专利名称：肾综合征出血热检测方法及检测试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及传染病学、分子生物学和免疫学领域。更具体地，本发明涉及肾综合征出血热的检测方法和检测试剂盒。
肾综合征出血热(HFRS)是由肯尼亚病毒科汉坦病毒属(Hanta Virus)中某些病毒引起的人类急性传染病。发病后死亡率很高，因此早期的正确诊断非常必要。在我国，肾综合症出血热(HFRS)是除病毒性肝炎外危害最大的一种传染病，本病的疫区范围涉及欧亚非等世界各地，我国的发病人数亦无减少趋势。在上海浦东地区，由于外来人口的增多，HFRS的发病居多不下。因此，对该病的早期快速诊断和及时治疗，对人民的生命健康具有现实意义。
汉坦病毒是HFRS的病原体，该病毒血清学诊断国内常用的免疫荧光技术和酶联免疫试验(ELISA)检测特异性抗体IgG与IgM，都存在一定的局限性，检测时间至少也要4小时，国外开发的高密度颗粒凝集试验(HDPA)能在1小时内完成检测，但尚未在国内普遍推广。
斑点金免疫渗滤试验(滴金法)是最新的先进、快速技术，曾成功地用于多种传染病的检测，但尚未见用于HFRS检测的试剂盒面市。滴金法具有操作简便、快速(可在几分钟内完成)及特异性高等特点，因此是一种HFRS的早期快速诊断提新的有实用价值的候选检测方法，特别适于在基层医疗单位推广应用。
尽管，某些文献描述了一些用金标法检测肾综合征出血热的方法，但是完全按照这些文献所公开的方法和程序重复进行实验时，却无法获得令人满意的结果，甚至根本无法检测。在《中国医学检验杂志)》1998年3月第21卷第2期中，公开了一种滴金法检测肾综合征出血热血清特异性IgM的方法，但是完全按照该法却无法重复实验结果。其原因可能是抗原的制备方法有问题。
目前，在开发肾综合征出血热滴金法检测和试剂盒时，因为IgM抗体产生的时间最早，所以为了早期检测都把注意力集中在检测IgM上。没有公开过任何针对IgG的滴金法和试剂盒。
因此，迫切需要一种能快速、正确和简便的诊断肾综合征出血热的方法和试剂盒。
本发明的目的就是提供一种快速、正确和简便的检测肾综合征出血热的方法及相应的检测试剂盒。
一方面，本发明提供了一种检测样品中是否含有抗汉坦病毒的IgG抗体的方法，它包括步骤(a)将纯化的汉坦病毒核蛋白包被在硝酸纤维素膜上，形成在点样区中包被有汉坦病毒核蛋白的硝酸纤维素检测膜；(b)以非人的抗人IgG抗体和胶体金为原料，制备胶体金-抗人IgG抗体的结合物；(c)将待检测的血清样品滴加在步骤(a)中获得的检测膜的点样区上；(d)洗涤步骤(c)的检测膜的点样区；(e)将步骤(b)的胶体金-抗人IgG抗体的结合物滴加在点样区上；(f)洗涤步骤(e)的检测膜的点样区；点样区出现红色斑点表示样品中存在抗汉坦病毒的IgG抗体，不出现红色斑点表示样品中不存在抗汉坦病毒的IgG抗体。
另一方面，本发明提供了一种检测肾综合征出血热的检测试剂盒，该试剂盒包含硝酸纤维素膜，在该膜的点样区包被有纯化的汉坦病毒抗原，胶体金-非人抗IgG抗体结合物溶液，和可选的洗涤缓冲液。
本发明还提供了一种检测样品中是否含有抗汉坦病毒的IgM抗体的方法，它包括步骤(a)将纯化的汉坦病毒抗原包被在硝酸纤维素膜上，形成在点样区中包被有汉坦病毒核蛋白的硝酸纤维素检测膜，其中该纯化的抗原是如下制备的收集培养的接种过汉坦病毒的宿主细胞，经2800-3200rpm 20-40分钟粗离心后，取上清液在35000-45000rpm离心1-4小时，弃去上清液，沉淀即为纯化的汉坦病毒抗原；(b)以非人的抗人IgM抗体和胶体金为原料，制备胶体金-抗人IgM抗体的结合物；(c)将待检测的血清样品滴加在步骤(a)中获得的检测膜的点样区上；(d)洗涤步骤(c)的检测膜的点样区；(e)将步骤(b)的胶体金-抗人IgM抗体的结合物滴加在点样区上；(f)洗涤步骤(e)的检测膜的点样区；
