稳定化的瞬时基因表达的制作方法

专利名称：稳定化的瞬时基因表达的制作方法
技术领域：
本发明涉及增强导入真核培养细胞的外源基因的瞬时表达的方法和试剂。
背景技术：
外源DNA导入真核宿主细胞可用于许多目的。例如，该技术可提供遗传互补的方法鉴定特定基因，例如表达对代谢途径关键的酶的基因可通过其拯救该途径缺陷的细胞的能力来鉴定。外源基因的导入也可以是为了将受体细胞暴露于正常情况下对该细胞而言非天然的高剂量蛋白质中，例如为了杀死恶性细胞而导入细胞毒性蛋白质。此外，可将外源基因导入宿主细胞以获得足够多的外源基因的蛋白产物，以便可收获该蛋白用于进一步研究或用作药物。此外，外源基因的导入可看作体细胞基因治疗的有前途的途径。基因治疗的目标是通过提供缺失或缺陷基因的有功能的拷贝或提供用于治疗目的的临时治疗性外源基因产物，来治愈先天的遗传缺陷。体细胞基因治疗的一个途径是离体策略，其中从机体分离细胞，将转基因DNA插入细胞，然后将该细胞导回机体。在另一个途径中，用直接导入患者体内的外源DNA靶向体内细胞。有多种方法可用于外源基因导入活细胞。
可将转染方法分为设计成获得外源基因“瞬时”或“稳定”表达两类。对于现有方法，这两类结果之间的划分界限是导入的DNA是否整合至宿主基因组中，已整合外源DNA的细胞通常称为“稳定转化的”。与稳定转化相比，转染DNA的瞬时表达并不依赖于外源DNA整合至宿主细胞染色体。尽管人们认为施加给细胞的大多数DNA被迅速转入核内，但在一些系统中，在转染后长达80小时仍可检测到表达而不存在任何可检测的整合(见例如Gorman,C.,DNA克隆Ⅱ，实用方法(DNA CloningⅡ,A Practical Approach),Glover,D.M.,编辑，IRL Press,Oxford，第143-190页(1985)；Wynshaw-Boris等，生物技术(BioTechniques)，4:104-117(1986))。在瞬时表达可检测之前无需筛选步骤。然而，典型地，摄取了外源DNA的细胞仅有约1-10％从未整合的外源基因转录mRNA(见例如Gorman等，核酸研究(Nucl.Ac.Res.)，11:7631-7648(1983))。尽管在瞬时转染细胞中绝大多数转染DNA没有整合至宿主DNA中，但在约0.001-1％的这些细胞中转染DNA的确获得整合(Alam和Cook，分析生物化学(Anal.Biochem.)，188:245-254(1990))。该稳定转染的少部分细胞被认为在紧接着转染之后观察到的外源基因表达图谱中无显著或有用的作用。已开发了用病毒载体增加整合外源DNA的最初转染细胞的比例的方法(Flamant等，国际发育生物学杂志(Int.J.Dev.Biol.)，38:751-757(1994)；Bilbao等，FASEB J.,11:624-634(1997))。
不经过选择步骤，外源基因的表达通常在两至三天内从转染细胞培养物中消失。典型地，在约48小时表达最高，并只在24-80小时可检测到(Gorman(1985)；Wynshaw-Boris等(1986)；Berthold,W.,Dev.Biol.Stand.,83:67-79(1994))。普遍认为转染细胞摄取的大多数DNA被核酸酶迅速降解或被细胞分裂稀释(见例如Gorman(1985)；用阳离子脂试剂进行真核转染指南(Guide to Eukaryotic Transfection with Cationic LipidReagents)，生物技术(Life Technologies)；Bilbao等(1997))。
因为瞬时表达不要求靶细胞处于活跃分裂，所以它可在非正常分裂的定期分化细胞中实现，尽管对转染的易感性在这些细胞中变化非常大。例如，当直接注射至鼠骨骼肌中时，裸DNA可长时期表达(Wolff等，科学(Science)，247,1465-1468(1990))。在其它研究中，裸DNA被用作疫苗(如Cohen,J.,科学，259,1691-1692(1993))，缺陷逆转录病毒载体被用于利用成肌细胞作为载体递送转基因产物(Partridge和Davies,Brit.Med. Bull.,51:123-137(1995))。
许多研究集中于在体内用脂质体递送外源DNA至肝细胞中(见例如，Wu和Wu，生物化学杂志(J.Bioil.Chem.)263:14621-14624(1988)；Chow等，J.Pharmacol.Exp.Ther.,248:506-13(1989)；Wu等，生物化学杂志，264:16985-16987(1989)；Kaneda等，生物化学杂志，264:12126-12129(1989a)；Kaneda等.科学，243:375-378(1989b)；Wilson等，生物化学杂志，267:963-967(1992a)；Wilson等，生物化学杂志，267:11483-11489(1992b)；Chowdhury等，生物化学杂志，268:11265-11271(1993)；Perales等，美国国家科学院院刊91:4086-4090(1994)；Kormis和Wu，肝病研讨会(Seminars in Liver Disease),15:257-267(1995)；Buolo等，Mol.Marine Bid.Biotech.,5:167-174(1996))。外源DNA靶向特定体内组织的一个途径是受体介导的脂质体递送(见Kormis和Wu(1995)的评论)。在将该策略应用于肝时，Wu和他的同事们利用了肝细胞表面的脱唾液酸糖蛋白受体将注入的脂质体靶向肝。许多出版物描述了该脂质体递送系统(Wu和Wu(1988)；Wu等(1989)；Wilson等(1992a)；Wilson等(1992b)；Chowdhury等(1993)；Perales等(1994))。脱唾液酸糖蛋白和与聚赖氨酸形成静电复合物的DNA一起包装在脂质体中。当最初的努力成功之后，该小组试图通过对受体大鼠进行部分肝切除使外源DNA的稳定整合最大化。因为再生肝细胞提供比正常肝中存在的更高比例的S期细胞，这种策略期望增加可整合外源DNA的肝细胞的比例。在部分肝切除手术后，转染后血液中可检测到转基因蛋白的时间长达11周(Wu等(1989))。最初，这些研究者认为注射的DNA已经整合，但后来的实验揭示没有可检测的整合DNA，相反，显示保留的外源DNA留存在原生质膜/核内体部分中(Wilson等(1992b)；Chowdhury等(1993))。此惊人发现说明部分肝切除通过独立于DNA合成本身的机制导致转基因DNA存留。其他人报道了通过改变DNA与脂质的比例改善使用脂质体递送载体转染的效率(Buolo等(1996))。
另一个小组也采用靶向策略将注射的DNA导向肝(Kaneda等(1989a)；Kaneda等(1989b))。在此，转基因DNA和核内正常存在的蛋白质即非组蛋白染色体蛋白质一起包装在脂质体中。他们观察到注射的小泡向肝细胞的核转运，并且在注射后可测到的转基因表达长达7或8天。然而该DNA并未整合至肝细胞染色体中。其他人报道了CaPO4-DNA沉淀直接注射至肝、脾或腹膜后外源DNA在体内成功表达(Kaneda等(1989a))。
已显示许多试剂增加体外稳定转化的效率。一个小组报道在CaPO4介导的转染过程中，通过控制培养基的pH，可实现高达50％的稳定转化效率(Chen和Okayama，分子细胞生物学(Mol.Cell.Biol.),7:2745-2752(1987))。
