出血热相关病原体鉴别基因芯片的制备和用图
【技术领域】
[0001] 本发明涉及十六种出血热相关病原体核酸检测基因芯片的制备和用途，属基因芯 片检测技术领域。
【背景技术】
[0002] 病毒性出血热（ViralHemorrhagicFever，VHF)是一组由不同类型病毒引起， 以发热、出血为主要临床症状的一组自然疫源性疾病。出血热病毒主要分布在丝状病毒科 (Filoviridae)、沙粒病毒科（Arenaviridae)、布尼亚病毒科（Bunyaviridae)和黄病毒科 (Flaviviridae)。可引发出血热的病毒种类繁多，其中在全球范围内影响较大的包括：丝状 病毒科埃博拉病毒、马尔堡病毒、沙粒病毒科拉沙病毒、鸠宁病毒、马秋波病毒、布尼亚病毒 科裂谷热病毒、克里米亚-刚果出血热病毒、汉坦病毒、发热伴血小板减少综合征病毒、黄 病毒科登革病毒、黄热病毒、披膜病毒科基孔肯雅病毒等。该类疾病发病初期的临床表现并 不特异，类似流感、疟疾，常可发展到皮下、体腔和内脏出血，随之而来的是休克、昏迷和神 经功能障碍等，病死率高，危害严重。
[0003] 出血热病毒宿主和媒介类型广泛，传播方式多种多样，随着经济全球化的进展，各 地区商贸往来和人员交流更加快捷频繁，宿主和媒介分布的地理界线被打破，从而导致疫 情流行范围的扩大和突然暴发，也增加了发生输入性疫情的可能。2014年西非暴发的埃博 拉出血热是由埃博拉病毒引起的急性出血性传染病，自2014年3月报告出现首批病例到 12月24日共有19497人疑似或确认感染，导致7588人死亡，是1976年首次发现埃博拉病 毒以来发生的最大且最复杂的埃博拉疫情，本次疫情出现的病例和死亡数字超过了所有其 它疫情的总和。WHO已将埃博拉病毒列为对人类危害最严重的病毒之一，其平均病死率约 为50 %，在以往疫情中出现的病死率从25 %到90 %不等，目前发现有五个亚型，其中扎伊 尔型和苏丹型病死率最高，分别可达88. 8%和53. 2%。2014年中国广东暴发登革热，至12 月1日广东累计报告登革热病例45053例。据估计，全球每年实际感染登革病毒的病例高 达3. 9亿，其中超过2万人因严重感染而死亡。不仅既往发现的病毒疫情不时暴发，引起新 发传染病的新病毒也不断被发现。2010年我国发现具有重要公共卫生意义的新型布尼亚 病毒--发热伴血小板减少综合征病毒（SevereFeverwithThrombocytopeniaSyndrome Virus，SFTSV)，该病毒感染人体引起的发热伴血小板减少综合征，是一种以发热伴白细胞、 血小板减少和多脏器功能损伤为主要临床表现的新发传染病，死亡率高达30%。目前已在 山东、湖北、浙江、江苏等多个省市发现SFTSV感染病例，2011-2013年，美国密苏里州、日 本、韩国也相继报道发现有经蜱虫叮咬传播的类似SFTSV病毒感染病例，SFTSV感染已逐渐 成为全球性的重要公共卫生问题。
[0004] 由于病毒性出血热病死率高，传播途径广，极易造成社会恐慌，美国疾病预防控制 中心将出血热病毒列为一类生物武器，因此病毒性出血热的防控和治疗手段显得尤为重 要。但目前已商业化的出血热疫苗只有肾综合征出血热疫苗和黄热病疫苗，另外尚有阿根 廷出血热疫苗和裂谷热疫苗处于临床试验阶段；在药物治疗方面，尚无针对病毒性出血热 的特效药物。"诊"、"防"、"治"三个环节构成了完整的疾病预防控制链，其中"诊"不仅是其 中不可缺少的关键一环，而且也是有效防治的如提。在病毒性出血热的尚发和临床治疗手 段的缺乏情况下，准确有效的诊断病原体显得尤为重要。
