专利名称：一种多层培养瓶培养原代细胞制备出血热疫苗的方法
技术领域：
本发明属于原代细胞的培养和病毒繁殖，主要是一种多层培养瓶培养原代细胞制
备出血热疫苗的方法。
背景技术：
细胞培养(Cell culture)是模拟机体内生理条件，将细胞从机体中取出，在人工 条件下使其生存、生长、繁殖和传代，进行细胞生命过程、细胞癌变、细胞工程等问题的研究 和生产疫苗。由人体或动物体内直接取出组织或细胞进行培养叫原代培养。原代培养细胞 离体时间短，性状与体内相似。 一般说来，幼稚状态的组织和细胞，如动物的胚胎、幼仔的 脏器等更容易进行原代培养。传统疫苗制备大多采用细胞培养的方法。即采用不同容量的 玻璃转瓶(单层或多层，大规模培养原代或传代细胞，待细胞长满瓶壁后接种病毒、培养、 收获病毒培养液、纯化后配制疫苗。转瓶培养的缺点是细胞培养面积小、占用温房空间大、 劳动强度高且易于污染。 多层培养瓶是近年来发展起来的一种新型细胞培养容器，它的优点是培养表面经 过特殊处理，非常适宜细胞生长，而且细胞培养面积大、占用空间小、不需要转瓶机、采用管 道密闭操作、不易污染、单位培养面积所需细胞量少且病毒表达滴度高、收率比转瓶高2-3 倍。
发明内容
本发明的目的在于克服上述技术的不足，而提供一种多层培养瓶培养原代细胞制 备出血热疫苗的方法。 为解决上述技术问题，本发明是提出以下技术方案实现的这种多层培养瓶培养 原代细胞制备出血热疫苗的方法，步骤如下 (1)、选用10-20日龄的清洁级沙鼠，用乙醚熏死，清洗并消毒鼠尸；无菌取肾，剪 碎，经胰蛋白酶消化，用含3-5%的小牛血清MEM培养液分散细胞，制备细胞悬液，分装多层 细胞培养瓶，每瓶8000ml，置37± rC培养2_3天后更换含1 %的小牛血清MEM培养液；
(2)、待4-5天细胞长满致密单层后，按0. 2M0I接种病毒，每100cn^的细胞接种lml 滴度为6. 01gCCID50/ml的出血热病毒工作种子；置34. 5士rC培养22-26小时，弃去瓶中 培养液，每瓶用PH7. 2的PBS洗去小牛血清，然后加入不含小牛血清的维持液继续培养；
(3)、5-6天后，进行第一次病毒收获，收获前从培养瓶内刮取少量细胞，用特异性 单克隆荧光抗体检查细胞的病毒感染率及病毒型别，感染率应在95%以上；每次收获后加 入新鲜维持液继续培养，每个40层细胞工厂8000ml，每隔72±4小时收获一次，收获4-5 次； (4)、单次病毒收获液以15000r/min连续流离心，流速为2500ml/min，收集上清， 上清液按l : 4000的比例加入P-丙内酯置2-8t:3天灭活，灭活到期后，每个病毒灭活容 器立即取样分别进行病毒灭活验证试验；待灭活验证试验合格后合并为单价病毒收获液，经100KD孔径的滤膜超滤浓縮30倍后进行柱层析，用0. 02MpH7. 2的PBS洗，收集第一峰；
(5)、合并纯化后的病毒液，经0. 22um的膜除菌过滤，然后加入人血白蛋白作 为保护剂，半成品中人血白蛋白最终浓度为0. 3 % ，硫柳汞含量50ug/ml，病毒蛋白含量 31. 1-74. 22ug/ml，抗原含量稀释至1 : 128，加入0. 5mg/ml的氢氧化铝佐剂。
本发明的优点在于解剖动物获取原代细胞，将转瓶所需细胞量的1/2或1/3细胞 接种于多层细胞培养瓶内，加入适量培养液放入温房培养，待长满单层后接种病毒培养、收 获病毒培养液、纯化后配制疫苗。使用多层细胞瓶的优点是接种原代细胞量少、培养出的 细胞量多、占用空间小、不需要转瓶机、收率高。
图1为本发明的沙鼠肾细胞在多层细胞瓶和转瓶两种不同容器中的生长趋势示 意图； 图2为本发明的HFRS病毒在多层细胞瓶和转瓶两种不同容器中表达的抗原含量 示意图。
具体实施例方式
下面结合附图和实施例对发明作进一步说明 多层培养瓶培养原代细胞制备出血热疫苗的方法如下 选用10-20日龄的清洁级沙鼠，用乙醚熏死，清洗并消毒鼠尸；无菌取肾，剪碎，经 胰蛋白酶消化，用含3-5%的小牛血清MEM培养液分散细胞，制备细胞悬液，分装多层细胞 培养瓶，每瓶8000ml，置37± 1°C培养2_3天后更换含1 %的小牛血清MEM培养液。