另一种报道增强转染DNA表达的试剂是丁酸或它的钠盐(Gorman等(1983))。将细胞暴露在丁酸钠中12小时后，Gorman等观察到表达转基因的受体细胞百分数增加了2-4倍，当该结构中加入SV40增强子时，外源基因表达水平增加了25-100倍。在用存在丁酸盐时转染的其它培养物筛选稳定转化体时，他们观察到产生稳定转化体的转染细胞百分数与对照相比显著增加。但是，Palermo等(生物技术杂志(J.Biotech.)，19:35-48(1991))等观察到无论丁酸盐在转染步骤中是否存在，它都可诱导稳定转化体中转基因表达的增加。的确，许多报道证明丁酸盐能诱导某些蛋白质的合成或增加体外细胞分化(Boffa等，生物化学杂志，256:9612-9621(1981)；Kruh，分子细胞生物化学(MoL Cell.Biochem.)42:65-82(1982)；Chabanas，等，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.),183:141-151(1985)；Parker，生物化学杂志，261:2786-2790(1986)；Kooistra，等，Biochem.J.,247:605-612(1987)；Kaneko，等，Canc. Res.,50:3101-3105(1990)；Nathan等，Exp.Cell Res.,0:76-84(1990)；Palermo等，(1991)；Kosaka等，Exp.Cell Res.,2:46-51 5(1991)；和Oh等，Biotechnol.Bioeng.,42:601-610(1993))。基因诱导的最佳丁酸盐浓度根据不同细胞类型而变化，其细胞毒性作用最小的适当浓度范围必须对每一类靶细胞通过经验确定(见例如，Gorman(1985)；Parker等(1986)；Oh等(1993))。有报道称丁酸(或丁酸盐)还能可逆地抑制培养细胞的生长(Boffa等(1981))，增强干扰素的抗肿瘤作用(Kruh,1982)。
在没有筛选步骤时如果有增加转基因表达效率和持续时间的方法和试剂，则瞬时表达，即未整合外源DNA的表达，的有用性将可极大地改善。
而且，本文证明本发明化合物抑制培养细胞对培养基中的葡萄糖的消耗，从而迫使细胞依赖替代碳源作为能源。同样这些细胞显示产氨增加，从而提示蛋白质被用作能源的替代来源。此外，这些化合物存在时生长的细胞被诱导表达和分泌内源性的碱性磷酸酶活性。
本发明还提供通过各种递送系统导入靶细胞的外源基因的长期瞬时表达，运送系统包括但不限于阳离子脂(即脂质体)和各种合成聚合物如树状聚合物(也称“星形(starburst)”聚合物；例如见美国专利5,661,025)。本发明化学化合物许多影响外源DNA导入细胞很久之后的外源基因表达的命运，因此其作用不依赖于导入DNA的方法。一些本发明化合物在导入外源DNA后的头四天内对增加表达程度特别有效，因此看起来增加摄入细胞内的初始DNA量，和/或增加表达DNA的细胞的比例，而其它化合物延长瞬时表达的持续时间。
本发明化合物含有疏水部分和酸性部分，后者可采取盐或酯的形式。而且，它们是生物适合的，也就是说，当以增强瞬时表达的有用浓度应用于细胞时，50％以上的细胞保持存活。
本发明的方法涉及将所述化合物分为“A型”制剂，其主要增加外源DNA加至细胞后头4天中瞬时表达的程度，和“B型”制剂，其主要在外源DNA进入细胞之后稳定瞬时表达。在本发明一个优选实施方案中，通过如下方法获得表达在转染步骤之前、过程中、之后用A型化合物或制剂处理细胞，并在导入外源DNA后数小时或数天内(如12-60小时)再加入B型化合物或制剂，其后使它与细胞接触。在转染步骤之前和过程中的时期称为“瞬时表达第一期”，外源DNA进入靶细胞之后的时期称为“瞬时表达第二期”。通常在贯穿瞬时表达两个时期在培养基中保持至少一种A型化合物。本发明还提供测定单个化学化合物效力的分析方法，进而提供用于瞬时表达两个时期的两或多个化合物组成的制剂。
与以前观察到的相比，本发明的化学化合物使活细胞能在长得多的时期内维持外源DNA的瞬时表达。而且，加入这些化合物之后，令人惊奇的是，培养细胞减少对葡萄糖的消耗，同时增加其它能源如蛋白质也可能还有脂类的利用。
在其它实施方案中，本发明提供了在无饲养细胞和无需用蛋白质类或其它粘着促进分子预先包被细胞培养基质时培养肝细胞的方法。
附图简述参考如下详细描述和附图，本发明的上述方面和许多伴随的优点将更容易理解和更好地理解，其中

图1显示暴露于本发明几种不同化合物中的细胞的生长曲线。图1图示实施例4和表7所述的一些平板的细胞生长量。图1插入框中的数字相应于表7中所列的平板数；图2图解说明一些化合物的细胞毒性，其实验结果显示于表7。图2插入框中的数字相应于表7中所列的平板数；和图3图解说明实施例6的实验结果。每对柱型图相应于表10所示的其中一个平板，如图所标明。这些实验涉及在各种延长瞬时表达持续时间的化学化合物存在时类似肝细胞的分化猪PICM-19 3BT细胞中的瞬时表达。
图4图解说明实施例8所述实验中每天收获的样品中测量的β-半乳糖苷酶的量，还说明了在稳定瞬时表达的化合物存在时培养于生物反应器的转染细胞中转基因表达的长期稳定化(即32天)。
图5A-5C图解说明实施例8所述实验每天取样的培养基中氨、葡萄糖和乳酸的浓度。图5A显示每个样品中所测量的氨浓度；图5B显示每个样品中所测量的葡萄糖浓度；图5C显示每个样品中所测量的乳酸浓度。
优选实施方案的详细说明对于外源基因的表达采用瞬时表达比稳定转化有许多优点。首先，采用瞬时表达可快速分析相对大数量的结构。其次，它可作为递送仅希望在发病期间存在于机体中的治疗蛋白的方法。而且，瞬时表达可避免标准稳定转化程序所引起的突变或细胞死亡的危险，在标准稳定转化程序中外源DNA可插入细胞的关键基因中。此外，瞬时表达可在未永生化的原代细胞系中实现，而稳定转化体只能从可在培养中长期存活和分裂的细胞来建立。但是，除了肝切除模型外，目前已知的瞬时表达方法的一个主要缺点一直是外源基因表达时间相对短，以及转染试剂包括纯化的DNA本身倾向对活细胞有毒。而且，肝切除或其它手术切除对大多数实际目的而言过于激烈。因此，本发明提供拓宽该方法适用性的稳定化瞬时表达的方法。定义转染本文术语“转染”是指将外源DNA导入受体细胞的任何方法，包括脂质体介导法、病毒载体、CaPO4-DNA共沉淀、DEAE-葡聚糖、裸DNA、与蛋白质复合的DNA、在星形聚合物(树状聚合物)存在时转染、或其它将DNA导入受体细胞的方法。
外源DNA/转基因DNA适当制备用于受体真核细胞中表达的遗传物质，典型地但不必需来源于受体细胞以外的生物。典型地，转基因DNA含有生物学活性蛋白或蛋白域的编码区(转基因)。转基因DNA通常为环状，并可连接真核启动子或其它在宿主细胞中指导外源基因功能性转录的调节信号。调节信号可包括结合RNA聚合酶的启动子、增强子、转录终止信号、核糖体结合位点、翻译起始和终止信号、poly(A)添加信号等。增强子可是组织特异的或可诱导的，而且指导转基因蛋白分泌的信号肽可加在该结构中以产生分泌至培养基中的融合蛋白。
β-半乳糖苷酶(β-gal)可将无色底物转变为容易检测的有色产物的细菌酶。该基因在以下实施例中用作说明本发明效用的代表性外源基因。
“转染”或“转导”描述外源基因(“转基因”)导入活宿主细胞的过程。表达或含有外源DNA的宿主细胞称为“转化细胞”，转化这些细胞的过程称为“转化”或“转导”。不同细胞类型对转化的易感性不同，典型地，导入外源DNA的程序通过调节各种参数来优化，所述参数有例如pH、培养基类型、DNA量、CO2浓度、或DNA导入方法(参见例如Chen和Okayama，分子细胞生物学7:2745-2752(1987)；Buolo等(1996))。
用于增强外源基因瞬时表达的本发明方法和试剂在多种真核细胞中有效，例如肿瘤细胞系、分化细胞和非永生化原代细胞。已显示有效的具体细胞系包括人结肠癌细胞、鼠黑素瘤细胞、猪原代肝细胞和类似分化肝细胞的猪细胞系。
对于瞬时或稳定转染，外源DNA可采用任何方便的方法导入细胞，包括但不限于脂转染、电穿孔、与CaPO4-DNA共沉淀孵育、玻璃珠、与DEAE-葡聚糖孵育、将DNA连入病毒载体等。对于脂转染，将DNA与脂质体结合，脂质体是聚集形成膜结构的脂分子形成的充满液体的囊泡。DNA分子可包在脂质体中或与脂质体膜相连。作为外源基因导入细胞的方法，将脂质体与受体细胞融合。尽管应用广泛，脂转染的一个局限是脂质体对活真核细胞多少有毒。在其它常用方法中，DNA可与CaPO4共沉淀，然后应用于细胞，或者通过与DNA形成静电复合物的DEAE-葡聚糖聚合物介导外源DNA进入，该复合物通过胞吞作用内在化至细胞中(Kormis和Wu,Seminars Liv.Dis.,15:257-267(1995))。转染程序的实例到处可见(见例如，Sambrook等，分子克隆(Molecular Cloning)，第2版(1989)，其以参考文献并入本文；Gorman,C.,第6章，第143-190页，DNA克隆Ⅱ一实用方法(DNA CloningⅡ-A Practical Approach),IRLPress,Oxford(1985),Glover,D.M.编；Wynshaw-Boris等，生物技术(BioTechniques),4:104-119(1986)；Chang,Pi.(编)，体细胞基因治疗(Somatic Gene Therapy),CRC Press,1995；和“用阳离子脂试剂进行真核转染指南”(Guide to Enkaryotic Transfection with Cationic LipidReagents),Life Technologies(Gibco-BRL)；Matthews和Keating，分子生物技术(Molec.Biotech.),5:259-261(1996))。还可使用电穿孔，其涉及用短暂高压电脉冲将外源DNA导入细胞((见例如Barsoum,J.,分子生物学方法(Methods in Molecular Biology),48:225-237(1995))。
