用于以rt-lamp法检测肾综合征出血热病毒的引物、试剂盒、检测方法
【专利摘要】本发明涉及一种用于以RT-LAMP法检测肾综合征出血热病毒的引物、试剂盒、检测方法。该引物包括HTNV引物组和SEOV引物组，两引物组分别包括外引物对，内引物对，以及环引物对，其序列如SEQ?ID?NO:3-14所示。该试剂盒包括上述引物、反应缓冲液及酶液。该检测方法包括：配制反应液A、B，加入待测核酸样品，反应，结束反应并鉴定结果。本发明结果可靠，能快速、高效、高特异性、高灵敏性的检测肾综合征出血热病毒，并准确分型。
【专利说明】用于以RT-LAMP法检测肾综合征出血热病毒的引物、试剂盒、检测方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种用于以RT-LAMP法检测肾综合征出血热病毒的引物、试剂盒、及检测方法，属于生物【技术领域】。
【背景技术】
[0002]据 申请人:了解，肾综合征出血热病毒(HFRS病毒)属于布尼亚病毒科汉坦病毒属，是有包膜分节段的单股负链RNA病毒。肾综合征出血热病毒可引发肾综合征出血热(haemorrhagic fever with renal syndrome, HFRS),该病征的典型临床特征为发热、出血、低血压和肾衰竭，是一种病死率较高的急性传染病，属于自然疫源性疾病，主要传染源为黑线姬鼠、褐家鼠等鼠类宿主动物。在感染途径方面，与布尼亚病毒科其他属的病毒不同，HFRS病毒可经接触啮齿类动物的排泄物、呼吸分泌物等直接感染。HFRS的疫源区分布广泛，病例报道多集中于山区和丘陵地带，而这些区域的医疗资源相对匮乏。
[0003]HFRS病毒在全球分布广泛，每年全球有6~10万例HFRS报告病例；同时，中国是全球HFRS疫情最为严重的国家，历年报告的HFRS病例数约占世界病例总数的90%左右。在1950~2007年之间，我国共报告I 557 622例HFRS患者，死亡46 427例，病死率达3%，成为严重危害人民群众健康的公共卫生问题。针对这种急性危重传染病，快速，准确，简便，低廉的早期诊断对于提高HFRS的救治成功率无疑非常重要。
[0004]HFRS病毒分为不同型别:汉滩病毒(I型，HTNV，又称野鼠型)、汉城病毒(II型，SE0V，又称家鼠型)、普马拉病毒(III型，又称棕背鼠型)、希望山病毒(IV型，又称草原田鼠型)、泰国病毒(V型)、Dobrava病毒(VI型)、Thottapalaym病毒(YD型)等。目前在我国疫区内的HFRS病毒，均为汉滩病毒(HTNV)或汉城病毒(SE0V)。
[0005]目前我国的HFRS疫区主要集中在医疗条件落后的山区，而汉滩病毒(HTNV)与汉城病毒(SEOV)感染引起的HFRS病情严重程度是不同的，一般来说，汉滩病毒(HTNV)感染引起的病情重，汉城病毒(SEOV)感染引起的病情轻；此外，汉滩病毒(HTNV)和汉城病毒(SEOV)分别为野鼠型疫区和家鼠型疫区的优势流行株，而混合型疫区则两型毒株并存。近年调研表明，随着疫区宿主动物的迁徙变化，原有的野鼠型疫区有向混合型疫区的趋势，同时原有的混合型疫区有向家鼠疫区演变的趋势；为能对疫区进行型别和型别变化的检测，发展新型的简便、特异的病原和分型检测方法势在必行。
[0006]环介导等温扩增技术(LAMP)是由T.Notomi发明的一种新型恒温核酸扩增方法，采用4-6条可特异识别靶序列区域的引物(如2条外引物、2条内引物、以及0-2条环引物)以及具有链置换活性的Bst DNA聚合酶，置60°C _65°C条件下，仅需Ih左右即可完成核酸扩增，扩增效率可达IO9-1Oltl个数量级。整个扩增过程只需一台水浴锅或恒温金属浴即可，且只需通过其副产物-白色的焦磷酸镁沉淀来观察结果(可用浊度仪实时扫描判定)，或者预先加入HNB或钙黄绿素等金属离子螯合剂，通过反应前后的溶液颜色变化，直接目视观察而不需借助其他仪器即可辨别实验结果。