甲基化clstn2基因及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及甲基化CLSTN2基因及其应用，更具体的 涉及CLSTN2基因、CLSTN2基因的甲基化检测及其在诊治骨性关节炎中的应用。
【背景技术】
[0002] 骨性关节炎（Osteoarthritis，0A)是一种以关节软骨退行性病变和关节周围骨 质增生为主要病理特征的慢性进行性骨关节病。它是老年人中最常见的关节疾病，也是引 起中老年人关节疼痛的最常见原因。现今我国社会逐步进入老龄化，该病的发生率也呈逐 年上升趋势。
[0003] 骨关节炎主要侵害关节软骨、骨和滑膜组织，导致关节疼痛、畸形和功能障碍。目 前骨关节炎的病因尚未阐明，根据以往的流行病学研究，学术界普遍认为OA是一种遗传因 素与环境因素共同作用、多因子参与的复杂性疾病。
[0004] 表观遗传学为当今遗传学术界研究的一大热点，指在不改变基因组序列的前提 下，通过DNA和组蛋白的修饰的方法来调控基因表达。这种DNA和组蛋白的修饰过程以DNA 甲基化最为常见。DNA甲基化作用是在各种生物体内普遍存在的一种基因修饰作用，是基因 表达过程中的重要调控因素之一。已有报道表明OA发生、发展过程与软骨细胞的DNA甲基 化有一定相关性，但相关的研究还十分匮乏，亟待更多的研究揭示与骨性关节炎相关的甲 基化基因，并阐明所述甲基化位点与OA的关系。
[0005] 本发明通过对5例骨性关节炎病人及2例对照的膝关节软骨组织进行高通量甲基 化测序分析及转录组测序分析，筛选出几个在病例组中呈高甲基化且基因表达下调的候选 基因及其甲基化位点。进一步的分子生物实验验证结果表明，候选基因CLSTN2在骨性关节 炎患者膝关节软骨组织中低表达，同时该基因在患者膝关节软骨组织中甲基化程度明显高 于正常组。本发明提供了一种新的骨性关节炎诊治靶点，具有重要的临床应用价值。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的在于提供一种骨性关节炎诊疗试剂，所述诊疗试剂组分中的一种或 几种用于检测或降低序列表中SEQ ID NO. 3的CpG岛甲基化程度。
[0007] 进一步，所述诊疗试剂组分中的一种或几种用于检测或降低序列表中SEQ ID NO. 3的第112bp处CpG岛甲基化程度。
[0008] 进一步，采用下列方法中任意一种或几种的组合对甲基化程度进行检测：甲基化 敏感的限制性内切酶方法、~ &批03法、芯片技术方法；所述NaHSO3法包括BSP测序法、联合 NaHSO3限制性分析法、甲基化特异性PCR、荧光定量法；所述芯片技术方法包括甲基化高密 度芯片、差异甲基化杂交、甲基化特异性寡核苷酸芯片。
[0009] 甲基化敏感的限制性内切酶方法是经典的甲基化分析方法，主要根据一些限制性 内切酶不能切开甲基化的DNA序列。由于在真核DNA或者哺乳动物DNA中，只有CG相连的 胞嘧啶能够被甲基化，因此，在酶切位点内包含CG序列的限制性内切酶就会遇到问题。这 种方法所使用的两个经典酶对是HPaII-MspI(CCGG)和SmaI-XmaI(CCCGGG)。由于第二 对限制酶识别序列非常罕见，所以一般都用HPaII-MspI(CCGG)。两个酶都识别CCGG序 列，而当其中的胞嘧啶甲基化时，HPaII不能够将其切开，利用HpaII-Msp工的这种属性处 理DNA，这就使得HPaII-MspI能够作为快速甲基化分析的工具，随后进行Southern或PCR 扩增分离立物，明确甲基化状态。
[0010] NaHS(V^将非甲基化的C转化为U，后者经PCR扩增变成T而产生T:A配对，但甲 基化的C则能抵抗NaHSO3的修饰，这样DNA包含的甲基化信息就可转化为DNA序列的差异。 由此发展了多种CpG岛甲基化检测方法，如BSP测序、PCR(C0BRA，MSP，Methelight等）、芯 片杂交技术（microarray)，此类方法适应于检测己知基因中一个或多个CpG岛的几个CpG 位点的甲基化，属位点特异性DNA甲基化检测技术。
[0011] 芯片技术的发展为高通量研究DNA甲基化提供了新的方法。它的方法原理大致可 分为3种：（1)基于亚硫酸氢盐处理后C/T转变的原理，（2)基于甲基化敏感性内切酶或者 甲基化依赖性内切酶的方法，（3)基于5-甲基胞嘧啶抗体或者MBD的免疫扑获方法富集甲 基化的DNA片段。
[0012] 优选的，采用BSP测序法对SEQIDNO. 3的甲基化程度进行检测，更优选的，采用 引物序列为序列表SEQIDNO. 4和SEQIDNO. 5进行BSP测序检测。
[0013] 优选的，采用甲基化特异性PCR法对甲基化程度进行检测，甲基化特异性PCR法包 括一对甲基化检测引物和一对非甲基化检测引物。优选的，甲基化特异性PCR法对序列表 中SEQIDNO. 3的第112bp处CpG岛甲基化程度进行检测。