过去，当外源DNA以CaPO4共沉淀形式或使用DEAE-葡聚糖导入细胞时，观察到最初大多数细胞摄取DNA，但其中仅小部分在DNA导入后表达DNA(见例如，Gorman(1985))。典型地，采用现有程序转染DNA的表达是短暂的。更少的小部分受体细胞(0.1-0.001％)通过将转染DNA共价连入宿主基因组使其稳定整合(见例如Wynshaw-Boris等(1986))。观察到的低水平共价整合的可能原因是要发生外源DNA整合必需存在活跃的DNA合成。因此，通常认为细胞只有在细胞周期的S期时才对稳定转化易感。然而，因为转染培养物中仅有极少部分细胞含有整合的外源DNA，所以从稳定转化细胞表达的转基因蛋白的量很少甚至不可检测。因此，稳定转化程序通常依赖于转染后筛选步骤来增加稳定转化细胞的比例(如 Kelleher和Vos(1994))。当采用传统转染程序时，在外源DNA导入细胞之后2-3天内瞬时表达典型地衰退至不可检测水平，除非转染后细胞在选择性培养基上培养，该选择培养基有利于稳定整合了转染DNA的细胞的生长或利于含有整合DNA的细胞的检测和克隆(如Gorman(1985)；Buolo等(1996))。
可在各种实验条件下选择分离稳定转化细胞的纯系培养物，以获得整合了外源基因和持续表达该基因的细胞系。典型地，可筛选基因，例如赋予药物抗性或编码生色蛋白的基因，可与编码目标蛋白的DNA同时导入宿主细胞。适于该目的的报告基因的例子包括细菌氯霉素乙酰转移酶、荧光素酶、碱性磷酸酶、细菌β-半乳糖苷酶等(见例如Alam和Cook，分析生物化学，188:245-2S4(1990))。如果使用药物抗性标记，必需将药物抗性细胞暴露于相关药物数周，以便稳定转化细胞在培养物中占优势。此外，含有整合DNA的细胞可通过如下共转染基因的表达来鉴定，该共转染基因可将生色底物转化为允许鉴定和手工克隆单个稳定转化细胞的有色物质。在极少数情况下，目标基因本身赋予稳定转化细胞可筛选性状。无论何种情况，稳定转化细胞的建立和分离将需要一到三个月完成(Wynshaw-Boris等(1986))。相反，转染步骤之后，根据本发明方法转染的细胞在非筛选培养基上培养，即该培养基没有选择性杀死缺乏转基因蛋白的细胞的药物，而且该方法不使用生色或其它方式区分或物理分离未整合DNA的细胞和含有外源DNA的细胞。还有，采用本发明方法，细胞持续表达可检测量的转基因蛋白的时间远超过用传统方法可望获得的约80小时。采用本发明方法，转染后4-5天乃至32天均可检测到转染的外源DNA的同源DNA和RNA。应用本发明方法时，瞬时表达典型地在约第2-3天内达到最高，然后降低至约初始水平的1/3，之后稳定保持7天至数周，尽管该模式根据所用的一或多种试剂不同可能会改变。因此，本发明特别有用的特征是它提供相对长时期的瞬时表达而无需建立稳定转化细胞培养物所用的冗长筛选步骤。
在本发明的一个实施方案中，根据本发明转染的细胞在非选择培养基上维持至少4天后检测到外源蛋白。非选择性培养基可是组织培养基，或当转染细胞存在于活宿主时可是血、血浆或细胞外液体。对本公开发明的该实施方案以及所有其它的实施方案来说，“试剂”理解为除了表达载体或转基因DNA本身之外的化学化合物。当该化学化合物从细胞培养基中除去后，转基因表达逐渐消失并且细胞恢复以前的行为。
尽管大多数病毒载体仅在活跃分裂的细胞中有效，来源于逆转录病毒或腺病毒的载体可用于将外源DNA导入真核宿主细胞(见例如Verma和Somia，自然(Nature),389:239-242(1997))，通常其并不整合。腺病毒在用于瞬时表达时显得尤为有效(例如Kelleher和Vos(1994))。如果需要，含有外源DNA的质粒或病毒载体可提供位于启动子和插入位点之间或插入位点之后的核苷酸序列，以便载体提供的核苷酸序列编码的一或多个氨基酸与外源DNA编码的蛋白质融合。这种融合序列可提供指导所期望翻译后修饰的多肽，例如分泌信号肽，或糖基附着位点。
对于根据本发明的瞬时表达，在外源DNA导入细胞之前、过程中或之后，将细胞与一或多种下述化学化合物接触，随后外源DNA的表达与不存在这些化合物时转染的细胞相比实质性增强。“增强瞬时表达”是指当采用本发明方法时转染之后头几天内转基因表达的量与对照相比增加了，或者是指瞬时表达期间与对照相比延长了，或兼而有之。对于这些方法，转染细胞与增加初始DNA摄取或表达效率、或者延长外源DNA进入细胞后的有效半衰期的一或多种化学试剂接触。单个化合物可能发挥上述两种作用。“外源DNA的有效半衰期”的确定是基于测量培养样品中存在的转基因蛋白的量，而不是直接测量转基因DNA的量。
可用于本发明方法的具体试剂包括多种化学化合物，其特征以下将作全面描述。“试剂”可由单一化学化合物或两或多种化合物的组合组成。而且该试剂可包括在瞬时表达第一期中施用的一或多种化合物以及外源DNA进入细胞后添加的其它一或多种化合物。这些瞬时表达增强试剂可存在于外源DNA导入之前、过程中或之后。当在导入DNA之后加至细胞时，该试剂典型地与细胞保持接触至少24小时或更长。
用作本发明方法试剂的化学化合物包括至少一个疏水部分和至少一个酸性部分。即使轻微疏水的部分，例如具有一个二碳链的部分，也可为本发明提供足够的疏水性。酸性和疏水部分可存在于单个试剂中，例如疏水有机分子。对于某些该化学化合物，酸性部分可修饰成盐或酯。在一个实施方案中，化学化合物是羧酸衍生物，其通用分子式是R1-C(=O)OR2，在另一个实施方案中，化学化合物是磺酸衍生物，其通用分子式是R7-SO2-OR8。
适合的羧酸衍生物(即R1-C(=O)-OR2)包括天然存在的氨基酸(如甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、甲硫氨酸、精氨酸、赖氨酸、组氨酸、脯氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸)、它们的非天然旋光异构体、和某些氨基酸衍生物(例如3-甲基-L-组氨酸，α-酮戊二酸、β-丙氨酸、肌肽、瓜氨酸、肌酸、叶酸、谷胱甘肽、马尿酸、高丝氨酸、N-氨甲酰天冬氨酸、N-甲酰-L-甲硫氨酸和鸟氨酸)。
关于通用羧酸衍生物分子式R1-C(=O)-OR2，对于氨基酸而言，R1是CHNH2R3，其中R3是天然存在氨基酸的侧链。可用于本发明方法的其它氨基酸衍生物包括还含有烷基取代基和具有其它功能基团的烷基取代基的氨基酸。这些氨基酸衍生物可用上述羧酸衍生物分子式表示，其中R1是-CHNH2(CH2)nR5，n=1-7，R5选自CH3、OH、CONH2、C6H4OH和CONHNH2。或者，R1是-(CH2)nCHNH2CO2H，其中n=1-8；-CH(CO2H)NHCONH2，或者R1是-C5H4N(即尼克酸和衍生物)。
除了氨基酸，可用于本发明方法的羧酸衍生物包括烷基、芳基和取代的烷基和芳基羧酸衍生物。优选的烷基和取代烷基羧酸衍生物可用上述通用分子式表示，其中R1是-(CH2)nR6，其中n=1-9,R6选自吲哚基、NCH3C(=NH)NH2、SCH3、NH2、CH3、CO2H、CONH2和NHC(=NH)NH2。优选的芳基羧酸衍生物包括苯甲酸和它的衍生物。苯甲酸衍生物可用上述分子式表示，其中R1是-C6H4R4，这里R4选自H、CH3、(CH2)nCH3、NH2、COCH3、CO(CH2)nCH3、C(CH3)3、CH(CH3)2、(CH2)nCH(CH3)2、(CH2)nCOCH3、OCH3和O(CH2)nCH3，其中n=1-3。已发现支链常常比直链更有效。
本发明中有用的羧酸衍生物包括羧酸(即R2是H)；羧酸酯(如R2是CH3和(CH2)nCH3，其中n=1-8)，包括具有其它功能基团如醚和酮基的酯(如R2是(CH2)xO(CH2)yCH3和(CH2)xCO(CH2)yCH3，其中x+y=2-7)；和羧酸盐，包括金属盐(如锂、钠、钾、钙和镁)和相对低分子量的阳离子(如铵)。
