专利名称：氧化苦参碱在制备治疗肾综合征出血热药物中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及氧化苦参碱(苦参素)的用途，尤其涉及氧化苦参碱在制药领域的用途。
氧化苦参碱是一种用途十分广泛的氧化生物碱，中国专利96109782.5公开了氧化苦参碱在制备治疗乙型病毒性肝炎药物中的应用；中国专利00125891.5公开了氧化苦参碱在制备治疗肝纤维化药物中的应用；中国专利00125890.7公开了氧化苦参碱在制备治疗丙型病毒性肝炎药物中的应用；中国专利公开了00127585.2氧化苦参碱在制备治疗溃疡性结肠炎药物中的应用，而该化合物在制备治为肾综合征出血热药物中的应用尚未见报道。
世界上人类病毒性出血热共有13种，根据该病肾脏有无损害，分为有肾损及无肾损两大类。在我国主要为肾综合征出血热(HFRS)，又称流行性出血热(EHF)；在朝鲜称朝鲜出血热(KHF)；在苏联称出血性肾病肾炎(HNN)；由于特异性血清学诊断的确立及病原学的解决，1982年世界卫生组织统一定名为肾综合征出血热。
本病是由朝鲜出血热病毒(或称汉坦病毒)引起，以鼠类为主要传染源的自然疫源性疾病；可通过呼吸道、消化道、接触传播、母婴传播和虫媒传播；以发热、出血倾向及肾脏损害为主要临床特征的急性病毒性传染病，典型的出血热一般有发热、低血压、少尿、多尿及恢复五期经过，如处理不当病死率很高；HFRS病毒的传播几乎遍及世界各大洲。在我国已有半个世纪的流行史，八十年代中期以来，我国本病年发病数逾已10万，已成为除病毒性肝炎外，危害最大的一种病毒性疾病。
研究表明，肾综合征出血热的致病机理主要有(1)早期发病可能是由于病毒直接作用结果，与感染病毒株的型别、毒力、数量以及病毒结构蛋白不同有关。本病毒为单链、负性RNA型，分大(L)、中(M)、小(S)三不同片段属布尼亚病毒科的一个新属，称为汉坦病毒属，病毒蛋白由四个结构蛋白组成，即G1、G2为包膜糖蛋白，NP为核蛋白，L蛋白可能为多聚酶。G1、G2蛋白上存在中和抗原和血凝素抗原，并能诱导中和抗体；(2)由病毒启动的免疫损伤。病毒在机体内大量复制，同时刺激免疫系统产生抗体，并能激活补体系统产生组胺等活性物质使血管扩张，血浆外渗近而形成免疫复合物在血管、肾小球基底膜、血小板等表面沉积，形成变态反应；(3)微循环障碍。目前对肾综合征出血热主要采用综合性治疗，特别应早期抓好抗病毒治疗及液体疗法，对重症患者要及时抓紧抗休克、预防出血及肾功能衰竭的治疗，早期积极地抗病毒治疗，对减轻病理损伤、阻断病情进展具有重要作用。迄今尚缺乏可治愈肾综合征出血热的特异药物。临床上多采用病毒唑、干扰素等抗病毒治疗，效果尚不能肯定。因此，在临床实践中，发展了多种对肾综合征出血热有一定疗效的中药或中西药复方制剂，临床应用表明，这些药物对缓解症状，减少西药用量，或在一定时期作为主要治疗药物等均有一定的积极作用。
据《本草纲目》记载中药苦参，性寒味苦，具有清热解毒、抗菌消炎作用；近15年对氧化苦参碱及苦参碱的研究较多，1994年上海市传染病医院实验发现氧化苦参碱有抗麻鸭乙型肝炎病毒作用，其作用机制可能与氧化苦参碱特殊的极性分子结构有关，这一发现提示氧化苦参碱可能具有广泛的抗病毒作用，可减轻病毒对组织器官的病理性损伤，迅速控制病毒血症；氧化苦参碱及苦参碱可抑制炎症介质的释放，可调节小鼠和大鼠腹腔肥大细胞组织胺释放，可有效抑制IgE交联及组胺、白三烯等介质释放，并具有稳定细胞膜用；氧化苦参碱对免疫系统细胞增殖的影响同细胞状态密切相关，升高白细胞作用及抑制自身免疫可应用于自身免疫性肝炎及白细胞及血小板减少的治疗，这种双向免疫调节功能，可缓解继发性细胞因子在发病机理中间环节作用，从而阻断病理改变过程，使病情得到逆转。近年来研究发现苦参素可用于治疗肾综合征出血热，显示一定疗效。发明内容本发明需要解决的技术问题是提供氧化苦参碱的新用途，即在制药中的新用途，具体说是提供氧化苦参碱在制备治疗肾综合征出血热药物中的应用。
