猪呼吸与繁殖综合征病毒复制缺陷性病毒疫苗株的构建及应用的制作方法
【专利摘要】本发明属于疫苗制备领域，具体涉及一种猪呼吸与繁殖综合征病毒复制缺陷性病毒疫苗株的构建及应用。本发明中将猪呼吸与繁殖综合征病毒（PRRSV）Jiangxi-3株缺失部分Nsp9基因，得到复制缺陷性的Jiangxi-3株感染性克隆，同时将PRRSV的Nsp9基因克隆入Marc-145细胞，使其稳定表达Nsp9蛋白，将复制缺陷的PRRSV?Jiangxi-3株感染性克隆转染表达Nsp9蛋白的Marc-145细胞，拯救出具有复制能力的rVJiangxi-3毒株，获得复制缺陷性PRRSV病毒疫苗株。本发明所获得的疫苗具有良好的免疫原性，可同时保护PRRSV经典株和高致病性变异株的感染。
【专利说明】猪呼吸与繁殖综合征病毒复制缺陷性病毒疫苗株的构建及应用
【技术领域】
[0001]本发明属于疫苗制备领域，具体涉及一种利用Nsp9基因缺失构建PRRSV(porCinereproductive and respiratory syndrome virus,猪呼吸与繁殖综合征病毒)复制缺陷性病毒疫苗株的方法及其在疫苗生产方法中的应用。
【背景技术】
[0002]猪繁殖与呼吸综合征(porcine!^productive and respiratory syndrome,PRRS)是20世纪80年代末发现的一种高度传染性疾病，引起妊娠母猪的流产、死胎、木乃伊胎等生殖障碍，以及各种年龄猪(特别是仔猪)的呼吸道疾病。1987年美国首先报道了该病的发生。随后短短几年时间内，迅速遍及全球各养猪业发达的国家和地区。1996年，哈尔滨兽医研究所首次从国内疑似PRRS病例中分离到PRRS病毒，从而证实了本病在我国的存在。1991年,Lelystad的荷兰中央兽医研究所的Wensvoort博士用猪肺泡巨卩遼细胞首次分离到病原，并命名为Lelystad病毒(PRRSV欧洲型代表株)。1992年美国研究人员用CL2621细胞也分离到PRRSV美洲型代表株(VR-2332)。通过对这种病毒的形态、结构和抗原性等的研究，证明其为一种新发现的病毒。
[0003]其病原为猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratorysyndrome virus, PRRSV),属于新成立的尼多病毒目(order Nidovirales)、动脉炎病毒科(family Arteriviridae)、动脉炎病毒属(genus Arterivirus)。PRRSV 不同分离株核苷酸序列存在广泛而明显的变异，依据血清学试验及结构基因序列分析结果可将PRRSV划分为两种基本的基因型 :欧洲型(I型)和美洲株(II型)，前者主要流行于欧洲地区，而后者主要流行于美洲和亚太地区。但丹麦、斯洛伐克、加拿大已分别出现了两型PRRSV的感染。并且，丹麦发生的美洲型PRRSV的流行是由于美洲型PRRSV弱毒苗毒力返强的结果。虽然二个基因型的基因组核苷酸一致性仅55%~70%，但其形态结构、复制特点、细胞嗜性、流行传播方式及其引发的疾病特征等生物学特性均相同。
[0004]我国自2006年以来，由PRRSV变异株引起的“猪高致病性蓝耳病”是一种新型烈性传染病，它以流行广、传播快、发病率和致死率高、现行疫苗无保护作用为特征，而与经典猪蓝耳病截然不同，截止目前，本病已在我国20多个省份流行，最近我省部分中小猪场也未能幸免，沉重地打击了我国我省的养猪业，其经济损失已达到亿万元计。2008年高致病性猪蓝耳病在全国的流行较少，但2009下半年开始又出现了高致病性猪蓝耳病的爆发流行，在我国的北方省份如河南、安徽、山东等流行严重，造成了很大的经济损失。