适合的磺酸衍生物可用通用分子式R7-SO2-OR8表示，它包括烷基、芳基、取代烷基和芳基磺酸衍生物(即，R7是烷基、芳基、取代烷基和芳基)。优选地，磺酸衍生物是低级烷基(即直链或支链C1-C5烷基)磺酸，更优选氨基取代的低级烷基磺酸，例如牛磺酸。优选地，芳香磺酸衍生物是苯磺酸衍生物，更优选氨基取代苯磺酸，例如3-氨基苯磺酸。本发明中有用的磺酸衍生物包括磺酸(即R8是H)、磺酸盐包括金属盐(如R8是锂、钠、钾、钙或镁)和相对低分子量的有机阳离子(如R8是铵离子)。
在另一个实施方案中，可用作本发明方法试剂的化学化合物包括多糖，既包括天然存在的多糖如来自植物或动物来源的多糖，它们常常以羧化形式天然存在，也包括用标准化学程序羧化的多糖。例如几丁质或纤维素可用标准化学方法羧化。
对本发明有用的多糖包括糖胺聚糖，糖胺聚糖是具有重复二糖单位的线性聚合物，所述二糖单位包含一个氨基已糖和一个羧酸或磺酸酯或二者兼有(综述见Hascall等，酶学方法(Methods in Enzymology)230:390-417(1994))。天然存在的糖胺聚糖有4类(ⅰ)透明质酸；(ⅱ)硫酸软骨素和硫酸皮肤素；(ⅲ)硫酸角蛋白；和(ⅳ)硫酸肝素和肝素。天然状态的后三种类型是蛋白多糖，即它们与蛋白质链共价连接。这些蛋白多糖必须在去蛋白之后才对本发明方法有效。去蛋白作用可通过任何方便的方法来实现，例如在碱如KOH或NaOH中加热(Bray等，1944；Partridge,S.M.,Biochem J. 43:387-397(1948))。
对本发明特别有用的化合物是磺酸化的氨基多糖。正常不含硫的天然存在氨基多糖如透明质酸或半乳甘露聚糖可采用标准化学反应如通过在硫酸存在时加热来修饰。优选地，多糖是磺酸化N-乙酰氨基多糖。如果在转染步骤之后添加，多糖试剂通常对增强瞬时表达最有效。
用于本发明的磺酸化N-乙酰氨基多糖的制备效率随聚合物的大小而变化。典型地，适合的多糖含有从约1到约50个重复单位，优选1-20个重复单位，更优选1-10个重复单位，重复单位通常包含一个二糖。因此，优选的磺酸化N-乙酰氨基多糖平均分子量不大于20 kDa，更优选不大于9 kDa，最优选不大于4 kDa。从天然来源提取的磺酸化氨基多糖通常由20 kDa或更大的聚合物构成，但可采用本领域熟知的方法将大聚合物打断变成更小更适合大小的聚合物。这些方法通常包括首先在碱性溶液、然后在酸性溶液中加热该聚合物(如，Bray等，Biochem.J.38:142，(1944))。在硫酸中加热可同时磺酸化和打断多糖链。应该理解，多糖制品在大小上不是均一的，指定多糖制品的大小只是近似的。多糖制品的平均分子量可采用本领域已知的方法通过电泳确定，如Partridge,S.M.,(1948)。“平均分子量”是指在电泳示踪中观察到的峰值处聚合物的大小或平均值，或采用其它大小测定分析方法观察到的平均值。
优选的磺酸化N-乙酰氨基多糖包括硫酸软骨素、肝素和硫酸皮肤素。硫酸软骨素是结缔组织天然存在的成分，通常从软骨提取物中纯化。它在分子量、重复二糖的N-乙酰半乳糖胺残基处的磺化程度和硫酸化重复单位与非硫酸化重复单位的相对分布上均有变化。硫酸软骨素的商业制品典型地含有可变的软骨素-6-硫酸(C6)和软骨素-4-硫酸(C4)的比例。“A型”硫酸软骨素制品通常含有30％的C6异构体和70％的C4异构体，而“C型”硫酸软骨素制品通常含有10％的C4和90％的C6。A型和C型硫酸软骨素制品均可从例如Sigma或Biorelease公司获得。例如Biorelease公司提供几种A型制品No.409-4U(4 kDa)；No.409(9 kDa)；和No.4D36(＞20 kDa)。A型(主要是C4)和C型(主要是C6)制品均对增强瞬时表达有效。
优选的多糖包括半乳甘露聚糖，它是从Cyamopsis tetragonolobus种子的胚乳作为具有与甘露聚糖主链相连的α-1,6-连接的D-半乳糖残基的高分子量β-1,4 D-半乳甘露聚糖(如达到约1,200,000道尔顿)而分离的。适于本公开方法的半乳甘露聚糖包括2-羟丙基醚衍生物，通称为羟丙基半乳甘露聚糖。商业上可购得的半乳甘露聚糖制品可通过先进行断裂和磺化来更有效地增强瞬时表达。这可通过例如在硫酸中加热来实现。
在本发明方法中有用的其它化学化合物包括肾上腺素、辅酶B12和甲钴胺。
对增强瞬时表达有效的化学化合物具有下列共同期望特征1．在有效增强瞬时表达的浓度范围内加入培养细胞时很少或没有细胞毒性。对于多糖试剂，该范围是约0.01-0.5 mM。对于其余可有效增强瞬时表达的化合物，该浓度是约1-15 mM。这些最佳量是可能已作为细胞培养基成分而存在的这些物质(如某些氨基酸)的量之外的。根据本分析没有细胞毒性的化合物在此定义为“生物适合的”。对于本发明而言，细胞毒性物质可定义为持续暴露于给定浓度的该物质时在SW480细胞的8天静止培养物中转染后4天内导致活细胞数降低＞50％的物质，其中到这8天时期结束时不出现细胞的净增加。然而，应理解各种细胞类型对不同的化学化合物的敏感性不同。因此，虽然可用SW480作为测定化学化合物生物适合浓度的方便工具，但可能需要按经验调节用SW480测定的浓度，以优化不同类型细胞的生物适合性。细胞毒性分析在实施例4中有更详细的描述。
2．总含有一个阴离子功能基团(例如羧基、磺酸基等)，通常是酸，并且可修饰该基团以降低细胞毒性。优选的修饰是形成酯或盐(包括基于有机阳离子的盐)，因为该化合物进入细胞后，盐和酯键可容易被代谢过程断裂。在一个优选实施方案中，水溶液中该化学化合物的pH为4.5-10.5。
3．除了阴离子基团外，该分子还包括相对疏水的有机基团。对于磺酸化多糖以外的化合物而言，分子的这部分优选是非极性和疏水性的。同样，通过相对疏水的功能基团的存在可修饰磺酸化多糖的天然亲水特性(例如，硫酸软骨素的2-取代位的N-乙酰基是一个修饰的氨基，该基团与未修饰的氨基相比相对疏水)。许多证明对本发明有效的化合物含有有机和疏水的酸性基团。
4．几种最有效的试剂(例如50/50的苯甲酸和苯甲酸钠的混合物(苯甲酸缓冲液)，以及硫酸软骨素)具有抗氧化和自由基清除特性(如见MerckIndex)。
以下，磺酸化氨基多糖以外的化合物将称为“组Ⅰ”，而多糖试剂称为“组Ⅱ”。在本发明的一个优选实施方案中，在外源DNA导入细胞之前和之间(即转染步骤)用选自组Ⅰ的化学化合物接触细胞，外源DNA导入之后进一步用选自组Ⅱ的化学化合物接触细胞。无论在转染之前、过程中或之后加至细胞，组Ⅰ化合物均有效，然而组Ⅱ化合物在细胞摄取外源DNA之后加入时是最有效的。组Ⅰ化合物最优选在DNA加入培养物之前、过程中和之后都存在。
应注意，在同种化合物用于增强瞬时表达的不同实验中观察到一些变化。在观察到低于期望程度增强的情况下，该现象与转染溶液中检测到的高水平内毒素相关，内毒素水平的测定使用实施例10所述LAL分析进行。因此，建议通过在存在细菌最少的条件下制备所有瞬时表达溶液，例如在标准无菌条件的超净工作台中制备该溶液，以最小化内毒素污染。使用这些条件，通常获得0.015-0.06的LAL水平(见表12)，该水平远低于FDA条例注射水允许的0.25 Eu/ml最大值。可增强转染的内毒素水平上限还未测定，但在一个实验中，用含有0.24 Eu/ml的溶液可观察到增强瞬时表达。因此，该上限似乎大于0.24并且可能在0.5-1.0 Eu/ml之间。
本发明提供用于延长培养细胞瞬时表达的方法，所述培养细胞包括原代培养物、已建立的细胞系、分化细胞的稳定培养物、生长因子维持的正常细胞系和转化细胞例如从各种肿瘤建立的培养物，包括杂交瘤细胞、SW480 P3人结肠癌细胞系(ATCC#CCL228以下称为＂SW480细胞＂)。本发明方法有效的特定细胞系的例子包括IB-3细胞(人支气管上皮细胞系)；ATCC No.BP6-FO细胞(鼠黑素瘤)；PICM-9(猪外胚层来源的肝干细胞样细胞)；COS-7；CHO-K1；人黑素瘤细胞系。
本发明方法还对外源DNA导入体内细胞有用。所述化合物可采用任何方便的方法施用，包括口服、局部给药、输注、注射、或肺气溶胶递送。如果希望将宿主暴露化学化合物限制于接受外源DNA的组织，则可通过局部注射导入化学化合物，例如直接注射至实体瘤块、或通过将靶向特定组织的蛋白整合在脂质体中、或将化合物并入缓慢降解的半固体生物适合聚合物。可在注射外源DNA递送载体的同时或之后，相同位点注射化合物或化合物的组合。作为替代，可将化合物置于在靶位点提供化合物缓释的载体中，例如通过惰性固体生物适合载体的溶解来进行。此外，本发明化合物可与裸DNA共施用，由此增加它们的有效性。