[0005] 由于多数感染者早期缺乏特异的临床表现，且不同的病毒性出血热之间或者病毒 性出血热与其他疾病（例如疟疾、流感等）之间都存在相似的临床症状，必须依赖实验室 诊断方法加以确认。目前常用的出血热病原体实验室检测方法主要包括病毒分离、聚合酶 链反应法（PCR)、酶联免疫吸附法（ELISA)、间接免疫荧光法（IFA)、电镜技术（EM)和免疫 组化技术。上述方法都有各自的优缺点，有的方法操作复杂，耗时费力；有的方法特异性和 /或敏感性较低；有的方法样本用量过多；且上述方法均存在检测通量不足，检测范围有限 的问题。
[0006] 基因芯片（Genechip)又称为DNA芯片（DNAchip)、DNA微阵列（DNA microarray)，是生物芯片的一种，也是生物芯片技术中发展最成熟、最先进入应用和实现 商品化的技术。基因芯片技术是指直接将DNA探针或者在固相支持物（如玻片、硅片、尼龙 膜等）上原位合成寡核苷酸固定于支持物表面，然后与待分析的标记样品杂交，标记的样 品通过于基因芯片上已知碱基序列的DNA片段互补杂交，从而得到样品的遗传信息，确定 样品的核酸序列，或对基因表达量及其特性进行分析。基因芯片技术因其具有快速、准确、 高通量、高效率、低成本等特点被广泛应用于表达谱分析、单核苷酸多态性分析、疾病诊断、 病原微生物检测等方面。
[0007] 本研究结合出血热诊断的实际需要，选取了十三种出血热相关病毒，并加入可引 起相似症状的疟原虫及流感病毒，旨在研制出血热相关病原体鉴别基因芯片。基于化学发 光检测方法，同时检测十六种出血热相关病原体，包括扎伊尔型埃博拉病毒、苏丹型埃博拉 病毒、马尔堡病毒、拉沙病毒、鸠宁病毒、马秋波病毒、裂谷热病毒、克里米亚 -刚果出血热 病毒、疟原虫、汉坦病毒、发热伴血小板减少综合征病毒、登革病毒、黄热病毒、基孔肯雅病 毒、A型流感病毒、B型流感病毒。该芯片法特异性高，敏感性强，适合于多种致发热病症病 原体的快速鉴定。
【发明内容】
[0008] 本发明的目的在于提供一种基因芯片，该芯片可同时检测十六种出血热相关病原 体，包括扎伊尔型埃博拉病毒、苏丹型埃博拉病毒、马尔堡病毒、拉沙病毒、鸠宁病毒、马秋 波病毒、裂谷热病毒、克里米亚 -刚果出血热病毒、症原虫、汉坦病毒、发热伴血小板减少综 合征病毒、登革病毒、黄热病毒、基孔肯雅病毒、A型流感病毒、B型流感病毒，具有快速、准 确、高通量、高灵敏度的特点，可为出血热病原的诊断、卫生监督及传染病防控提供一种新 的技术手段。
[0009] 本发明所述的基因芯片其制备方法包括如下步骤：
[0010] 1?制备特异性引物
[0011] 经过比对各病原体基因组，选择特异、保守片段作为检测靶基因，在保证各病原体 靶基因特异性扩增的前提下兼顾其灵敏度，故将病原体特异性引物进行多重分管组合，经 优化最终确定了 3管多重TR-PCR体系。优选的29条特异性引物及其对应的扩增靶病原种 类和分管组合情况如表1所示，各下游引物5'端标记生物素。
[0012] 表1出血热相关病原体引物及其对应的扩增靶病原种类和分管组合情况
[0013]
[0015] 2?制备特异性探针
[0016] 本着型间保守、属间特异的原则，根据16种相关病原体靶基因序列间的比对，在 上下游引物范围内的序列相对特异区进行特异性探针的设计。每种靶病原对应一条特异性 寡核苷酸探针，优选的特异性探针序列如表2所示，每条探针的3'端加入12个碱基T并在 3'末端以氨基修饰。
[0017] 表2特异性探针序列及对应的靶病原
[0018]
[0019] 3.制备基因芯片