[0014] 优选的，采用引物序列为序列表SEQIDNO. 6到SEQIDNO. 9进行甲基化特异性 PCR法对甲基化程度进行检测。
[0015] 本发明的目的在于提供上述诊疗试剂在制备骨性关节炎诊疗工具中的应用。
[0016] 本发明的目的在于提供一种检测CLSTN2基因的试剂在制备诊断骨性关节炎诊断 制剂中的应用。
[0017] 进一步，所述诊断制剂中含有检测CLSTN2基因表达量和/或检测CLSTN2基因甲 基化程度的试剂。
[0018] 优选的，采用下列方式中的一种或几种检测CLSTN2基因表达量：荧光定量PCR试 剂盒、基因芯片、ELISA法和/或胶体金法，更优选的，采用引物序列为序列表SEQIDNO. 1 和SEQIDNO. 2进行CLSTN2基因表达量检测。
[0019] 基因芯片又称为DNA微阵列（DNAmicroarray)，可分为三种主要类型：1)固定在 聚合物基片（尼龙膜，硝酸纤维膜等）表面上的核酸探针或cDNA片段，通常用同位素标记 的靶基因与其杂交，通过放射显影技术进行检测。2)用点样法固定在玻璃板上的DNA探针 阵列，通过与荧光标记的靶基因杂交进行检测。3)在玻璃等硬质表面上直接合成的寡核苷 酸探针阵列，与荧光标记的靶基因杂交进行检测。基因芯片作为一种先进的、大规模、高通 量检测技术，应用于疾病的诊断，其优点有以下几个方面：一是高度的灵敏性和准确性；二 是快速简便；二是可同时检测多种疾病。
[0020] 酶联免疫吸附实验（ELISA)即将已知的抗原或抗体吸附在固相载体表面，使酶标 记的抗原抗体反应在固相表面进行的技术。该技术可用于检测大分子抗原和特异性抗体 等，具有快速、灵敏、简便、载体易于标准化等优点。ELISA检测试剂盒根据检测目的和操作 步骤可分为间接法、双抗夹心法、竞争法、双位点一步法、捕获法测IgM抗体、应用亲和素和 生物素的ELISA。ELISA检测试剂盒中生色底物可选择辣根过氧化物酶（HRP)或者碱性磷 酸酶（AP)。
[0021] 常用的免疫胶体金检测技术：（1)免疫胶体金光镜染色法细胞悬液涂片或组织切 片，可用胶体金标记的抗体进行染色，也可在胶体金标记的基础上，以银显影液增强标记， 使被还原的银原子沉积于已标记的金颗粒表面，可明显增强胶体金标记的敏感性。（2)免疫 胶体金电镜染色法可用胶体金标记的抗体或抗抗体与负染病毒样本或组织超薄切片结合， 然后进行负染。可用于病毒形态的观察和病毒检测。（3)斑点免疫金渗滤法应用微孔滤膜 作载体，先将抗原或抗体点于膜上，封闭后加待检样本，洗涤后用胶体金标记的抗体检测相 应的抗原或抗体。（4)胶体金免疫层析法将特异性的抗原或抗体以条带状固定在膜上，胶 体金标记试剂（抗体或单克隆抗体）吸附在结合垫上，当待检样本加到试纸条一端的样本 垫上后，通过毛细作用向前移动，溶解结合垫上的胶体金标记试剂后相互反应，当移动至固 定的抗原或抗体的区域时，待检物与金标试剂的结合物又与之发生特异性结合而被截留， 聚集在检测带上，可通过肉眼观察到显色结果。该法现已发展成为诊断试纸条，使用十分方 便。
[0022] 本发明的目的在于提供一种治疗骨性关节炎的制剂，所述制剂中含有促进CLSTN2 基因的转录或表达的试剂或化合物。
[0023] 本领域人员熟知促进基因及其表达产物的表达通常可以采用下述方法中的一种 和/或几种：激活CLSTN2基因的启动子、激活CLSTN2基因表达的蛋白或因子、导入促进 CLSTN2基因转录或表达的载体。
[0024] 本发明的目的在于提供一种检测骨性关节炎的基因检测试剂盒，所述试剂盒检测 基因CLSTN2。
[0025] 本发明目的是提供了一种骨性关节炎蛋白检测试剂盒，所述的检测试剂盒检测 CLSTN2蛋白。进一步的，所述的试剂盒还包括其他检测试剂。
[0026] 本发明目的是提供了一种检测骨性关节炎的基因芯片，所述的基因芯片包括与 CLSTN2基因的核酸序列杂交的探针。
【附图说明】
[0027] 图1骨性关节炎组和对照组中CLSTN2基因甲基化情况
[0028] 图2骨性关节炎患者组内CLSTN2蛋白表达和基因甲基化相关性分析图
【具体实施方式】
[0029] 下面结合具体实施例，进一步阐述本发明，仅用于解释本发明，而不能理解为对本 发明的限制。本领域的普通技术人员可以理解：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可 以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限 定。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照厂商所建议的条 件实施检测。
[0030] 实施例1样本的采集及测序
[0031] 对照组：收集2012-2014年因交通事故在医院进行半月板损伤及交叉韧带损伤进 行关节镜手术治疗的患者，取膝关节软骨组织速存于液氮罐。
[0032] 骨性关节