[0007]逆转录环介导等温扩增技术(reversetranscription loop-mediatedisothermal amplification, RT-LAMP)是能以一步法直接检测样本中RNA的LAMP方法,整个反应所需时间为Ih左右，同样只需一台简单恒温器，无需借助紧密配套的复杂仪器；应用HNB-RT-LAMP检测方法，直接目视反应管即可判断结果，无需开盖，能有效减少气溶胶污染的风险。RT-LAMP方法具有简便、快速、敏感、高效的特点，非常适合在基层实验室甚至现场进行快速诊断。目前亟需建立一种能够灵敏、特异、高效检测肾综合征出血热病毒的RT-LAMP检测手段。
【发明内容】
[0008]本发明的第一目的是:针对现有技术存在的问题，提供一种用于以RT-LAMP法检测肾综合征出血热病毒的引物，可有效检测肾综合征出血热病毒及其型别。
[0009]本发明的第二目的是:提供含有上述引物的试剂盒，可用于检测肾综合征出血热病毒及其型别。
[0010]本发明的第三目的是:提供采用前述试剂盒的检测方法，可直观地根据反应液颜色判断结果，或者根据浊度变化判断结果，快速准确。
[0011]实现本发明第一目的的技术方案如下:一种用于以RT-LAMP法检测肾综合征出血热病毒的引物，其特征是，
[0012]包括HTNV引物组和SEOV引物组； 其中，
[0013]HTNV引物组包括外引物对HTNV-F3和HTNV-B3，内引物对HTNV-FIP和HTNV-BIP，以及环引物对HTNV-LF和HTNV-LB ；
[0014]HTNV-F3 的序列如 SEQ ID NO: 3 所示，HTNV-B3 的序列如 SEQ ID NO: 4 所示，HTNV-FIP 的序列如 SEQ ID NO:5 所示，HTNV-BIP 的序列如 SEQ ID NO:6 所示，HTNV-LF 的序列如SEQ ID NO:7所示，HTNV-LB的序列如SEQ ID NO:8所示；
[0015]SEOV引物组包括外引物对SE0V-F3和SE0V-B3，内引物对SE0V-FIP和SE0V-BIP，以及环引物对SEOV-LF和SEOV-LB ；
[0016]SEOV-F 的序列如 SEQ ID NO:9 所示，SE0V-B3 的序列如 SEQ ID NO: 10 所示，SEOV-FIP 的序列如 SEQ ID NO: 11 所示，SEOV-BIP 的序列如 SEQ ID NO: 12 所示，SEOV-LF的序列如SEQ ID NO: 13所示，SEOV-LB的序列如SEQ ID NO: 14所示。
[0017]采用该引物后，即可有效检测肾综合征出血热病毒及其型别。
[0018]实现本发明第二目的的技术方案如下:一种以RT-LAMP法检测肾综合征出血热病毒的试剂盒，其特征是，包括前述用于以RT-LAMP法检测肾综合征出血热病毒的引物，其中由HTNV引物组构成的引物混合液放置于I管中，由SEOV引物组构成的引物混合液放置于II管中；还包括反应缓冲液和酶液，所述酶液含有BstDNA聚合酶和AMV逆转录酶。
[0019]采用该试剂盒即可用于检测肾综合征出血热病毒及其型别。
[0020]优选地，所述I管中，外引物对HTNV-F3和HTNV-B3、内引物对HTNV-FIP和HTNV-BIP、以及环引物对HTNV-LF和HTNV-LB的摩尔比为1: (6-10): (3-6);所述II管中，外引物对SE0V-F3和SE0V-B3、内引物对SEOV-FIP和SE0V-BIP、以及环引物对SEOV-LF和SEOV-LB 的摩尔比为 1: (6-10): (3-6)。
[0021]优选地，还包括阳性对照品:包括HTNV阳性对照品和SEOV阳性对照品，浓度分别为30-100mg/L，且由以下方法获得:构建含有肾综合征出血热病毒汉滩型的S基因的质粒HTNV-PCR I1、并构建含有肾综合征出血热病毒汉城型的S基因的质粒SEOV-PCR II，然后分别进行酶切线性化、体外转录及RNA纯化，所得cRNA片段分别为HTNV阳性对照品和SEOV阳性对照品；所述肾综合征出血热病毒汉滩型的S基因序列如SEQ ID N0:1所示，所述肾综合征出血热病毒汉城型的S基因序列如SEQ ID N0:2所示。