本发明包括收获或检测在上述化合物存在时导入细胞的转基因DNA表达的蛋白质。可采用任何方便的方法收获蛋白，例如提取转染细胞、或提取细胞生长培养基，如外源蛋白设计含有分泌信号肽的情况。给定蛋白的纯化步骤将取决于该蛋白的物理性质，如大小、形状、疏水性、稳定性等。收获的蛋白可用物理方法如凝胶电泳、等电聚焦，或层析法如高压液相层析等检测或定量。还可在数天的期间内重复检测转基因蛋白以监测所产生蛋白的相对或绝对量，从而提供评价不同转染方法效率或被测化合物效力以估计其增强瞬时表达的能力的方法。粗细胞提取物可用于分析收获蛋白的酶学或其它生物学活性，或者可采用标准程序进一步纯化该蛋白，然后进行该蛋白活性的功能分析。如果转基因在体内表达，则可从宿主的体液如乳汁或其它机体组织收获蛋白。
本发明方法导致在培养真核细胞或瞬时表达的哺乳动物宿主中快速生产有用量的转基因编码蛋白。对于真核来源的转基因，在真核细胞中表达是特别有利的，因为所述宿主细胞可支持剪接和翻译后修饰。而且，从真核细胞收获的蛋白质比从细菌宿主收获的蛋白质更不可能含有有毒污染物。
本发明方法提供从转染的真核宿主细胞获得商业上有用数量的生物学活性蛋白质如生长因子、激素、抗生素等而无需转染后筛选步骤也无需建立含有稳定整合外源DNA的永久细胞系的方法。这些方法可扩大用于快速获得待测其药物学特性的生物物质。
用选自本发明组Ⅱ的化学化合物接触细胞导致细胞粘着、细胞与细胞间的接触和通讯增加，因此，施用这些化合物提供了增强这些细胞-细胞相互作用的方法。因此，本发明包括通过在加至培养基中的磺酸化氨基多糖存在时生长细胞来增强细胞贴附培养基质从而增加培养细胞寿命的方法。例如，肝细胞在培养时正常不能存活，除非提供饲养细胞或预先用促进肝细胞贴壁的物质包被培养基质(见例如，Sidhu和Omiecinski,药物遗传学(Pharmacogenetics),5:24-36(1995))。然而，硫酸软骨素对促进具有分化肝细胞特征的细胞系培养物长期生长有效。与表面基质结合的硫酸软骨素以前被提议可用于在控制处于表面上的细胞模式的装置中提供细胞粘附表面(美国5,593,814)。其他人报道联合其它化合物一起施用硫酸软骨素以促进培养或体内的细胞粘附(美国5,593,814；美国4,458,678；美国4,418,691；美国4,711,780；美国5,545,722)。
当本发明试剂接触培养细胞时，该细胞显示代谢过程改变，包括葡萄糖消耗降低和乳酸产生以及产氨增加。因此，本发明方法可用于操作细胞代谢以便该细胞利用替代的碳源如氨基酸和肽甚至可能是脂质。对操作细胞能源利用特别有用的试剂是苯甲酸、4-乙基苯甲酸、硫酸软骨素和苯甲酸盐缓冲剂的组合，其中苯甲酸盐缓冲剂是苯甲酸和苯甲酸钠的等摩尔混合物。本发明方法可用于体外或体内操作细胞代谢，如治疗哺乳动物肥胖。
还有，组Ⅰ和Ⅱ化合物均诱导细胞表达可用标准碱性磷酸酶分析检测的提高水平的内源磷酸酶活性。可在转染细胞中测量到的该磷酸酶的量就在转基因基因产物开始从转染培养物中消失之前似乎增加或出现峰值。因此，定期测量该磷酸酶活性提供了一种监测转染细胞中转基因表达以便能预期转基因表达的降低的方法。
本发明提供增强体外和体内瞬时表达的试剂。最佳地，这些化合物在外源DNA导入之前、之间和之后施用，组Ⅱ化合物在DNA导入之后施用。当在体内使用时，组Ⅰ化合物可作为引子注射至受体组织或，与转基因DNA溶液混合静脉内注射，或在注射导入外源基因之后施用，或可作为食物补剂施用。例如肿瘤可通过直接注射化学化合物来预先处理，然后注射DNA，再然后口服相同或不同化合物的补剂。
在其它实施方案中，本发明提供在生长于生物反应器(即持久维持细胞于模拟实体瘤的半固体块中的培养系统)的细胞中获得外源基因稳定化瞬时表达的方法。在该模型瘤系统中发展的程序可用于将表达抗肿瘤化合物如IL-2的基因直接转染至实体瘤，并可作为测定新的抗肿瘤候选药物的测试系统。
组Ⅰ和组Ⅱ化合物似乎通过不同机制起作用增强瞬时表达，因为两组化合物的组合常常比分开使用这些化合物时更有效(见如实施例6)。在本发明一个优选实施方案中，在转染之前、过程中、之后用组Ⅰ的一或多种化合物接触细胞，并在转染步骤之后用组Ⅱ的一种化合物即磺酸化多糖接触细胞。
为便于描述可用作延长瞬时表达持续时间的试剂的化学化合物，定义了下列参数。这些参数称为“X”因子、“G”因子和“K”因子。
1．X因子X=100-A×100C]]>其中“A”是在所选时间期间内对照转染细胞表达的蛋白质量，“C”是加入了化学化合物的细胞中产生的蛋白质的量。
该因子反映了加至转染细胞的化学化合物在转染后头四天中增强稳定瞬时表达的程度。对于有稳定瞬时表达活性的化学化合物，X的值将大于1。例如，如果在一种化合物存在时表达加倍，则X=50。优选的化合物X大于10，最优选的化合物X大于25。该因子提供了一种比较转染后头四天培养基中存在本发明化学化合物时观察到的外源基因表达的量和缺乏该化合物的对照培养物中观察到的表达的量的方法。因此，X因子与存在和不存在该化合物时观察到的表达量之间的比例相关。当所述试剂为一种以上化学化合物的混合物时可同样计算X值。
累积蛋白表达即“A”和“C”的值，通过对培养细胞等分试样每天测量的值求和来测量。
2．G因子。G因子与X因子只有评价的时间期间不同。为了计算G因子，从第4-7或4-14天测量表达的蛋白量，其中第0天是外源DNA加至细胞中的当天。下标表示两个时间期间中哪一个作为测量基础。因此，“G7”表明是在第4-7天进行的测量，而“G14”表明测量是在第4-14天进行的。象“X”因子一样， 其中“A”和“C”的定义同X因子。
根据X和G因子描述化合物是有用的，因为一些X较低或为负值的化合物可能具有较高或正的G因子。具有高G7或G14的化合物对DNA已经进入细胞之后即在瞬时表达的第二期中向培养物加入一或多种化合物的瞬时表达特别有用。优选的化合物G＞0，更优选G＞10，最优选G＞25。
3．K因子。K因子是对照转染细胞中外源DNA表达变化的速度常数与暴露于本发明化学化合物的细胞中外源DNA表达变化的速度常数之比。K根据下列等式确定 其中”k(DNA)”是转基因DNA表达的蛋白质浓度变化的一级速度常数，它是蛋白质随时间变化的函数，即-d(DNA)dt=k(DNA),]]>它等价于log(DNA)=-kt2.303+log(DNA)0.]]>为方便起见，此处使用术语“d(DNA)”，反映转染DNA有效浓度的变化，尽管观察到的外源基因产物的量的变化可能还取决于细胞中外源DNA浓度以外的参数。因此，对照转染培养物中一级反应速度表示为-k(DNA)=d(DNA)/dt，或log(DNA)=-kt/2.303+log(DNA)0。因此当log(DNA)对时间作图时，Y截距或log(DNA)0反映了表达的转染DNA的起始浓度。而且，当表达降低时该线的斜率等于-k(DNA)/2.303。
使用外源DNA加至细胞之后约24小时开始进行的转基因蛋白质测量结果，k(DNA)值可通过使用计算机程序以外源蛋白质浓度的log对时间作图来获得。由于取样误差和各种因素引起的可变性，数据点通常不形成平滑的线。然而，程序为每个数据集计算出“最适”线，并确定所获曲线相应于蛋白质生产变化时期的那部分的斜率。典型地，在转染后48小时期间观察到蛋白质合成的最大量。此后，表达速度典型地以一定速度降低，对此通过在转染之前、过程中和/或之后用本发明各种化学化合物接触细胞进行操作。因此，计算在这段降低时期内的斜率以提供k(DNA)和K值，用于比较不同化学化合物的效力。对于特别有效的本发明化学化合物制剂，表达速度最初降低之后跟着表达速度增加，或者在有些情况下，在整个实验期间均没有观察到降低。
因此，K因子反映了化学化合物对外源DNA已导入细胞之后外源基因表达稳定性的影响，而不是这些化合物对初始DNA摄取的影响。K因子之所以重要是因为与改善瞬时表达的其它报告的方法相比，本发明的优点主要来自提供在转染步骤之后稳定瞬时表达的方法，而不是来自试图改善DNA摄取效率的传统途径。然而，本发明一些化学化合物在转染后头四天有效性最大，提示它们可能通过诱导细胞摄取增加数量的转染DNA来起作用。这些化合物也可延长外源DNA进入细胞之后基因表达的有效半衰期。