为了更好地理解本发明的实质，以下将氧化苦参碱的毒性实验、实验研究和临床实验结果来说明其在制药领域中的应用。
氧化苦参碱是从苦参或苦豆子中提取的白色水溶液性固体，分子式C15H24N2O2·H2O，分子量为284.36。采用文献“中药化学成分提取分离手册”，中国中医药出版社，1998年8月第1版报道的方法提取分离氧化苦参碱，纯度98％以上，其余为槐定碱。用无热源去离子水的纯净蒸馏水将氧化苦参碱溶解，消毒配制成400mg/ml/支或800mg/2ml/支的注射剂备用；或按本领域技术人员公知的方法制备氧化苦参碱胶囊，以淀粉为填充剂，以8％淀粉浆为黏合剂，制成颗粒，然后装胶囊，制成的胶囊规格为400mg/囊。
具体实验和临床结果分述如下一、动物毒性实验1小鼠口服苦参素急性毒性实验在中科院上海药物研究所进行。采用实施例3所配制的胶囊，昆明小鼠一次灌胃苦参素，根据预实验，最高剂量443.0mg/kg，以0.75的比例递减，即为443.0、332.0、249.0、186.9、140.2mg/kg5个剂量组，连续观察14天。大剂量组(443.0、332.0mg/kg)药后5～10分钟活动稍减少，20分钟左右呈现双耳发红。各给药组均出现大便湿软，但成形。死亡发生在24小时内，尸检可见心脏淤血，其它各脏器未见明显异常。存活者15天全部解剖，肉眼检查主要脏器未见病变。死亡率用Bliss法求得LD50为234.55mg/kg；95％可信限为202.15～272.14mg/kg。
2苦参素小鼠肌肉注射急性毒性实验在上海医科大学药学院进行。采用实施例1配制的注射剂，昆明小鼠肌肉注射，用死亡率用Bliss法求得LD50为452.24mg/kg；95％可信限为366.77～551.35mg/kg。死亡动物尸检肉眼未见任何病变。
小结上述实验说明苦参素毒性非常低，临床使用安全。
二、苦参素抗肾综合征出血热病毒的实验研究(一)对肾综合征出血热病毒体外抑制实验
1材料(1)病毒株国际标准肾综合征出血热病毒76-118株，由中国预防医学科学院研究所保存。实验用每毫升含100个病毒感染性滴度的病毒(100TCID50/ml)。
(2)细胞非洲绿猴肾Vero传代的E6克隆系，139～141代。其中含3％小牛血清维持液。
(3)药物采用实施例1的注射剂。各稀释度均用维持液配制。实验过程中设立空白对照。
2方法(1)药物对Vero E6细胞的毒性作用。将已长成单层的Vero E6细胞分别以5、10、50、100、200、300、500、750、1000μg/ml的药物浓度处理培养2周后，观察细胞形态。
(2)药物对肾综合征出血热病毒侵入细胞的阻断作用。以20、50、100、200、300、500μg/ml的药物浓度预处理细胞12小时后，再以肾综合征出血热病毒攻击，培养2周后用免疫荧光法检查。
(3)对肾综合征出血热病毒的直接杀灭作用。以50、100、200、300、500、750μg/ml的药物浓度和100TCID50/0.1ml的病毒等量混合，作用不同时间后，再将其感染细胞，用免疫荧光法检查。
(4)对肾综合征出血热病毒的增殖抑制作用。病毒感染细胞24小时后，以不同的药物浓度加入细胞培养基，培养2周后用免疫荧光法检查。