[0022]优选地，所述反应缓冲液为2 X反应缓冲液，包括40_60mmol/L pH8.8的Tris-HCl，18-30mmol/L 的 KCl，10-30mmol/L 的(NH4)2S04，质量浓度为 0.1-0.3% 的 TritonX-100,由浓度均为 2.8-3.6mmol/L 的 dATP、dTTP、dCTP、dGTP 组成的 dNTPs,0.8-2.0mmoI/L 的甜菜碱 C5H11NO2,以及 14-20mmol/L 的 MgSO4 ；
[0023]所述酶液包括浓度为8-12U/ μ I的BstDNA聚合酶，以及浓度为10-16U/ μ I AMV逆转录酶；
[0024]还包括显色试剂，所述显色试剂为浓度4-20mmol/L的金属离子指示剂HNB储存液。
[0025]此外，本发明还提供:前述引物用于制作以RT-LAMP法检测肾综合征出血热病毒的试剂盒的用途。
[0026]实现本发明第三目的的技术方案如下:一种非诊断目的以RT-LAMP法检测肾综合征出血热病毒的快速检测方法，其特征是，采用前述以RT-LAMP法检测肾综合征出血热病毒的试剂盒，该方法包括以下步骤:
[0027]第一步、向透明反应管A、B中分别加入体积相同的试剂盒2X反应缓冲液、I管或II管的引物混合液、酶液、显色液、超纯水，然后混合，得到体积相同的反应液A、B ;其中反应管A中加入I管的引物混合液，反应管B中加入II管的引物混合液；试剂盒2X反应缓冲液、I管或II管的引物混合液、酶液、显色液、超纯水的体积比为(6-12):(1.2-3.4):(0.5-1.6): (0.2-0.8):(3.0-4.`5)；
[0028]第二步、向反应管A、B中分别加入体积相同的待测核酸样品，盖好反应管A、B后混匀；
[0029]第三步、将反应管A、B先分别在60°C -65 °C恒温条件下放置25_60min进行RT-LAMP扩增，再于80°C _95°C下放置2_10min结束反应；
[0030]第四步、观察反应液A、B的颜色，若反应液A颜色为天蓝色，则待测核酸样品中含有肾综合征出血热病毒汉滩型；若反应液B颜色为天蓝色，则待测核酸样品中含有肾综合征出血热病毒汉城型；若反应液A、B颜色均为紫罗兰色，则待测核酸样品中不含肾综合征出血热病毒汉滩型和肾综合征出血热病毒汉城型。
[0031]采用该检测方法后，可直观地根据反应液颜色判断结果，快速准确。
[0032]上述技术方案的替换方案为:第一步中，反应管A、B中均不加显色液；在第一步结束时先以浊度仪检测反应液A、B的浊度，再进行第二步；第四步中，以浊度仪检测结束反应后的反应液A、B浊度，并观察反应前后反应液A、B的浊度变化，若反应液A浊度上升，则待测核酸样品中含有肾综合征出血热病毒汉滩型；若反应液B浊度上升，则待测核酸样品中含有肾综合征出血热病毒汉城型；若反应液A、B浊度均无变化，则待测核酸样品中不含肾综合征出血热病毒汉滩型和肾综合征出血热病毒汉城型。
[0033]优选地，第二步结束时，反应液A或B中含有:2μ I待测核酸样品，20-30mmol/LTris-HCl (ρΗ8.8)，9-15mmol/L KC1，5_15mM(NH4) 2S04，质量浓度 0.05-0.15%Triton X-100,1.4-1.8mmol/L dNTPs, 0.4-1.0mmol 甜菜碱 C5H11NO2, 7-1OmmoI MgSO4,6-12U BstDNA 聚合酶，8-16U AMV逆转录酶，4-6pmol外引物对，30_50pmol内引物对，10_30pmol环引物对。
[0034]优选地,第二步中,加入待测核酸样品后,反应管A、B中的反应液体积均为25 μ I ;第三步中，RT-LAMP扩增条件为:63°C恒温条件下放置30min ;结束反应的条件为:80°C下放置 2min。