K值可为正值或负值，这可按如下理解。K本身是一个比较实验和对照培养物之间转基因表达变化速度的比值。实验培养物是采用本发明化合物增强瞬时表达的培养物。对对照培养物而言，转基因表达量在转染步骤之后开始的即通常是给细胞加入转基因之后约24小时的比较期间不可避免地降低。因此，代表对照培养物转基因表达变化的曲线斜率总是负值，即负的斜率。对大多数本发明化合物，转基因表达量在该比较期间也将降低，尽管不象对照培养物一样多。因此，对于这些化合物，代表表达变化的曲线斜率将是负值。在计算这些化合物的K值时，实践中可用来自对照培养物的负值除以来自实验培养物的负值，得到一个正的K值。然而，本发明一些化合物如此有效以致于该测量期间表达的外源蛋白质的量实际上增加而不是降低。在这种情况下，描绘实验培养物这种变化的曲线斜率将为正值而不是负值，结果K本身为负值。
因此，对于K为正值的化合物，K的绝对值将随该化合物有效性的增加而增加。对于K为正值的优选化合物，K优选大于1，更优选K＞10，最优选K＞50。相反，当K值为负时，K的绝对值将随该化合物有效性的增加而降低。因此，对于K为负值的优选化合物，优选K＜-1000至-100，更优选K＜-100至-10，最优选K＜-10至-0.001。
在不存在本发明化学化合物时，转基因DNA表达的衰退，即k(DNA)，是一个一级反应。当给培养物加入本发明化学化合物时，与对照培养物相比，转基因表达的动力学急剧变化。在化合物存在时，随着外源蛋白质的产生长期延伸，k(DNA)逐渐变得更正。的确，对于一些最优选的制剂即K＞40的制剂，这种变化太剧烈了，以致于传统的一级动力学不能充分代表该结果。因此，似乎优选化合物/制剂的动力学变成了假一级或二级反应，即一种传统知识没有预测到的结果。
本发明方法有用的许多化合物和制剂在实施例中讨论，并包括在表1、8、9和10的列表中，其中给出了X、G和K值。
本发明还提供基于SW480细胞系筛选化学试剂以确定它们是否能稳定瞬时表达的方法。待筛选的候选化学化合物是生物适合的，并含有至少一个疏水部分和至少一个酸性部分。在外源DNA第0天导入之前、过程中和/或之后，将被测化合物或化合物组导入细胞培养物如SW480细胞中，其中所述外源DNA编码的蛋白质在细胞中表达时能被检测到。如上所述，可使用各种其它类型细胞。为了监测转染步骤之后转基因的表达，以定期间隔如每天收获培养物样品，并测定样品中外源蛋白质的量。培养物中积累表达的蛋白质的量通过对每天的样品测量值求和来确定，比较被测培养物即用被测化合物接触的培养物和未与化合物接触的平行对照培养物之间的这些蛋白总和值。用于蛋白测量的培养物等分试样可在第0-4天之间、或第4-7天之间、或第4-10天之间每天收获一次，根据上面给出的公式采用这些测定的蛋白量分别计算X、G7或G14的值。如果由此测定的X、G7或G14的值大于零，则可得出结论该试剂增强瞬时表达。优选地，对于这种化合物X、G7或G14大于10，最优选大于25。由此鉴定的化学化合物可用于在上述程序中增强外源基因的瞬时表达。优选的产品制剂选自显示最高(或最正)的X或G值并表现出最有利的K因子的那些无毒化合物或化合物的组合。
进一步地，本发明的各种化学化合物可一起用于使转基因表达的增强最大化。例如，可使用各种化合物在该步骤中的不同时间处理相同培养物。不同制剂要求不同的特性组合。两种不同类型的优选制剂是A型制剂具有高X值的化合物。这些化合物在紧随转染步骤后具有高活性，因此可能在瞬时表达的第一期通过增强DNA的摄取效率起作用。因此，与对照培养物即无这些化合物的培养物相比，使用了A型化合物或制剂时从上述半对数图得到的log(DNA)0或Y截距更高。这些化合物被认为影响了DNA摄取的效率，因为Y截距是紧接着外源DNA导入细胞后细胞内活性外源DNA浓度的粗略测量值。许多被测化合物具有正的X因子值(如见表1)。因此，本发明不仅提供稳定转染DNA的化学化合物而且提供看起来可增强细胞的初始DNA摄取的化合物。许多被测化合物具有高的G7或G14值或高的正K值以及高的X值，因此在瞬时表达的两个时期内均有效(例如见表1,3,8和9)。
B型制剂在这一类中有用的化合物具有高的G和K因子。同时希望高的X值，但不是必需的。最优选的B型稳定剂具有大于25的G7或G14值，并且当K为正时，K值大于1，更优选K大于10。更进一步，在A或B型制剂中当认为特定试剂是最优选的化合物时，需要重复显示X和/或G因子大于25的实验。
对于体内和体外应用均可采用A型和B型两种制剂使瞬时表达最大化。例如，一个优选的方法涉及首先通过在转染之前将细胞暴露于一或多种X大于25的A型化合物中来预先处理细胞。在转染期间也存在A型化合物，并且最好在瞬时表达的整个期间内均保持其存在。转染步骤后，在瞬时表达的剩余期间内用一或多种优选每种G7或G14大于25的B型化合物接触细胞。在一个优选实施方案中，A型化合物是苯甲酸盐缓冲剂，B型化合物是硫酸软骨素。优选地，软骨素的分子量为20kDa或更低，更优选9kDa或更低，最优选4kDa或更低。在一个优选实施方案，A型化合物是苯甲酸和4-乙基苯甲酸，B型化合物是苯甲酸盐缓冲剂和硫酸软骨素。在另一个优选实施方案，A型制剂包括苯甲酸盐缓冲剂和谷氨酸，B型化合物是硫酸软骨素。在另一个优选实施方案，B型制剂是硫酸软骨素和硫辛酸，其具有如下分子式 对于体外应用，当转染步骤前将细胞在A型制剂存在时培养数小时，例如20-24小时，可获得最佳结果。以饮食(或口服应用)形式用A型制剂预先处理是体内应用的现实选择。已知许多对增加瞬时感染有效的化合物无毒(见下表1)。培养细胞在转染之后最好在A型化合物存在时维持至少48小时。如果希望，在约90％以上细胞摄取外源DNA之后即DNA加入培养物之后数天，可除去A型制剂，或者该制剂可保持并在瞬时表达的第二期与细胞接触。B型制剂最好在瞬时表达的最高峰时加入细胞，典型地该最高峰发生在转染后24-48小时。最佳地，实验期间内定期重复用含有B型制剂的培养基培养。
显然，本发明方法可在体内使用(即动物研究或临床操作)。特别地，在实体瘤的基因治疗中，A型制剂可与DNA递送载体共同施用，其中在施用DNA之前受体组织通过注射A型制剂“预先处理”。之后，施用B型制剂。
对于每种化合物有用的浓度范围不同，有用范围的上限可用细胞毒性作用来限制。将DNA/A型制剂直接注射至肿瘤中将只涉及常规步骤，因为多种药物载体是本领域所熟知的。如果需要，直接注射可避免将非靶组织暴露于转染试剂。可将胆碱、脂质体制剂、或控释制剂与B型制剂联合施用以延长对转染的肿瘤细胞的局部作用。此外，在转基因DNA导入之后B型制剂可作为食物补剂(或添加物)给患者长期服用。根据各种因素例如毒性等，可联合注射和食物服用以获得最佳效果。该方法具有向肿瘤递送高剂量细胞毒性蛋白而不损害其它机体组织的优点。采用该策略，可诱导肿瘤细胞本身在数天内持续产生细胞毒性蛋白，从而提供比给肿瘤简单注射该剂量蛋白远为有效的递送方法。当外部应用的所述蛋白无法轻易通过质膜或该蛋白的细胞内半衰期较短时，该方法尤为有用。
在本发明的其它实施方案中，选自组Ⅰ的化合物可与选自组Ⅱ的化合物如硫酸软骨素共价或非共价连接。
实施例1瞬时表达增强的筛选方法对照转染程序下列程序用于提供瞬时表达将SW480 P3(ATCC # CCL228)人结肠癌细胞(典型地，1×106细胞)接种在6孔组织培养板的孔中。接种的孔数与将要进行实验的转染后的天数相一致。每孔含有来自30ml储存液的1ml完全培养基，该储存液含有26.4ml RPMI组织培养基，4mM L-谷氨酰胺，3.0ml胎牛血清，和10ug/ml庆大霉素。接种后细胞在37℃含有10％CO2的CO2培养箱中培养24小时，此期间细胞附着在培养板上。
24小时预孵育步骤之后，通过除去RPMI和添加900ul OPTI-MEM_(Gibco)培养基来进行转染，该培养基含有2ug表达巨细胞病毒启动子控制下的细菌β-半乳糖苷酶的VR1412 DNA(Vical,Inc.,San Diego，CA)和8ug阳离子脂混合物(按等摩尔比混合的二油酰磷脂酰乙醇胺和1,2-二肉豆蔻氧基丙基-3-二甲基-羟乙基溴化铵(如，＂DMRIE/DOPE＂))，其中脂与DNA的摩尔比为0.99∶1。应注意，典型的瞬时转染程序使用10ugDNA/106细胞，但本文所描述的方法使用更少的DNA以降低细胞毒性。然后，在37℃孵育平板4小时。