点样区出现红色斑点表示样品中存在抗汉坦病毒的IgM抗体，不出现红色斑点表示样品中不存在抗汉坦病毒的IgM抗体。
本发明是基于如下意外发现基础上完成的在受到汉坦病毒感染后，IgG会很快产生，因而可作为检测对象。众所周知，在受到感染后，通常IgM抗体最早产生。而IgG抗体的产生则较慢，而且IgG的滴度较低，因此通常不适宜作为滴金法的检测对象。然而，本发明的发明人发现，在受到汉坦病毒感染后，IgG会很快产生(约1-2天内)，而且滴度水平可以达到滴金法的检测灵敏度。并在此基础上完成了本发明。
无论是选择IgG还是IgM作为检测对象，为了成功地进行滴金法检测，汉坦病毒抗原的制备很关键。通常要求纯度高，与IgG和IgM结合特异的抗原，在本发明的一个实施例中，采用分步离心的方法来制备抗原，即收集培养的接种过汉坦病毒的宿主细胞，经2800-3200rpm 20-40分钟粗离心后，取上清液在35000-45000rpm离心1-4小时，弃去上清液，沉淀即为纯化的汉坦病毒抗原(核蛋白)。
为了获得汉坦病毒，可以将其接种于一些采用的宿主细胞，如Vero-E6细胞和沙鼠肾细胞。较佳地，可接种于沙鼠肾细胞。
接种后，在35-37℃按常规方法传导培养7-10天后，可收获病毒。培养方法可参见例如《现代微生物学实验技术及其应用)》，人民卫生出版社，1997年10月；《医学病毒学及实验技术》1990年，科学出版社；和《医学实验病毒学》人民军医出版社，1985年等文献。
在获得了纯化的汉坦病毒抗原之后，可用常规方法将其包被在检测膜的点样区上。
为了消除非特异性结合，获得的在点样区中包被有汉坦病毒核蛋白的硝酸纤维素检测膜还经过预结合处理，例如用0.75-1.5％BSA溶液封闭2-24小时。封闭时间也可进一步延长。但通常2小时就足够了。
在本发明中，可供使用的与IgG抗体结合的双抗可以是任何非人的抗人IgG抗体，它们包括(但并不限于)羊抗人IgG抗体，小鼠抗人IgG抗体和兔抗人IgG抗体较佳地，是羊抗人IgG抗体，上述非人的抗人IgM抗体可用常规方法制备，或购买得到；在本发明中，可供使用的检测膜可以是平均孔径在0.3-1.2微米之间的各种材质膜。较佳地，所用的是硝酸纤维素膜。各种规格的膜的平均孔径不同，因此，在制备检测膜时，应根据孔径大小来确定胶体金的颗粒大小(粒径)。这可通过控制胶体金制备过程中柠檬酸钠与水的重量比。研究表明，柠檬酸钠用量增加，胶体金粒径下降。具体用量可通过常规实验确定。例如当该硝酸纤维素膜的平均孔径为0.65微米时，在用柠檬酸还原法制备的并且在制备时柠檬酸钠与水的重量比为0.035-0.045∶100，较佳地0.038-0.042∶100，最佳地约0.04∶100。用这样的胶体金所制备的胶体金-抗人IgM或IgG抗体结合物可以有效地渗透入0.65微米的膜中。
通常，在柠檬酸还原法制备胶体金的常规方法中氯金酸与水的重量比0.0075-0.03∶100，较佳地约0.01-0.02∶100。