[0035]与现有技术相比，本发明的有益效果如下:
[0036](I)发明人针对肾综合征出血热病毒汉滩型(HTNV)的S基因、肾综合征出血热病毒汉城型(SEOV)的S基因，分别设计出6条能特异性识别靶序列不同区域的引物(即外弓丨物对、内引物对、环引物对)，使本发明的RT-LAMP法能实现比其它核酸扩增检测方法更高的特异性，并且不会与其它常见病原发生交叉反应。[0037](2)与普通PCR和荧光定量PCR相比，本发明的RT-LAMP法的灵敏度可达到荧光定量PCR的水平，检测下限可达IOcopies/μ 1，比RT-PCR要高10倍。
[0038](3)本发明RT-LAMP法结果鉴定方便直观，通过观察反应液颜色或浊度即可判定反应结果；操作简单，一步即可完成实验操作，不需要大型复杂的仪器；快速高效，整个过程一小时内即可完成，且扩增效率高；此外，涵盖并能准确鉴定肾综合征出血热病毒在我国的分布型别。
[0039]本发明结果可靠，能快速、高效、高特异性、高灵敏性的检测肾综合征出血热病毒，并准确分型，不需要大型仪器设备，成本相对低廉，为肾综合征出血热病毒的检测提供了便捷的技术平台，也为肾综合征出血热病毒的基层检测提供便利，适合大范围推广应用。
【专利附图】
【附图说明】
[0040]图1为本发明实施例2的重组质粒HTNV-PCR II结构示意图，其中Spe I为酶切位点(用于体外转录前的线性化，以产生固定长度的RNA片段，便于准确定量拷贝数)，HTNV-S为肾综合征出血热病毒汉滩型的S基因序列，T7pix)m0ter为质粒PCR II上自带的体外转录启动子，箭头所指为体外转录的方向。
[0041]图2为本发明实施例2的重组质粒SEOV-PCR II结构示意图，其中Sac I为酶切位点(用于体外转录前的线性化，以产生固定长度的RNA片段，便于准确定量拷贝数)，SEOV-S为肾综合征出血热病毒汉城型的S基因序列，T7pix)m0ter为质粒PCR II上自带的体外转录启动子，箭头所指为体外转录的方向。
[0042]图3为本发明实施例2的PCR II质粒图谱。
[0043]图4为本发明实施例5中，逆转录实时荧光定量PCR (HTNV-rRT-PCR)检测梯度稀释的HTNV阳性标准品，Ct值< 38判定为阳性，阴性对照使用超纯水代替模板样品。
[0044]图5为本发明实施例5中，逆转录实时荧光定量PCR (SEOV-rRT-PCR)检测梯度稀释的SEOV阳性标准品，Ct值< 38判定为阳性，阴性对照使用超纯水代替模板样品。
[0045]图6为本发明实施例5中，以实施例2试剂盒按浊度判断方式检测梯度稀释的HTNV阳性标准品，浊度值> 0.1判定为阳性。
[0046]图7为本发明实施例5中，以实施例2试剂盒按浊度判断方式检测梯度稀释的SEOV阳性标准品，浊度值> 0.1判定为阳性。[0047]图8为本发明实施例5中，以实施例2试剂盒按显色判断方式检测梯度稀释的HTNV阳性标准品，天蓝色判定为阳性，紫罗兰色为阴性。除10°管和NTC管为紫罗兰色外，其余各管均为天蓝色。NTC为以超纯水代替模板样品的阴性对照管。
[0048]图9为本发明实施例5中，以实施例2试剂盒按显色判断方式检测梯度稀释的SEOV阳性标准品，天蓝色判定为阳性，紫罗兰色为阴性。除IO1管、10°管、NTC管为紫罗兰色外，其余各管均为天蓝色。NTC为以超纯水代替模板样品的阴性对照管。
[0049]图10为本发明实施例6中，以实施例2试剂盒HTNV引物组按显色判断方式检测各样品。其中，I至8管的样品依次为肾综合征出血热病毒汉滩型标准株76118、肾综合征出血热病毒汉城型标准株R22、登革热病毒、大肠杆菌0157、钩端螺旋体、疟原虫、恙虫病东方体以及流感病毒H1N1，天蓝色判定为阳性，紫罗兰色为阴性。除I管为天蓝色外，其余管均为紫罗兰色。 [0050]图11为本发明实施例6中，以实施例2试剂盒SEOV引物组按显色判断方式检测各样品。其中，I至8管的样品依次为肾综合征出血热病毒汉城型标准株R22、肾综合征出血热病毒汉滩型标准株76118、登革热病毒、大肠杆菌0157、钩端螺旋体、疟原虫、恙虫病东方体以及流感病毒H1N1，天蓝色判定为阳性，紫罗兰色为阴性。除I管为天蓝色外，其余管均为紫罗兰色。