1观察指标以免疫荧光法检测细胞内病毒抗原，如果感染细胞未见荧光阳性，表示病毒已被杀灭或抑制，同时计算抗病毒指数。
2结果(1)1000μg/ml的药物浓度组培养5天后细胞颗粒增多，折光性差，细胞形态明显改变，部分细胞脱落，其余各浓度未见药物对Vero E6细胞的毒性作用。
(2)各浓度在不同时间预先处理的实验组细胞与未用药处理的对照组细胞均出现特异性应荧光，病毒感染性滴度为105/0.1ml，抗病毒指数1，表明苦参素不能阻断病毒侵入细胞。
(3)300μg/ml苦参碱药物浓度，在24小时组TCID50为103/0.1ml，对照组为104/0.1ml(两组数据P＜0.05)，抗病毒指数1.51，提示苦参碱对病毒有直接杀伤作用。见表1。
(4)50μg/ml苦参碱药物浓度对病毒增殖有抑制作用，此浓度以上各组，其感染滴度和对照组比均有显著差异(P＜0.05)，药物浓度增加，抗病毒作用增强。见表2。
表1苦参素对肾综合征出血热病毒的直接杀灭作用(X±S)
与对照组比较，*P＜0.05。
表2苦参素对肾综合征出血热病毒增殖的抑制作用(X±S)
与对照组比较，*P＜0.05。
小结苦参素对细胞的毒性作用低；对肾综合征出血热病毒有直接杀灭作用；对肾综合征出血热病毒的增殖有明显抑制作用，药物浓度增加，抗病毒效力增加。
(二)对肾综合征出血热病毒体内抑制实验1.材料(1)病毒株国际标准肾综合征出血热病毒76-118株，由中国预防医学科学院研究所保存，其感染滴度为TCID5010-4。
(2)实验动物2周龄地鼠30只，体重7.0～9.8克，雌雄兼有，随机平均分成实验组和对照组。
(3)采用实施例3的胶囊，按100mg/kg体重口腔插管灌胃。
2.方法两组动物分别腹腔接种肾综合征出血热病毒2.0ml，于接种当日，实验组灌胃1ml，每日一次连续灌胃9天，对照组不作任何处理。
3.观察指标进食、精神状态、体重、发病时间、病程时间及死亡情况；发病死亡地鼠均取肺组织作冷冻切片，用间接免疫荧光法测肾综合征出血热病毒抗原；同时将肺组织研磨、冻融接种Vero-E6细胞进行病毒分离培养，分别于12和18天，检测有无肾综合征出血热病毒；未发病地鼠10天后处死，同样进行上述检测。
4.结果(1)发病地鼠症状表现进食锐减、活动少、身体卷曲如弓，体重每天减0.4g；给药实验组虽出现典型病症，但表现较轻，体重每天减少0.15g；(2)实验组比对照组发病时间推迟(P＜0.05)，病程延长(P＜0.05)；结果见表3和表4。
(3)实验组30只地鼠，25只发病死亡，死亡率83.3％，对照组地鼠全部死亡，对照组明显高于实验组；(4)死亡地鼠均检出肾综合征出血热病毒，未死亡地鼠简洁免疫荧光和组织培养均未检出该病毒。
表3肾综合征出血热病毒感染地鼠发病时间比较
表4肾综合征出血热病毒感染地鼠病程时间比较
小结地鼠因灌注苦参素而受到保护，其发病时间推迟、病程延长、死亡率降低。
三、苦参素治疗肾综合征出血热临床疗效观察1病例选择收集3个月肾综合征出血热患者53例，男46例，女7例，年龄20～63岁，平均43.6岁；病例选择为入院病程2～5天，全部病例均符合1986年南京全国肾综合征出血热会议制定的诊断标准，并经血清抗-肾综合征出血热病毒-IgM检查均阳性，早期定度10例、中度38例、轻度12例；同时随机设立对照组50例，两组病人入院时的性别、年龄和病情等方面基本相同，入院平均发病率治疗组为4.05±0.98天，对照组4.12±0.64天；如愿时平均体温治疗组为(39.04±0.51)℃，对照组平均体温治疗组为(39.01±0.54)℃，两组对比无显著差异(P＞0.05)，具可比性。