4小时孵育步骤后，每孔加入100ul热灭活胎牛血清(以终止转染)和12.0ul 50mg/ml庆大霉素。外源DNA加入孔中之后24小时，将一个孔中的所有细胞用胰蛋白酶消化并记数，然后每孔裂解2×104细胞并储存在液氮中，用于以后测量β-半乳糖苷酶浓度。此时，每个未收获的孔加入上述OPTI-MEM培养基(无L-谷氨酰胺)。在之后的实验中，每隔24小时再收获一个孔，并将未收获的孔每48小时加入1ml OPTI-MEM(无L-谷氨酰胺并含有测试化合物)。测试化合物的程序为了测试各种化合物增强瞬时表达的效力，修改上述用于对照培养物的程序，在培养基中加入候选化学化合物。程序的其余部分与用于对照培养物的程序相同。
每天保留2×104细胞的裂解样品，用于β-半乳糖苷酶分析，并丢弃每孔的剩余细胞。将裂解液冷冻保存在液氮中，直到可进行β-半乳糖苷酶分析。采用基于氯酚红的氯酚红程序分析解冻样品的β-半乳糖苷酶，其中用紫外光/可见光分光光度计在580nm处定量测定有色产物。
大量化学化合物的分析结果见下表1。表1给出实验中测定的X值，实验中培养的SW480人结肠癌细胞采用实施例中所述方法培养并转染细菌β-半乳糖苷酶基因。表1中，标有星号的G因子表示G7的值，其它G值是G14的值。
为了比较，表1包括了在分析中测定为负值的化合物和大量测定为正值的化合物。表1所示pH值是在水溶液中测定的，所述水溶液是通过用去离子水稀释培养基制备的储存液来产生的。观察到从pH3(谷光甘肽)至pH10(肾上腺素)的化合物对延长瞬时表达持续时间有效。优选的pH范围是约pH4.5-10.5。
对于此系列实验，如果计算的X,G或K值任意一个大于零，则认为实验结果是阳性的。
表1
表1(续)
请注意，表1中X＞1的化合物是在转染后头几天内增加瞬时表达程度的化合物。这些化合物可影响细胞摄取使它们摄取更多数量的DNA/细胞，或者可促使比无这些化合物时更高比率的转染细胞表达外源DNA。还可能这些化合物增强早期转录或表达。这些化合物以前还未报道过对转染具有这些影响。有趣的是，注意到黑素显著抑制瞬时表达。
除表1所列的化合物之外，还测定发现能延长瞬时表达的其它化合物包括叔丁基苯甲酸、乙氧基苯甲酸、异丙基苯甲酸、甲氧基苯甲酸、异丁基苯甲酸、硫酸软骨素和半乳甘露聚糖，尤其是羟丙基半乳甘露聚糖。
实施例2化学化合物增强瞬时表达并降低葡萄糖消耗进行其它实验以进一步分析增强瞬时表达的方法。对于这些实验，用实施例1所述瞬时表达程序测定表2所述的5个培养条件。使用6孔培养板接种足够数量孔的SW480细胞，以便每孔的细胞可按如下所述收获。这些实验采用平均分子量为4 kDa的A型硫酸软骨素(Biorelease公司，Manchester,N.H.,No.409-4k)。
表2
每天收获一孔以记数，并裂解每个收获孔的2×104细胞，裂解物保留用于β-半乳糖苷酶分析。同样这些孔的上清液冷冻保存，用于之后评价pH、葡萄糖消耗、以及乳糖和氨的产生。如下表3所示，培养板2、3和4中所用的各种化学化合物组合在增强和维持基因表达的能力上不同。在该实验中培养板4的总体表现最好，具有高X和G因子。该实验中包括组Ⅱ化合物的仅有的培养板3清楚地显示出转染效率的降低迹象(即低X因子)，但显示维持表达的前景(即相对高的G因子)。
表3
典型地，细胞培养实验显示20％范围的标准差。事实上，本领域已知通常转染效率即使在相同实验的不同培养皿间也不同(例如见Simoni和Gromoll,J Endocrinol.Invest.,19:359-364(1996))，因此此处观察到的变异并不奇怪。因此，小于25的X和G因子并不认为比对照显著提高。
值得注意的是，硫酸软骨素-一种聚阴离子碳水化合物-的存在允许转染顺利地进行，它还导致基因表达的实质性改善。其它实验观察到如果在转染步骤之前或过程中与细胞接触，则聚阴离子碳水化合物具有阻断转染进程的倾向。在转染之前或过程中使用时显示这种阻断作用的聚合物包括硫酸皮肤素、硫酸乙酰肝素、肝素(见实施例4)、羧甲基纤维素和N-羧甲基脱乙酰壳多糖N,S-硫酸盐。然而，当在转染步骤之后而不是过程中加入时，肝素对增强瞬时表达有效；同样，其它聚阴离子碳水化合物以约4kDa分子量范围在转染后加入时也可期望增强瞬时表达。
在上述实验规划中，包括一个对照实验(培养板1A和1B，表3)以确定培养基中存在的抗生素庆大霉素是否对上述实验结果产生影响。比较对照培养板#1A和1B的结果，很明显庆大霉素或多或少抑制了蛋白的产生。与没有庆大霉素的对照培养板1B相比，有庆大霉素的对照即培养板1A中X和G因子的值稍低，由此得出上述结论。而且，β-半乳糖苷酶分析结果支持该结论。
在同样这些细胞样品中分析了葡萄糖消耗和乳酸产生及氨的产生。根据Kodak提供的临床实验室测定血清葡萄糖和乳酸水平常用的标准程序，使用Kodak Ektachem DT60Ⅱ分析仪测定葡萄糖和乳酸。该分析通过将10ul每个测试样品加入膜覆盖的塑料载片上的孔中进行，该孔中含有测定葡萄糖或乳酸必需的所有试剂(Ektachem DT载片(GLU)或Ektachem DT载片(LAC))。测定葡萄糖时，该分析基于葡萄糖氧化酶可催化分子氧与葡萄糖的反应，然后第二个反应产生红色染料，该染料的强度与样品中葡萄糖的量成比例。同样，测定乳酸的载片提供能产生红色染料的酶和底物，红色染料的量与施加到载片上的乳酸的量成比例。将载片放在Ektachem DT60Ⅱ分析仪上，该红色通过反射率分光光度法测量。同样，氨分析采用Ektachem DT载片(NH3)进行，这是基于氨与溴酚蓝反应可产生被该相同仪器检测的蓝色染料。
葡萄糖和乳酸浓度随时间变化的测量结果见表4。令人惊奇的是，表4表明含庆大霉素的对照(培养板1A)比任何也含有庆大霉素实验样品消耗更多的葡萄糖并产生更多的乳酸(注意，没有庆大霉素的对照即培养板1B不包括在表4中)。表4的数据清楚的表明相对于对照，接受了表2所述化学化合物的细胞在代谢上产生了深刻的转变，该转变与外源基因的高表达水平相对应。
除了表4中的数据外，还观察到苯甲酸和4-乙基苯甲酸的组合导致葡萄糖消耗降低。在此，进行如下实验在转染步骤之前和过程中首先给SW480细胞应用A型制剂，在DNA导入细胞之后一天加入一种B型制剂。A型制剂由含有1mM苯甲酸、1mM 4-乙基苯甲酸盐和4mM L-谷氨酰胺的OPTI-MEM组成，B型制剂含有这些相同成分，此外还含有0.1mM的硫酸软骨素。在整个实验过程中还存在庆大霉素。在本实验中，在6孔培养板中于转染之后培养了14天或在生物反应器中于转染之后培养了32天的细胞观察到基本上没有葡萄糖的消耗，在此期间细胞持续从转染DNA表达蛋白。
表4
以前已报道了，当施用于培养的肝细胞时，组Ⅰ化合物丁酸盐可补偿葡萄糖饥饿对翻译后糖基化的影响，极有可能增加细胞内葡萄糖库(Morrow等，Biochem.Biophys.Res.Comm.112:115-125(1983))。然而，Morrow等没有分析培养物中的葡萄糖消耗，因此未观察到本文所注意到的组Ⅰ化合物存在时代谢的转变。观察到的葡萄糖代谢的转变是本发明极重要的特征。它不仅与化学化合物对基因治疗方法有关效率的增强相关(本实施例充分说明该点)，而且提示这些相同化学化合物选择性和无毒性地改变细胞代谢途径的能力可应用于广泛的治疗，包括例如在治疗肥胖时调节脂肪/脂代谢。
实施例3生物反应器中增强瞬时表达在Genespan原型孵育设备的高效空心纤维灌流原型生物反应器装置(以下称为＂HPBr＂装置)中进行4个基于脂转染的基因转染系列实验。该装置主要包括两套空心纤维通过的无菌室。通过一套纤维持续循环培养基，而细胞生长所必需的气体(如氧气和二氧化碳)通过第二套纤维通入。这些纤维由多孔材料组成，气体和营养成分可从中沿着一个方向通过，而室内生长细胞产生的废物分子可沿另一方向通过。在该装置中生长的细胞保持悬浮状态，或可与两套空心纤维的外表面贴附。
HPBr装置的一个有用特征是细胞可通过转动管道通过的小室来搅动。当小室沿着其长轴向一个方向转动120度，然后向另一个方向转动120度时，构成一个转动“循环”。作为替代，培养物可在“静止”状态生长，无需转动。
采用HPBr装置进行一系列SW480细胞的实验。每个实验包括一个平行对照，对照中细胞接种在传统6孔培养板中，并置于传统的10％CO2孵育箱中。采用实施例1中对照培养板所用方法培养和转染对照6孔培养板，而生物反应器装置采用下列实验程序。HPBr装置实验采用实施例1所述用于6孔培养板的类似程序在HPBr装置中进行4个β-半乳糖苷酶报告基因转染实验，只是各种试剂的体积需按比例调整以适合生物反应器中更大的体积和更多的细胞。由于HPBr特有的细胞培养灌流模型(即连续饲养)，所以没有必要手工定期饲养。