[0051]图12为本发明实施例6中，以实施例2试剂盒HTNV引物组按浊度判断方式检测各样品。其中，各样品为肾综合征出血热病毒汉滩型标准株76118 (HV)、登革热病毒(Dengue Virus, DV)、大肠杆菌 0157 (Ecol1.0157)、钩端螺旋体(Leptospira)、痕原虫(Plasmodium)、恙虫病东方体(R.tsutsugamushi)以及流感病毒H1N1,池度值> 0.1判定为阳性。其中NTC为阴性对照(使用超纯水代替模板)。
【具体实施方式】
[0052]下面参照附图并结合实施例对本发明作进一步详细描述。但是本发明不限于所给出的例子。
[0053]以下内容中涉及的实验操作，如未注明具体实验条件，则按照常规条件进行，例如，可参照SAMBR00K.J等编著的《分子克隆实验指南》第3版(Molecular Cloning:ALaboratory Manual ;NEW York:Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001)中述及的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
[0054]以下内容中涉及的实验材料和试剂，如未特别说明则为市售品。
[0055]实施例1:HTNV弓丨物组和SEOV弓丨物组
[0056]首先，从美国基因数据库检索获得肾综合征出血热病毒汉滩型(HTNV)基因序列(GenBank号:M14626.1)和肾综合征出血热病毒汉城型(SEOV)基因序列(GenBank号:AF488707.1)，其中，肾综合征出血热病毒汉滩型(HTNV)的S基因序列如SEQ ID N0:1所示，肾综合征出血热病毒汉城型(SEOV)的S基因序列如SEQ ID NO:2所示。
[0057]然后，先通过BLAST软件进行同源性分析，得到两种基因的特异性保守序列；再通过LAMP引物设计软件(Primer Explorer software, version 4.0),针对上述特异性保守序列分别进行LAMP引物设计，根据专业经验进行了人工选择和校正，再根据多轮实验对比，从合成的若干套引物组合中筛选出可应用于同一反应体系的HTNV引物组和SEOV引物组。[0058]HTNV引物组包括外引物对HTNV-F3和HTNV-B3，内引物对HTNV-FIP和HTNV-BIP，以及环引物对HTNV-LF和HTNV-LB ；
[0059]HTNV-F3 的序列如 SEQ ID NO: 3 所示，HTNV-B3 的序列如 SEQ ID NO: 4 所示，HTNV-FIP 的序列如 SEQ ID NO:5 所示，HTNV-BIP 的序列如 SEQ ID NO:6 所示，HTNV-LF 的序列如SEQ ID NO:7所示，HTNV-LB的序列如SEQ ID NO:8所示。
[0060]SEOV引物组包括外引物对SE0V-F3和SE0V-B3，内引物对SE0V-FIP和SE0V-BIP，以及环引物对SEOV-LF和SEOV-LB ；
[0061]SEOV-F 的序列如 SEQ ID NO:9 所示，SE0V-B3 的序列如 SEQ ID NO: 10 所示，SEOV-FIP 的序列如 SEQ ID NO: 11 所示，SEOV-BIP 的序列如 SEQ ID NO: 12 所示，SEOV-LF的序列如SEQ ID NO: 13所示，SEOV-LB的序列如SEQ ID NO: 14所示。
[0062]实施例2:以RT-LAMP法检测肾综合征出血热病毒的试剂盒