[0005]在PRRSV中，ORFl是最大的I个阅读框，长约12kb，包括ORFla和ORFlb，约占病毒基因组的80%，为病毒的非结构蛋白编码区，Nsp9基因位于ORFlb上主要编码RNA依赖性的RNA聚合酶(RNA — dependent RNA polymerase, RdRp),参与病毒复制过程，高度保守。Nsp9的生物学功能与病毒的生物学以及临床特征有何关系尚不清楚。反向遗传技术为研究RNA病毒的复制、致病性、蛋白功能、病毒与宿主的相互作用以及开发新型疫苗和病毒载体提供了一个很好的技术平台。Siao-Kun Wan Welch等构建了分别缺失0RF2和0RF4的PRRSV复制缺陷性病毒疫苗株，但免疫猪后只产生较弱的免疫反应(Welch, S.K.，et al., Construction and evaluation of genetically engineeredreplication-defective porcine reproductive and respiratory syndrome virusvaccine candidates.Vet Immunol Immunopathol, 2004.102(3):p.277-90.X
[0006]猪繁殖与呼吸综合征(或猪蓝耳病)疫苗的研发是一个世界性难题，活疫苗普遍存在毒力偏强的问题，而灭活疫苗存在的主要问题是免疫效力欠佳。尽管目前针对PRRS的疫苗研究种类繁多，但没有一种疫苗可对猪体产生理想的安全保护作用。因此当前迫切需要研究出一种安全有效，免疫谱广的疫苗。
【发明内容】
[0007]为了克服上述现有技术存在的问题及缺点，本发明的首要目的在于提供一种构建病毒复制缺陷性PRRSV病毒疫苗株的方法。发明所应用的菌株为PRRSV Jiangx1-3株(GenBank Accession Number:EU200961.1),通过将 Nsp9 (Nonstructural protein9)基因进行部分缺失，实现PRRSV的复制性缺陷特性。
[0008]本发明的另一目的在于提供上述方法制备获得的病毒复制缺陷性PRRSV病毒疫苗株。
[0009]本发明的再一目的在于提供上述病毒复制缺陷性PRRSV病毒疫苗株的应用。
[0010]本发明的目的通过下述技术方案实现:一种构建病毒复制缺陷性PRRSV病毒疫苗株的方法，具体包含为dfPRRSV Jiangx1-3株缺失部分Nsp9基因，得到复制缺陷性的Jiangx1-3株感染性克隆，同时将PRRSV Jiangx1-3毒株的Nsp9基因克隆入Marc-145细胞，使其稳定表达Nsp9蛋白，将复制缺陷的PRRSV Jiangx1-3株感染性克隆转染表达Nsp9蛋白的Marc-145细胞，拯救出具有复制能力的rVJiangxi_3毒株，获得复制缺陷性PRRSV病毒疫苗株。
[0011]所述的PRRSV Jiangx1-3株来源于2006年“高热病”期间从江西省猪场分离鉴定(GenBank Accession Number:EU200961.1),该菌株已发表文献为:猪繁殖与呼吸综合征病毒流行株Jiangx1-3的全基因组序列分析，上海交通大学学报(农业科学院)，2009年2期。
[0012]所述的将PRRSV Jiangx1-3株缺失部分Nsp9基因为运用反向遗传操作和基因重组技术实现。
[0013]所述的缺失部分Nsp9基因优选为缺失PRRSV Jiangx1-3株基因组序列GenBankAccession Number EU200961.1的自5’末端第8241至8342位所示的102nt的核苷酸片段；
[0014]优选的，在将Jiangx1-3株Nsp9基因缺失102nt核苷酸的基础上，再在GenBankAccession Number EU200961.1的自5，末端第8241至8342位中插入限制性内切酶位点；所述的限制性内切酶位点优选为限制性内切酶Sbf I位点；
[0015]所述的rVJiangx1-3毒株可在稳定表达Nsp9蛋白的Marc-145细胞上稳定传代培养，但不能在猪体内或不表达Nsp9基因的细胞系中复制传代。