2方法治疗组在综合治疗的基础上，加用实施例2的注射剂，每天二次肌注，连续5天；对照组仅给予综合治疗，不用其他抗病毒药物和免疫制剂。
3观察指标用药后1～6小时观察体温、脉搏、血压1次，每天观察出血情况，并检查尿蛋白、血<p>5、将上述混合物烘干加工成品。
本发明可以加工成为粉型、颗粒型或饼干型等各种形式的食品。
表一为成人营养日需量及蚕豆与奶粉每100克所含营养成份表
本发明与其他同类营养保健食品相比，其营养成份更全面、合理，营养比例更均衡，如奶粉中的Vc的含量较低，而钙磷的含量过高，又如奶粉中不含萝卜素，而且胆固醇较高；在保健方面，本发明能调节人体新陈代谢机能，提高机体免疫力，无任何副作用，适用于各类人群食用；在生产加工方面，加工工艺简单，原料易种植、保存，生产成本低。
四、具体实施例实施例一本发明组成配方为蚕豆、枸杞；上述配方的重量比为蚕豆∶枸杞为3∶1。
本发明的制备方法为1、按上述配方比例称取蚕豆和枸杞；2、将蚕豆微火炒熟、粉碎；3、将枸杞烘干粉碎；4、将蚕豆粉与枸杞粉均匀混合；5、将上述混合物烘干后装袋。
小结苦参素对控制肾综合征出血热病毒感染有一定作用，治疗早期肾综合征出血热，在加快退热时间、改善肾功能、减少出血、改善肝功能、减少少尿期发生和提高治愈率等方面明显优于对照组。
由上述公开的毒性实验、抗病毒机理实验研究和临床试验可见1.毒性实验研究显示，苦参素毒性非常低，临床使用安全、方便。
2.对肾综合征出血热病毒体外抑制实验研究显示，苦参素对细胞的毒性作用低；对肾综合征出血热病毒有直接杀灭作用；对肾综合征出血热病毒的增殖有明显抑制作用，药物浓度增加，抗病毒效力增加。
3.对肾综合征出血热病毒体内抑制实验研究显示，苦参素对综合征出血热病毒感染的地鼠有明显保护作用，使其发病时间推迟、病程延长、死亡率降低。
4.临床试验研究表明，苦参素对控制肾综合征出血热病毒感染有一定作用，治疗早期肾综合征出血热，在加快退热时间、改善肾功能、减少出血、改善肝功能、减少少尿期发生和提高治愈率等方面明显优于对照组。
以下将通过实施例对本发明进行说明。
实施例1用1000ml无热源去离子的纯净蒸馏水将400g氧化苦参碱溶解，混合均匀，消毒配制成800mg/2ml/支的注射剂，装瓶制成品。
实施例2用1000ml无热源去离子的纯净蒸馏水将400g氧化苦参碱溶解，混合均匀，消毒配制成400mg/1ml/支的注射剂，装瓶制成品。
实施例3按本领域技术人员公知的方法制备氧化苦参碱胶囊，以淀粉为填充剂，以8％淀粉浆为黏合剂，制成颗粒，然后装胶囊，制成的胶囊规格为400mg/囊。配方如下氧化苦参碱 400克淀粉 320克8％淀粉浆 80毫升
权利要求
1.氧化苦参碱在制备治疗肾综合征出血热药物中的应用。
全文摘要
本发明公开了氧化苦参碱(苦参素)在制备治疗肾综合征出血热药物中的新用途。氧化苦参碱毒性低，临床使用安全、方便；氧化苦参碱在对肾综合征出血热病毒体外、体内抑制实验研究显示，氧化苦参碱对细胞的毒性作用低、对肾综合征出血热病毒有直接杀灭作用并能明显抑制该病毒的增殖；对感染该病毒的地鼠有明显保护作用，使其发病时间推迟、病程延长、死亡率降低；临床试验研究表明，氧化苦参碱对控制该病毒感染有一定作用，能加快退热时间、改善肾功能、减少出血、改善肝功能、减少少尿期发生。因此氧化苦参碱是治疗肾综合征出血热有效、安全的药物。
文档编号A61K31/4375GK1416813SQ0113216
公开日2003年5月14日 申请日期2001年11月9日 优先权日2001年11月9日
发明者吴同新, 潘怡 申请人:上海绿谷伟业生态工程有限公司