待4-5天细胞长满致密单层后，按0. 2M0I接种病毒(每100cm2的细胞接种lml滴 度为6. 01gCCID50/ml的出血热病毒工作种子)，置34. 5士rC培养22-26小时，弃去瓶中培 养液，每瓶用PH7. 2的PBS洗去小牛血清，然后加入不含小牛血清的维持液继续培养。
5-6天后，进行第一次病毒收获，收获前从培养瓶内刮取少量细胞，用特异性单克 隆荧光抗体检查细胞的病毒感染率及病毒型别，感染率应在95%以上。每次收获后加入新 鲜维持液继续培养，每个40层细胞工厂8000ml，每隔72±4小时收获一次，收获4-5次。
单次病毒收获液以15000r/min连续流离心，流速为2500ml/min，收集上清。上清 液按l : 4000的比例加入P-丙内酯置2-8t: 3天灭活。灭活到期后，每个病毒灭活容器 立即取样分别进行病毒灭活验证试验。待灭活验证试验合格后合并为单价病毒收获液，经 100KD孔径的滤膜超滤浓縮30倍后进行柱层析，用0. 02MpH7. 2的PBS洗，收集第一峰。
合并纯化后的病毒液，经0.22um的膜除菌过滤，然后加入人血白蛋白作为保 护剂。半成品中人血白蛋白最终浓度为0.3X，硫柳汞含量50ug/ml，病毒蛋白含量 31. 1-74. 22ug/ml，抗原含量稀释至1 : 128，加入0. 5mg/ml的氢氧化铝佐剂。
经多批试生产，用传统方法进行检验，多层培养瓶生产的出血热疫苗各项检验指 标都符合国家检测标准，细胞在不同时间的生长密度和收获液抗原含量比较见附录图A和 图B。 此容器同样适用于原代地鼠肾细胞生产乙型脑炎纯化疫苗等用原代细胞制备的 各种疫苗。
以上对本发明的描述不具有限制性，如果本领域的普通技术人员受其启示，在不 脱离本发明权利要求的保护的情况，作出本发明的其它结构变形和实施方式，均属于本发 明的保护范围。
权利要求
一种多层培养瓶培养原代细胞制备出血热疫苗的方法，其特征在于步骤如下(1)、选用10-20日龄的清洁级沙鼠，用乙醚熏死，清洗并消毒鼠尸；无菌取肾，剪碎，经胰蛋白酶消化，用含3-5％的小牛血清MEM培养液分散细胞，制备细胞悬液，分装多层细胞培养瓶，每瓶8000ml，置37±1℃培养2-3天后更换含1％的小牛血清MEM培养液；(2)、待4-5天细胞长满致密单层后，按0.2MOI接种病毒，每100cm2的细胞接种1ml滴度为6.0lgCCID50/ml的出血热病毒工作种子；置34.5±1℃培养22-26小时，弃去瓶中培养液，每瓶用pH7.2的PBS洗去小牛血清，然后加入不含小牛血清的维持液继续培养；(3)、5-6天后，进行第一次病毒收获，收获前从培养瓶内刮取少量细胞，用特异性单克隆荧光抗体检查细胞的病毒感染率及病毒型别，感染率应在95％以上；每次收获后加入新鲜维持液继续培养，每个40层细胞工厂8000ml，每隔72±4小时收获一次，收获4-5次；(4)、单次病毒收获液以15000r/min连续流离心，流速为2500ml/min，收集上清，上清液按1∶4000的比例加入β-丙内酯置2-8℃3天灭活，灭活到期后，每个病毒灭活容器立即取样分别进行病毒灭活验证试验；待灭活验证试验合格后合并为单价病毒收获液，经100KD孔径的滤膜超滤浓缩30倍后进行柱层析，用0.02MpH7.2的PBS洗，收集第一峰；(5)、合并纯化后的病毒液，经0.22um的膜除菌过滤，然后加入人血白蛋白作为保护剂，半成品中人血白蛋白最终浓度为0.3％，硫柳汞含量50ug/ml，病毒蛋白含量31.1-74.22ug/ml，抗原含量稀释至1∶128，加入0.5mg/ml的氢氧化铝佐剂。
全文摘要
本发明涉及一种多层培养瓶培养原代细胞制备出血热疫苗的方法，步骤如下解剖动物获取原代细胞，将转瓶所需细胞量的1/2或1/3细胞接种于多层细胞培养瓶内，加入适量培养液放入温房培养，待长满单层后接种病毒培养、收获病毒培养液、纯化后配制疫苗。使用多层细胞瓶的优点是接种原代细胞量少、培养出的细胞量多、占用空间小、不需要转瓶机、收率高。
文档编号A61K39/12GK101732709SQ20091015452
公开日2010年6月16日 申请日期2009年11月10日 优先权日2009年11月10日
发明者姚伟, 苏波, 钟建琴 申请人:浙江天元生物药业股份有限公司