[0016]一种病毒复制缺陷性PRRSV病毒疫苗株由上述方法制备获得，该病毒疫苗株可在稳定表达Nsp9蛋白的Marc-145细胞上稳定传代培养，但不能在猪体内或不表达Nsp9基因的细胞系中复制传代。
[0017]上述病毒复制缺陷性PRRSV病毒疫苗株在制备预防和/或治疗猪呼吸与繁殖综合征疫苗中的应用。
[0018]本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果:
[0019]1.本发明通过CMV启动子控制下的体外转录和脂质体介导的直接转染稳定表达Nsp9蛋白的Marc-145细胞，获得了稳定传代的复制缺陷性的PRRSV Jiangx1-3株拯救病毒rVJiangx1-3，其基因组的Nsp9编码区中缺失长度为102nt的核苷酸片段。在缺失区中引入了限制性酶切位点Sbf I使建立血清学和分子生物学诊断方法成为可能。引入的唯一限制性酶切位点Sbf I也使后续分子操作更加方便。所以rVJiangx1-3可成为PRRS标记疫苗和动脉炎病毒载体的理想候选对象，有效解决了此类疫苗存在的上述问题。
[0020]2.拯救的PRRSV克隆病毒rVJiangx1-3在体外具有良好的遗传稳定性，与亲本病毒PRRSV Jiangx1-3相比，在稳定表达Nsp9蛋白的Marc-145细胞上的复制与增殖没有显著差别，而在不表达Nsp9蛋白的Marc-145细胞上培养不增殖不产生病变。 [0021]3.动物感染试验表明，rVJiangx1-3株的致病性比亲本病毒低，对猪不产生任何临床症状，由于在猪体内病毒不能复制，但可以表达其编码的结构蛋白和非结构蛋白刺激猪体产生免疫反应。在构建的复制缺陷性的rVJiangx1-3株在其Nsp9基因内缺失了 34个氨基酸，可以缺失的多肽开发鉴别诊断方法。
[0022]4.疫苗效力试验显示，本发明利用病毒复制缺陷性PRRSV病毒疫苗株制备获得的疫苗具有高的疫苗效力，病毒复制缺陷性PRRSV病毒疫苗第5代( 105 5TCID50)经5倍稀释后，仍然对猪繁殖与呼吸综合征(或猪蓝耳病)的防治具有显著的效果。
[0023]5.发明构建的猪呼吸与繁殖综合征病毒复制缺陷性病毒具有良好的免疫原性，可同时保护猪呼吸与繁殖综合征病毒经典株和高致病性变异株的感染。
【专利附图】
【附图说明】
[0024]图1为Jiangx1-3株复制缺陷性病毒感染性克隆构建示意图。
[0025]图2为Jiangx1-3株拯救病毒间接免疫荧光鉴定图。其中，A为rVJiangXi_3dl02感染Marc-145细胞36小时后IFA鉴定结果；B为rVJiangxi_3dl02感染Marc-145_Nsp9细胞36小时后IFA鉴定结果。
[0026]图3为PRRSV分别在Marc-145细胞和稳定表达Nsp9的Marc-145细胞上的生长曲线。
[0027]图4为rVJiangx1-3(第20代)与PRRSV Jiangxi_3Nsp9编码区的部分序列比较。
[0028]图5为拯救病毒免疫仔猪抗体的动态变化。
[0029]【具体实施方式】
[0030]下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
[0031 ] 本发明的PRRSV Jiangx1-3株复制缺陷性病毒疫苗株，所使用的原始毒株Jiangx1-3株来源于2006年“高热病”期间从江西省某猪场分离鉴定(GenBank AccessionNumber:EU200961.1)，(已发表文献为:猪繁殖与呼吸综合征病毒流行株Jiangx1-3的全基因组序列分析，上海交通大学学报(农业科学院)，2009年2期)，利用反向遗传操作和基因重组技术将Jiangx1-3株缺失部分Nsp9基因,得到复制缺陷性的Jiangx1-3株感染性克隆，同时将Jiangx1-3毒株的Nsp9基因克隆入Marc-145细胞,使其稳定表达Nsp9蛋白，复制缺陷性PRRSV Jiangx1-3株感染性克隆转染表达Nsp9蛋白的Marc-145细胞，拯救出具有复制能力的rVJiangx1-3毒株,此毒株可在稳定表达Nsp9蛋白的Marc-145细胞上稳定传代培养，但不能在猪体内或不表达Nsp9基因的细胞系中复制传代。