[0063]本实施例的试剂盒包括实施例1的HTNV弓丨物组和SEOV引物组。其中，由HTNV弓丨物组构成的引物混合液放置于I管中，外引物对HTNV-F3和HTNV-B3、内引物对HTNV-FIP和 HTNV-BIP、及环引物对 HTNV-LF 和 HTNV-LB 的摩尔比为 1: (6-10): (3-6)，优选 1:8:4。由SEOV弓丨物组构成的引物混合液放置于II管中，外引物对SE0V-F3和SE0V-B3、内引物对SEOV-FIP 和 SE0V-BIP、及环引物对 SE0V-LF 和 SE0V-LB 的摩尔比为 1: (6-10): (3-6)，优选1:8:4。
[0064]例如:I管中，每 2.5 μ I 引物混合液含有 4pmoI HTNV-F3 和 4pmoI HTNV-B3、32pmoIHTNV-FIP和 32pmol HTNV-BI P,以及 16pmol HTNV-LF和 16pmol HTNV-LB ; II 管中，每 2.5 μ I引物混合液含有 4pmol SE0V-F3 和 4pmol SE0V_B3、32pmol SE0V-FIP 和 32pmol SEOV-BIP、以及 16pmol SEOV-LF 和 16pmoI SEOV-LB0
[0065]本实施例试剂盒还包括:
[0066](I)阳性对照品:包括HTNV阳性对照品和SEOV阳性对照品，浓度分别为30-100mg/L，优选分别为 50mg/L。
[0067]获得方法如下:将肾综合征出血热病毒汉滩型标准株76118毒株和肾综合征出血热病毒汉城型标准株R22毒株分别接种l-5d龄的乳沙鼠，每只脑内0.02ml，15d左右收获发病小鼠，无菌取脑，研磨脑组织，分别提取两病毒株的RNA，进行RT-PCR扩增出两者的S基因全长片段(分别如SEQ ID NO: 1、2所示)，分别TA克隆至PCR II质粒(美国Invitrogen公司，如图3所示)并测序，命名为HTNV-PCR II和SEOV-PCR II (分别如图1、图2所示)。将HTNV-PCR II质粒用SpeI限制性内切酶(日本Takara公司)，SEOV-PCR II用Sac I限制性内切酶(Takara)进行酶切线性化，分别割胶纯化后作为模板，使用RiboMaxT7 In VitroTranscription System (美国Promega公司)分别进行体外转录，用Dnase试剂除去DNA模板后，分别用RNA纯化试剂盒(北京天根公司)纯化转录产物，以分光光度计测定浓度，以RNA-free H2O将其稀释至50mg/L，所得cRNA片段分别为HTNV阳性标准品和SEOV阳性标准品。
[0068](2) 2X反应缓冲液:该反应缓冲液包括40-60mmol/L (优选40mmol/L) pH8.8的Tris-HCl，18-30mmol/L(优选 20mmol/L)的 KCl，10_30mmol/L(优选 20mmol/L)的(NH4)2SO4,质量浓度为0.1-0.3% (优选0.2%)的TritonX-100，由浓度均为2.8-3.6mmol/L (优选
2.8mmol/L)的 dATP、dTTP、dCTP、dGTP 组成的 dNTPs，0.8-2.0mmoI/L (优选 1.6mmol/L)的甜菜碱 C5H11NO2,以及 14_20mmol/L (优选 16mmol/L)的 MgS04。
[0069](3)酶液:包括浓度为8_12υ/μ1 (优选8U/μ I)的BstDNA聚合酶(大片段，美国NEB公司)，以及浓度为10-16υ/μ I (优选IOU/μ I) AMV逆转录酶(美国NEB公司)。
[0070](4)显色液:浓度4_20mmol/L (优选4mmol/L)的金属离子指示剂HNB (hydroxynaphthol blue，羟基萘酚蓝)储存液；在反应前加入反应体系内，从而实现不开盖可视化检测。具体地，指示剂HNB购自美国Sigma-Alorich公司，货号CAS 63451_35_4，规格33936-10G ;该指示剂加入反应体系后的终浓度为120-160 μ mol/L。