在获得了胶体金和抗人IgG抗体(或抗人IgM抗体)后，两者的偶联可根据常规方法进行。例如如下进行制备以10毫升胶体金溶液为基准，加入8-30微克的非人抗人IgG抗体，静置后加BSA，使BSA终浓度为1％，再静置后，加入聚乙二醇(PEG)0.8-0.12克(防止胶体金自聚沉淀)，混匀，加入适量防腐剂。制得胶体金-抗人IgG抗体(或抗人IgM抗体)结合物溶液。其中，偶联时，抗人IgG抗体(或抗人IgM抗体)的用量上限也可进一步提高，这样做虽对检测结果无影响，但是出于减低成本，用量宜为8-30微克/10毫升胶体金溶液，较佳地9-20毫克/10毫升胶体金溶液，更佳地10-15毫克/10毫升胶体金溶液。
在检测时，通常包括如下步骤A、取包被了汉坦病毒抗原的检测膜，在下方垫一次性吸水材料。
B、在点样区上滴加适量(通常1滴即足够)洗涤缓冲液(如PBS-Tween 20缓冲液)，以活化膜表面。待渗入即可(该活化步骤可省略)。
C、在点样区滴加适量血清样品，待渗入即可。
D、在点样区滴加适量洗涤缓冲液，以洗涤点样区。可重复洗涤2-5次，通常共3次。
E、在点样区滴加适量(通常1滴即可)本发明的胶体金-羊抗人IgG抗体结合物(或胶体金-羊抗人IgG抗体结合物溶液)。
F、在点样区滴加适量洗涤缓冲液，以洗涤点样区。可重复洗涤2-5次，通常共3次。观察结果，在点样区出现红色斑点为阳性，无红色斑点为阴性。
为了更准确地检测，可同时检测IgM和/或使用阳性和阴性对照。在试剂盒中，也可包含选自下组的物质胶体金-非人抗IgM抗体结合物溶液，阳性和阴性对照。
本发明方法制备的汉坦病毒抗原非常适合作为金标法检测肾综合征出血热的抗原蛋白。选用该核蛋白制作的金标检测试纸，在检测样品中是否存在抗汉坦病毒的抗体时，灵敏度大大提高，可以快速和正确地得出受检对象是否被汉坦病毒所感染，从而十分有利于降低肾综合征出血热的死亡率。
此外，由于被检测的IgG抗体的特异性远高于IgM抗体，所以可有效地降低假阳性，并且有利于临床确诊肾综合征出血热。
此外，本发明的检测方法简便，使用极其简单，不需要特殊的培训就可掌握，因此非常适合检测肾综合征出血热这一在经济较不发达地区(尤其是半开垦地，城乡结合区)发病率较高的疾病。
下面结合实施例进一步阐述本发明，这些实施例仅用于说明目的而不用于限定本发明范围。
实施例1汉坦病毒抗原的制备将野鼠型汉坦病毒株76-118接种于沙鼠肾细胞，按常规方法在35-37℃传导培养7-10天后，收集细胞培养物。
超声波破细胞处理之后，于3000rpm粗离心30分钟，以去除细胞膜碎片等杂质。取上清液，在40000rpm离心2小时以便使汉坦病毒抗原沉淀。弃去上清液，取沉淀。沉淀溶解后，测定溶液中蛋白含量。如蛋白含量较低，可再离心浓缩，使汉坦病毒抗原的终浓度为1-2MG/ML。
实施例2胶体金的制备在250毫升三角烧瓶中加入100毫升去离子双蒸水，加1％柠檬酸钠4毫升，煮沸后迅速加入1％氯金酸1毫升。继续煮沸15分钟，冷却后用0.1M碳酸钾将pH调至8.5。
实施例3胶体金-羊抗IgG抗体结合物的制备(a)羊抗IgG抗体的制备将购自上海市生物制品研究所的羊抗IgG抗体，经硫酸铵纯化处理后备用。
(b)稳定性试验由于购买的(或用常规方法制备的)各种生物制品的效价存在波动，因此，为了提高重复性，宜对各批抗体继续稳定性试验，以确定最佳的抗体添加量。
以一批抗体浓度约为1毫克/毫升的羊抗IgG抗体溶液为例。在1毫升在实施例2中制备的胶体金溶液中，分别加入0微升、2微升、4微升、6微升、8微升、10微升、12微升的，在室温下混合均匀后，在室温下静置10分钟。在每管中加入10％氯化钠0.1毫升，混合均匀后，在室温下静置2小时。保持红色不变且加入量最少(为了节约成本，减少浪费)的一管，即为稳定1毫升胶体金溶液所需的最佳蛋白量。通常，可在该最佳蛋白量的基础上再加10％，作为标记抗体的实际用量。结果发现，在加人6微升时可产生红色，且红色变化不大。在加入8微升和10微升时，产生的红色保持不变。因此，将该批抗体实际添加量定为11微升。