[0032]实施例1:含有Nsp9缺失编码区的重组载体pACYC-Jiangx1-3dl02的构建
[0033]本实施例是PRRSV Jiangx1-3基因组全长cDNA将Nsp9编码区中缺失长度为102bp的核苷酸片段，并将其克隆到质粒PACYC177载体中得到重组载体。所述核苷酸片段的核昔酸序列如GenBank Accession Number EU200961的自5’未端第8241至8342位所
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[0034]1、含有Nsp9缺失编码区的核苷酸片段的重组载体的构建
[0035]根据Jiangx1-3全序列(GenBank序列号EU200961)和质粒载体pACYC177的限制性酶切位点，用软件设计克隆和检测引物(如表1)，引物由上海英骏生物技术公司合成。
[0036]表1用于构建PRRSV Jiangx1-3株感染性克隆的引物序列
【权利要求】
1.一种构建病毒复制缺陷性PRRSV病毒疫苗株的方法，其特征在于具体包含为:将PRRSV Jiangx1-3株缺失部分Nsp9基因，得到复制缺陷性的Jiangx1-3株感染性克隆，同时将PRRSV Jiangx1-3毒株的Nsp9基因克隆入Marc-145细胞，使其稳定表达Nsp9蛋白，将复制缺陷的PRRSV Jiangx1-3株感染性克隆转染表达Nsp9蛋白的Marc-145细胞，拯救出具有复制能力的rVJiangx1-3dl02毒株，获得复制缺陷性PRRSV病毒疫苗株。
2.根据权利要求1所述的构建病毒复制缺陷性PRRSV病毒疫苗株的方法，其特征在于:所述的PRRSV Jiangx1-3株来源于2006年“高热病”期间从江西省猪场分离鉴定，其GenBank Accession Number:EU200961.1。
3.根据权利要求1所述的构建病毒复制缺陷性PRRSV病毒疫苗株的方法，其特征在于:所述的将PRRSV Jiangx1-3株缺失部分Nsp9基因为运用反向遗传操作和基因重组技术实现。
4.根据权利要求1所述的构建病毒复制缺陷性PRRSV病毒疫苗株的方法，其特征在于:所述的缺失部分Nsp9基因为缺失PRRSV Jiangx1-3株基因组序列GenBank AccessionNumber EU200961.1的自5’末端第8241至8342位所示的102nt的核苷酸片段。
5.根据权利要求1所述的构建病毒复制缺陷性PRRSV病毒疫苗株的方法，其特征在于:所述的缺失部分Nsp9基因为缺失PRRSV Jiangx1-3株基因组序列GenBank AccessionNumber EU200961.1的自5’末端第8241至8342位所示的102nt的核苷酸片段，并且在第8241至8342位中插入限制性内切酶位点。
6.根据权利要求5所述的构建病毒复制缺陷性PRRSV病毒疫苗株的方法，其特征在于:所述的限制性内切酶位点为限制性内切酶Sbf I位点。
7.—种病毒复制缺陷性PRRSV病毒疫苗株由权利要求1~6任一项所述的方法制备获得。`
8.权利要求1所述的病毒复制缺陷性PRRSV病毒疫苗株在制备预防和/或治疗猪呼吸与繁殖综合征疫苗中的应用。
【文档编号】A61K39/12GK103773740SQ201310703956
【公开日】2014年5月7日 申请日期:2013年12月19日 优先权日:2013年12月19日
【发明者】宋长绪, 蒋智勇, 蔡汝健, 李艳, 刘燕玲, 张乐宜 申请人:广东省农业科学院动物卫生研究所