[0071]实施例3:非诊断目的以RT-LAMP法检测肾综合征出血热病毒的快速检测方法
[0072]本实施例检测方法采用实施例2试剂盒进行检测。
[0073]本实施例检测方法包括以下步骤:
[0074]第一步、向透明反应管A、B中分别加入体积相同的试剂盒2X反应缓冲液、I管或II管的引物混合液、酶液、显色液、超纯水，然后混合，得到体积相同的反应液A、B ;其中反应管A中加入I管的引物混合液，反应管B中加入II管的引物混合液；试剂盒2X反应缓冲液、I管或II管的引物混合液、酶液、显色液、超纯水的体积比为(6-12):(1.2-3.4):(0.5-1.6):(0.2-0.8):(3.0-4.5)；
[0075]例如，反应液A可以按下表得到:
[0076]
【权利要求】
1.一种用于以RT-LAMP法检测肾综合征出血热病毒的引物，其特征是，包括HTNV引物组和SEOV引物组；其中， HTNV引物组包括外引物对HTNV-F3和HTNV-B3，内引物对HTNV-FIP和HTNV-BIP，以及环引物对HTNV-LF和HTNV-LB ； HTNV-F3 的序列如 SEQ ID NO: 3 所示，HTNV-B3 的序列如 SEQ ID NO:4 所示，HTNV-FIP的序列如SEQ ID NO:5所示，HTNV-BIP的序列如SEQ ID NO:6所示，HTNV-LF的序列如SEQID NO:7所示，HTNV-LB的序列如SEQ ID NO:8所示； SEOV引物组包括外引物对SE0V-F3和SE0V-B3，内引物对SEOV-FIP和SE0V-BIP，以及环引物对SEOV-LF和SEOV-LB ； SEOV-F 的序列如 SEQ ID NO:9 所示，SE0V-B3 的序列如 SEQ ID NO: 10 所示，SEOV-FIP的序列如SEQ ID NO: 11所示，SEOV-BIP的序列如SEQ ID NO: 12所示，SE0V-LF的序列如SEQ ID NO: 13 所示，SEOV-LB 的序列如 SEQ ID NO: 14 所示。
2.—种以RT-LAMP法检测肾综合征出血热病毒的试剂盒，其特征是，包括权利要求1所述用于以RT-LAMP法检测肾综合征出血热病毒的引物，其中由HTNV弓丨物组构成的引物混合液放置于I管中，由SEOV引物组构成的引物混合液放置于II管中；还包括反应缓冲液和酶液，所述酶液含有BstDNA聚合酶和AMV逆转录酶。
3.根据权利要求2所述以RT-LAMP法检测肾综合征出血热病毒的试剂盒，其特征是，所述I管中，外引物对HTNV-F3和HTNV-B3、内引物对HTNV-FIP和HTNV-BIP、以及环引物对HTNV-LF和HTNV-LB的摩尔比为1: (6-10): (3-6);所述II管中，外引物对SE0V-F3和SE0V-B3、内引物对SEOV-FIP和SE0V-BIP、以及环引物对SEOV-LF和SEOV-LB的摩尔比为1:(6-10):(3-6)。`
4.根据权利要求3所述以RT-LAMP法检测肾综合征出血热病毒的试剂盒，其特征是，还包括阳性对照品:包括HTNV阳性对照品和SEOV阳性对照品，浓度分别为30-100mg/L，且由以下方法获得:构建含有肾综合征出血热病毒汉滩型的S基因的质粒HTNV-PCR I1、并构建含有肾综合征出血热病毒汉城型的S基因的质粒SEOV-PCR II，然后分别进行酶切线性化、体外转录及RNA纯化，所得cRNA片段分别为HTNV阳性对照品和SEOV阳性对照品；所述肾综合征出血热病毒汉滩型的S基因序列如SEQ ID NO:1所示，所述肾综合征出血热病毒汉城型的S基因序列如SEQ ID NO: 2所示。