(c)制备胶体金-羊抗IgG抗体结合物溶液取10毫升实施例2中新鲜制备胶体金溶液，加入11微升羊抗人IgG抗体，10分钟后加5％BSA，使BSA终浓度为1％。室温下静置10分钟后，加入聚乙二醇(PEG)0.1克(防止胶体金自聚沉淀)，混匀，加10％叠氮化钠(NaN3)75微升(起防腐作用)。
实施例4检测膜的制备1.将0.65微米硝酸纤维素膜用软铅划成1厘米×1厘米的小格。
2.在每小格的中央(点样区)滴加1微升实施例1中的汉坦病毒抗原(核蛋白)溶液。
3.膜在室温中干燥后，用1％BSA封闭2小时，以便去除非特异性结合，从而进一步降低假阳性机率。
实施例5胶体金-羊抗IgM抗体结合物的制备重复实施例3，不同点仅在于，用羊抗IgM抗体(购自上海市生物制品研究所)代替羊抗IgG抗体。
实施例6样品的检测A、取实施例4中制备的检测膜，在下方垫一次性吸水材料。
B、在点样区上滴加PBS-Tween 20缓冲液1滴，以活化膜表面。待渗入即可。
C、在点样区滴加10微升血清样品。待渗入即可。
D、在点样区滴加PBS-Tween 20缓冲液1滴，以洗涤点样区。重复洗涤2次。
E、在点样区滴加实施例3中制备的胶体金-羊抗人IgG抗体结合物(或实施例3中制备的胶体金-羊抗人IgG抗体结合物溶液)1-2滴。
F、在点样区滴加PBS-Tween 20缓冲液1滴，以洗涤点样区。重复洗涤2次。
观察结果，在点样区出现红色斑点为阳性，无红色斑点为阴性。
通过对2组ELISA法检测为阳性的血清样品(分别30个样品和20个样品)，20例阴性样品，和15例正常人样品的检测，可以在3-8分钟内即获得检测结果。对于50例阳性样品，有46例检测为阳性(这是因为滴金法的灵敏度稍低于ELISA法所导致的结果)且所有阴性或正常样品都为阴性。由于受汉坦病毒感染后很短时间内受感染者体内相应的IgM和IgG抗体就迅速上升(达到或大大超过滴金法的检测灵敏度)，因此在实际临床检测时的准确性预计将更高。
实施例7-8重复实施例6，不同点仅在于实施例7中省略步骤B；实施例8中用蒸馏水代替PBS-Tween 20缓冲液。
结果，对检测结果无影响。
实施例9试剂盒的制备将实施例4制备的检测膜划成1厘米×1厘米的小片(具有一个点样区，检测IgG或IgM)，或1厘米×2厘米的小片(具有2个点样区，在一片上检测IgG和IgM)，或2厘米×2厘米的小片(具有4个点样区，在一片上检测IgG和IgM并且具有阳性和阴性对照)。
将各小片膜(点样区朝上)分别装在相应大小的塑料盒中，在点样区上方开有直径约0.6厘米的小孔，在膜下方垫入一次性吸水材料。
在各塑料盒中，再放置每管0.5毫升的实施例3中制备的胶体金-羊抗人IgG抗体结合物和/或实施例3中制备的胶体金-羊抗人IgG抗体结合物溶液。
此外，试剂盒可同时装有洗涤液，如PBS-Tween 20缓冲液。
权利要求
1.一种检测样品中是否含有抗汉坦病毒的IgG抗体的方法，其特征在于，它包括步骤(a)将纯化的汉坦病毒核蛋白包被在硝酸纤维素膜上，形成在点样区中包被有汉坦病毒核蛋白的硝酸纤维素检测膜；(b)以非人的抗人IgG抗体和胶体金为原料，制备胶体金-抗人IgG抗体的结合物；(c)将待检测的血清样品滴加在步骤(a)中获得的检测膜的点样区上；(d)洗涤步骤(c)的检测膜的点样区；(e)将步骤(b)的胶体金-抗人IgG抗体的结合物滴加在点样区上；(f)洗涤步骤(e)的检测膜的点样区；点样区出现红色斑点表示样品中存在抗汉坦病毒的IgG抗体，不出现红色斑点表示样品中不存在抗汉坦病毒的IgG抗体。