猪繁殖与呼吸综合征病毒变异株阳性对照细胞灭活毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒 经典株阳性对照细胞灭活毒各eoouL ；(2)猪繁殖与呼吸综合征病毒变异株和经典株特异性引物对 针对NSP2基因上游引物P1 如SEQ ID NO 1所示；下游引物P2 如SEQ ID NO 2所示；针对NSP9基因上游引物P3 如SEQ IDN0 3所示；下游引物P4 如SEQ ID NO 4所示；(3)RNA 提取试剂由 Trizol 12mL,无菌 DEPC 水 450 ii L ；(4)RT-PCR反应试剂由RT反应液200ii L，其中含反转录引物序列:RT引物如SEQ ID NO 4 所示，RNA 酶抑制剂 24ii L，AMV 反转录酶 12 u L, 5 Xbuffer 60 u L, dNTP25 u L, 2XPCR Master Mix 200 u L 组成；(5)电泳检测试剂由50XTAE电泳缓冲液20mL,GoldView 100 u L组成。
4.采用权利要求1所述的试剂盒同时检测猪繁殖与呼吸综合征病毒经典株和变异株 的方法，其特征在于它包括如下步骤(1)RNA的提取(la)取待检组织0. 5g，置于勻浆器或者研钵研碎后用1. 5mL D-Hanks液稀释；取已研 磨好的待检组织液，置1. 5mL灭菌离心管中，6000rpm离心5min ；(lb)取步骤(la)离心得到的上清液300 ii L于1. 5mL灭菌离心管中，加入lmL Trizol 混勻，室温下放置lOmin ；再加入200 u L氯仿混勻，室温下放置2min ；(lc)将步骤(lb)的灭菌离心管12000rpm离心lOmin，取600ii L上层水相到另一 1. 5mL 灭菌离心管中，加入600 iiL异丙醇混勻，室温下放置lOmin ；(Id)将步骤(lc)的灭菌离心管12000rpm离心lOmin，去上清，加入_20°C预冷的75 % (v/v)乙醇溶液500 u L，旋涡震荡混勻，7500rpm离心3min ；(le)去除步骤(Id)离心后的上清，37°C干燥，用30iiL DEPC水溶解即用或_70°C保存；(2)反转录取16 ii L mRNA和如SEQ ID NO 4所示的RT引物25pmol/U、0. 5 u L混勻于PCR管中， 放于PCR仪中65°C lOmin立即冰浴5min，再加入如下试剂:5Xbuffer 5 ii L、dNTP2 ii L、RNA 酶抑制剂0. 5 ii L、AMV反转录酶0. 5 ii L，置PCR仪中50°C反转录lh，95°C 3min灭活反转录 酶后，-20°C保存备用；(3)PCR 25ii L 体系2XPCR Master Mix 12. 5u L ；ddH20 6. 5 ii L ；上游引物 PI 1 ii L ；下游引 物P2 11^;上游引物卩3 11^;下游引物？4 lyL禾口模板2iiL ；PCR 反应条件:95°C 3min ；94°C 30s,60°C 30s,72°C 40s, 35 个循环；72°C 8min ；(4)琼脂糖凝胶电泳准确称取0. 3g琼脂糖，加入20mL TAE置锥形瓶于微波炉中完全溶解后加入核酸染料 GoldVieW6. Oil L并倒入已放梳子的槽中，待其凝固后将PCR扩增产物取8ii L点于已凝固的 琼脂糖凝胶孔中，以5V/cm电压于TAE中电泳lh ；(5)判断结果如果扩增出约680bp和380bp特异性两条片段，则表明待检组织猪繁殖与呼吸综合征 病毒变异株阳性；如果仅扩增出了约380bp特异性片段，则表明待检组织猪繁殖与呼吸综合征病毒经典 株阳性；如果没有扩增出片段，则表明待检组织猪繁殖与呼吸综合征病毒变异株和经典均阴性。
全文摘要
本发明公开了一种用于同时检测猪繁殖与呼吸综合征病毒经典株和变异株的引物对，如SEQ ID NO1和SEQ ID NO2、SEQ ID NO3和SEQ ID NO4所示的核苷酸序列。本发明还公开了一种包含上述引物对的同时检测猪繁殖与呼吸综合征病毒经典株和变异株的试剂盒，及采用该试剂盒同时检测猪繁殖与呼吸综合征病毒经典株和变异株的方法。本发明的猪繁殖与呼吸综合征病毒检测试剂盒中的引物具较强的特异性、灵敏性及稳定性，为猪繁殖与呼吸综合征病毒的检测提供了快速、灵敏、特异的方法。
文档编号C12N15/11GK101928782SQ20091023402
公开日2010年12月29日 申请日期2009年11月19日 优先权日2009年11月19日
发明者何小明, 张志成, 戴鼎震, 方光远, 范红结, 陈钟鸣 申请人:金陵科技学院