[0020] 一个优选的实施方案，步骤2中各个寡核苷酸探针在点样时，用芯片点样液 (6XSSC，5 %甘油，0. 1 %SDS)稀释至终浓度50yM。用市售的基因芯片点样仪以接触式 点样方式将探针点到空白的醛基化修饰玻片上（阵列如表3所示），各探针的点样量均为 3nl，其中质控探针为20T序列，5'端生物素标记、3'端氨基修饰，用来监测醛基片片基质 量。点制过程保持一定湿度，寡核苷酸芯片制备完毕后，芯片应至少在室温干燥放置24小 时，使探针与载体充分交联。
[0021] 表3寡核苷酸探针阵列
[0023] 4.建立RT-PCR体系
[0024] 本发明基因芯片中RT-PCR体系的特征为不对称多重RT-PCR反应体系。合适的 RT-PCR体系可以进一步提高芯片的检测灵敏度。对标记引物和非标记引物的绝对浓度和相 对比例、酶的用量等因素进行了优化。优选的RT-PCR体系及扩增条件，如表4所示：
[0025] 表4-1不对称多重RT-PCR体系配方
[0029] 5?建立芯片杂交体系
[0030] 合适的杂交体系对芯片的特异性及灵敏度改善也有很大的促进作用。通过优化得 到了同时可以保证特异性和灵敏度的预洗液及杂交液成分、杂交条件和杂交后洗涤条件。 基因芯片杂交前分别置于预洗液（0.2%SDS)与去离子水中清洗20s，RT-PCR产物在95°C 变性5min后立即置于冰水浴中。将RT-PCR产物与杂交液等体积混合，优选的杂交液各组 分为8XSSC，10%甲酰胺，1.2%SDS，10XDenhardt's。优选的杂交条件为45°C水浴杂交 1小时。优选的洗涤条件为分别在洗液A(1XSSC，0. 2%SDS)，洗液B(0. 2XSSC)和洗液 C(0?IXSSC)中各洗涤 20s。
[0031] 6?建立信号检测方法
[0032]将标记液（Str印tavidin-HRP)用稀释液（1XPBS+0. 1%BSA)以 1 : 1000 稀释， 于每个杂交区加入15y1，芯片置于37°C孵育30min。取出后用PBST洗液（1XPBS+0. 05% Tween-20)清洗20s，晾干。将化学发光HRP底物A液和B液（Millipore公司）等体积混 匀，每个杂交区加入20y1并迅速展开铺匀，立即置于化学发光成像仪中扫描。记录结果， 根据信号强度对结果进行判定。
[0033] 以上制备的出血热相关病原体鉴别基因芯片包括寡核苷酸芯片、RT-PCR体系、杂 交液、洗液A、洗液B、洗液C、Str印tavidin-HRP、稀释液、PBST洗液、化学发光HRP底物A液 和B液。
[0034] 本发明建立了一种基于化学发光技术平台的基因芯片，可以对16种出血热相关 病原体进行区分，包括扎伊尔型埃博拉病毒、苏丹型埃博拉病毒、马尔堡病毒、拉沙病毒、鸠 宁病毒、马秋波病毒、裂谷热病毒、克里米亚 -刚果出血热病毒、症原虫、汉坦病毒、发热伴 血小板减少综合征病毒、登革病毒、黄热病毒、基孔肯雅病毒、A型流感病毒、B型流感病毒。 该基因芯片和相应的制备方法，具有较强的实用性，通过一次实验操作实现多个病种的检 测，在缩短检测周期的同时提高检测效率。与常规培养方法比较，具有快速、准确、灵敏的优 势，与免疫学方法和其他核酸检测方法相比，具有高通量、高特异性的优点，可为出血热病 原的诊断、卫生监督及传染病防控提供一种新的技术手段。
【附图说明】
[0035] 图1:基因芯片外观示意图，每张芯片上有10个相同的分布有探针点阵的杂交反 应区。
[0036] 图2 :出血热相关病原体鉴别基因芯片探针点阵布局图，其中Ia至8a为质控点； Ib至Id为扎伊尔型埃博拉病毒探针；2b至