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，该纯化的汉坦病毒核蛋白是如下制备的收集培养的接种过汉坦病毒的宿主细胞，经2800-3200rpm 20-40分钟粗离心后，取上清液在35000-45000rpm离心1-4小时，弃去上清液，沉淀即为纯化的汉坦病毒核蛋白。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，该宿主细胞选自下组沙鼠肾细胞和Vero-E6细胞。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，该非人的抗人IgG抗体选自下组羊抗人IgG抗体，小鼠抗人IgG抗体，小鼠抗人IgG抗体和兔抗人IgG抗体。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，该硝酸纤维素膜的平均孔径为0.65微米，而且该胶体金是用柠檬酸还原法制备的并且在制备时柠檬酸钠与水的重量比为0.035-0.045∶100，而氯金酸与水的重量比0.0075-0.03∶100。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(a)中获得的在点样区中包被有汉坦病毒核蛋白的硝酸纤维素检测膜还经过如下处理用0.75-1.5％BSA溶液封闭2-24小时。
7.如权利要求1所述方法，其持征在于，步骤(b)中，胶体金-抗人IgG抗体的结合物是如下进行制备的以10毫升胶体金溶液为基准，加入8-30微克的非人抗人IgG抗体，静置后加BSA，使BSA终浓度为1％，再静置后，加入聚乙二醇0.8-0.12克，混匀，加入适量防腐剂。
8.一种检测肾综合征出血热的检测试剂盒，其特征在于，该试剂盒包含硝酸纤维素膜，在该膜的点样区包被有纯化的汉坦病毒抗原，胶体金-非人抗IgG抗体结合物溶液，和可选的洗涤缓冲液。
9.如权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，还包含选自下组的物质胶体金-非人抗IgM抗体结合物溶液，阳性和阴性对照。
10.如权利要求8和9所述的试剂盒，其特征在于，硝酸纤维素膜的平均孔径为0.65微米，该非人抗IgG抗本是羊抗人IgG抗体，而且该汉坦病毒抗原如下得到的收集培养的接种过汉坦病毒的宿主细胞，经2800-3200rpm 20-40分钟粗离心后，取上清液在35000-45000rpm离心1-4小时，弃去上清液，沉淀即为纯化的汉坦病毒核蛋白，溶解后使终浓度为1毫克/毫升。
全文摘要
本发明提供了一种滴金法检测肾综合征出血热检测方法及检测试剂盒。在该方法中,将血清中抗汉坦病毒的IgG抗体作为检测对象,它包括步骤:(a)将纯化的汉坦病毒核蛋白包被在硝酸纤维素膜上,形成在点样区中包被有汉坦病毒核蛋白的硝酸纤维素检测膜;(b)以非人的抗人IgG抗体和胶体金为原料,制备胶体金－抗人IgG抗体的结合物;(c)将待检测的血清样品滴加在步骤(a)中获得的检测膜的点样区上;(d)洗涤步骤(c)的检测膜的点样区;(e)将步骤(b)的胶体金－抗人IgG抗体的结合物滴加在点样区上;(f)洗涤步骤(e)的检测膜的点样区。该方法和试剂盒可快速、正确和简便的检测肾综合征出血热。
文档编号G01N33/53GK1267831SQ9911354
公开日2000年9月27日 申请日期1999年3月18日 优先权日1999年3月18日
发明者储峰, 季青, 严润民, 王霞明 申请人:上海市南汇县南华医院