5.根据权利要求4所述以RT-LAMP法检测肾综合征出血热病毒的试剂盒，其特征是，所述反应缓冲液为2X反应缓冲液，包括40-60mmol/L pH8.8的Tris_HCl，18-30mmol/L 的 KCl, 10-30mmol/L 的(NH4)2SO4,质量浓度为 0.1-0.3% 的 Triton X-100，由浓度均为2.8-3.6mmol/L 的 dATP、dTTP、dCTP、dGTP 组成的 dNTPs，0.8-2.0mmoI/L 的甜菜碱 C5H11NO2,以及 14-20mmol/L 的 MgSO4 ； 所述酶液包括浓度为8-12U/ μ I的BstDNA聚合酶，以及浓度为10-16U/ μ I AMV逆转录酶； 还包括显色试剂，所述显色试剂为浓度4-20mmol/L的金属离子指示剂HNB储存液。
6.权利要求1所述引物用于制作以RT-LAMP法检测肾综合征出血热病毒的试剂盒的用途。
7.一种非诊断目的以RT-LAMP法检测肾综合征出血热病毒的快速检测方法，其特征是，采用前述以RT-LAMP法检测肾综合征出血热病毒的试剂盒，该方法包括以下步骤:第一步、向透明反应管A、B中分别加入体积相同的试剂盒2X反应缓冲液、I管或II管的引物混合液、酶液、显色液、超纯水，然后混合，得到体积相同的反应液A、B;其中反应管A中加入I管的引物混合液，反应管B中加入II管的引物混合液；试剂盒2X反应缓冲液、I管或II管的引物混合液、酶液、显色液、超纯水的体积比为(6-12):(1.2-3.4):(0.5-1.6):(0.2-0.8):(3.0-4.5)； 第二步、向反应管A、B中分别加入体积相同的待测核酸样品，盖好反应管A、B后混匀；第三步、将反应管A、B先分别在60°C _65°C恒温条件下放置25-60min进行RT-LAMP扩增，再于80°C -95°C下放置2-10min结束反应； 第四步、观察反应液A、B的颜色，若反应液A颜色为天蓝色，则待测核酸样品中含有肾综合征出血热病毒汉滩型；若反应液B颜色为天蓝色，则待测核酸样品中含有肾综合征出血热病毒汉城型；若反应液A、B颜色均为紫罗兰色，则待测核酸样品中不含肾综合征出血热病毒汉滩型和肾综合征出血热病毒汉城型。
8.根据权利要求7所述非诊断目的以RT-LAMP法检测肾综合征出血热病毒的快速检测方法，其特征是，第一步中，反应管A、B中均不加显色液；在第一步结束时先以浊度仪检测反应液A、B的浊度，再进行第二步；第四步中，以浊度仪检测结束反应后的反应液A、B浊度，并观察反应前后反应液A、B的浊度变化，若反应液A浊度上升，则待测核酸样品中含有肾综合征出血热病毒汉滩型；若反应液B浊度上升，则待测核酸样品中含有肾综合征出血热病毒汉城型；若反应液A、B浊度均无变化，则待测核酸样品中不含肾综合征出血热病毒汉滩型和肾综合征出血热病毒汉城型。
9.根据权利要求7或8所述非诊断目的以RT-LAMP法检测肾综合征出血热病毒的快速检测方法，其特征是，第二步结束时，反应液A或B中含有:2μ I待测核酸样品，20-30mmol/LTris-HCl (ρΗ8.8)，9-15mmol/L KC1，5_15mM(NH4) 2S04，质量浓度 0.05-0.15%Triton X-100,.1.4-1.8mmol/L dNTPs，0.4-1.0mmol 甜菜碱 C5H11NO2, 7-1OmmoI MgSO4,6-12U BstDNA 聚合酶，8-16U AMV逆转录酶，4-6pmol外引物对，30_50pmol内引物对，10_30pmol环引物对。
10.根据权利要求7或8所述非诊断目的以RT-LAMP法检测肾综合征出血热病毒的快速检测方法，其特征是，第二步中，加入待测核酸样品后，反应管A、B中的反应液体积均为.25 μ I ;第三步中，RT-LAMP扩增条件为:63°C恒温条件下放置30min ;结束反应的条件为:.80°C下放置2min。
【文档编号】C12N15/11GK103725798SQ201410016990
【公开日】2014年4月16日 申请日期:2014年1月15日 优先权日:2014年1月15日
【发明者】王长军, 胡丹, 张锦海, 郝丽娜, 吕恒, 谭维国 申请人:中国人民解放军南京军区军事医学研究所