生物反应器实验的程序与实施例1所述程序在下列方面不同。将充足的Cytodex_1微载体(即由交联葡聚糖构成的微球，其用于细胞附着的表面具有带正电荷的季铵功能基团；Sigma,St.Louis,MO)在磷酸缓冲盐水中预先溶胀，并导入HPBr侧口中。每10个细胞使用约一个微载体珠。在实验开始时，给该装置共注射1×107活SW480细胞和1×106微载体珠。在细胞接种至该装置时存在表5所述的培养基。表5列出了本研究中用的转动参数(＂cpm,＂当于cycles per minute循环/分钟)。给每个生物反应器加入839ml的培养基。在第2、3和4轮实验(“轮”是指不同的实验)的OPTI-MEM培养基中含有0.1mM硫酸软骨素(BioreleaseNo.409-4k)。在转染步骤之后，更换再循环的OPTI-MEM培养基(即管道中的培养基)，但含有细胞的区室(毛细管外空间)中的培养基不更换。更换的培养基包括表5所列的化合物。在细胞接种至生物反应器后24小时向毛细管外空间加入含有外源DNA的脂质体。与管道内的体积(839ml)相比，该空间的体积较小(17ml)。
表5
每天从每个生物反应器的细胞区室取出细胞和上清样品(约1.5ml)，并加入同样体积的新鲜培养基以替换之。测定细胞的数目和存活性，裂解2×104活细胞，并用于按实施例1所述分光光度法进行β-半乳糖苷酶测定。
表6的数据比较了4个灌流装置实验(#2-5轮)和培养板对照(#1轮)的结果。在表6中，标有“曲线下区域”的栏目是指在本实验两星期持续时间内每天收获的等量细胞产生的β-半乳糖苷酶量的时间函数图中曲线下方的面积。因此，“曲线下区域”栏中的值以任意单位如cm2表示，并且反映了该实验持续时间内每个细胞产生的β-半乳糖苷酶的总量。表6最后一栏显示每一轮即每一个细胞培养板或生物反应器在第13天的所有活细胞中存在的β-半乳糖苷酶的总量。
很明显，灌流生物反应器可用于放大的基因转染和收获转染细胞，这对于治疗应用是有利的(如对于产生大量稳定或瞬时表达外源基因的T淋巴细胞和造血干细胞，如用于体细胞治疗)。该系统也可用作人造器官以便可容易地和实际地研究外源基因的长期表达；在某种意义上，这等同于进行体内完整器官的活组织检查。
表6在培养板和HBPr装置中2周产生的β-半乳糖苷酶
表6中的数据显示，操作生物反应器的转动参数提供了使用该装置增强转染效率并保持瞬时表达的方法。
如上所述，可导入微球至小室内以提供细胞粘附位点。例如，已观察到当永生小鼠黑素瘤细胞(即ATCC #B16-F0)导入存在微球的小室时，该微球充当积累大细胞团的“种子”。进一步观察到这些细胞团可被转染，而且之后这些团中的细胞瞬时表达转染DNA。通过对小室内的培养基取样可很容易地从这些培养物得到样品。该取样可通过将注射器的新鲜培养基液流射向该细胞团，导致足够取样的许多细胞在培养基变成悬浮状态来实现。该细胞团类似实体瘤，并提供模式系统用于开发有效向体内肿瘤递送治疗蛋白的治疗方法。
采用对生物反应器中生长的细胞团有效的相同程序，给小鼠皮下注射黑素瘤细胞，使其在注射位点发展成肿瘤，然后将含有β-半乳糖苷酶载体DNA的脂质体直接导入该肿瘤以实现β-半乳糖苷酶的瞬时表达。对β-半乳糖苷酶表达有效的方法期望对其它蛋白质也有效，可进行类似实验评价向体内实体细胞团直接递送各种蛋白质如编码治疗蛋白的DNA的效果。
本发明方法所用的生物反应器系统对产生大量经遗传修饰表达外源蛋白质的细胞是有用的。为了治疗，可将这些细胞给患者施用，此后只在治疗计划规定时间内保持活性状态。因此，本发明提供独特形式的基因治疗方法，其中导入的基因可简单通过限制其接触稳定化物质来关闭，即施用瞬时表达治疗蛋白的细胞然后仅在希望转基因持续表达的时间里施用增强化合物。
最后，应当注意，硫酸软骨素的使用很重要，因为尽管转动速度相对较高，它也能使贴壁依赖细胞很好地贴附微载体。此结果表明，组Ⅱ化合物加入培养基时可有效提供培养细胞对固体基质的贴壁。
实施例4细胞毒性分析按照实施例1所述程序在6孔培养板中测试大量化合物以测定其在SW480细胞中的细胞毒性与促进外源基因摄取和表达的能力之间的关系。除非特别注明，除对照之外，所有培养板均含有4mM L-谷氨酰胺以及抑制细菌生长的庆大霉素。
细胞毒性分析按如下进行。第0天在待测细胞毒性的化学化合物存在时将SW480细胞(约1×106细胞/孔)接种在含1ml RPMI的6孔培养皿中。在孔中接种后24小时，除去RPMI培养基，并按实施例1所述将含有外源DNA的脂质体于1ml OPTI-MEM培养基中加至培养物。转染培养基还含有待测细胞毒性的化学化合物。还包括与实验培养板相同的对照培养板，只是其培养基中不存在被测化合物。实验和对照培养物在“静止”状态下生长，也就是说，培养板不进行摇动、转动或其它搅拌。每天从一个实验孔和一个对照孔收获细胞并用台盼蓝染色测定活性，共进行8天。在暴露于脂质体DNA的对照培养物中，转染后头4天细胞数保持相当恒定或仅仅轻微增加，然后到第8天结束时增加至约1×107/孔。在头4天当中对照培养物生长迟滞推测是由于脂质体DNA本身的轻微细胞毒性作用引起的。如果在外源DNA导入后4天内观察到活细胞数降低＞50％，而且第8天结束时没有细胞净扩大，则认为处于实验浓度的被测化合物具有细胞毒性。这里使用的硫酸软骨素与实施例2中的相同。
通过应用该测试程序，在许多情况下可能操作单个化合物或化合物制剂的浓度达到SW480细胞良好耐受而又能增强这些细胞中瞬时表达水平的浓度。对其它类型细胞也已测定了其耐受本发明一些化学化合物的能力。例如，测定了人黑素瘤细胞、鼠黑素瘤细胞和COS-7细胞(ATCC CRL1651)耐受在表9中应用于培养板#6的制剂的能力。这些细胞在对被测化合物的敏感性上多少不同，但鉴定了一组所有这些细胞类型均能耐受的浓度，也就是说，根据上述分析在这些浓度下化合物没有细胞毒性。
发现所有增强瞬时表达的磺酸化氨基多糖均能支持正常细胞生长，也就是说，它们在增强瞬时表达的浓度时毒性并不太大以致细胞能够耐受。暴露于表7中各种化合物和制剂的细胞的细胞生长和细胞毒性曲线见图1和2，其中描述各图的数字相应于表7中的培养板数。表7说明多糖肝素(约6 kDa；Sigma)在转染过程中存在时阻断瞬时表达，但硫酸软骨素(Biorelease，A型)在同样条件下增强瞬时表达。肝素介导的基因表达抑制可能是由于在肝素和脂质体的阳离子脂之间形成了复合物，从而使DNA没有载体递送其进入细胞。然而，在其它实验中观察到在转染步骤之后加入细胞时肝素增强瞬时表达。羟丙基半乳甘露聚糖也观察到在一定程度上增强瞬时表达，尽管不如硫酸软骨素那样有效(见实施例10)。
表7
含有丁酸盐缓冲剂的培养板表达转染的基因，但是，在本组实验采用的实验条件下该缓冲剂对SW480细胞有细胞毒性。
实施例5用星形聚合物转染本组实验说明本发明方法增强瞬时表达的作用是否依赖于DNA递送至细胞的方法的问题。采用类似实施例1中的方法使用两种不同的化学化合物组合(见表8)转染SW480细胞，只是这里DNA在树状聚合物存在时导入细胞而不是使用脂质体递送。这些树状聚合物是显微合成聚合小球(最先由Dow Chemicals商业化为用于定制大小的“星形”聚合小球标准)，它能通过化学方法衍生而起阳离子脂的作用。本发明中使用的树状聚合物由F.C.Szoka,Jr.(药学/药物化学系，加州大学，SanFrancisco,CA)提供。虽然脂转染或树状聚合物介导的方法进行基因递送的详细机制尚不清楚，基于物理化学特性如它们的形状和化学部分的分布，它们极有可能十分不同。
使用的方法在如下步骤中与实施例1的不同。将14ug DNA用397ul去离子水稀释，56ug树状聚合物用393ul去离子水稀释。使用前不超过1小时，混合DNA溶液和树状聚合物悬液。向每孔加入OPTI-MEM(733ul)和DNA/树状聚合物混合物(167ul)，用手摇动6孔培养板以确保彻底混匀。孵育5后小时，除去含有DNA/树状聚合物的培养基并加入1.0ml培养基。该程序的其余步骤见实施例1所述。
如表8所示，当使用树状聚合物作为向细胞递送DNA的方法时，被测化合物是有效的。用于这些实验的硫酸软骨素与实施例2相同。这些发现强有力地说明表8所示的化学化合物制剂在DNA进入细胞后发挥作用，因此不论采用何种方法导入DNA均有效。
表8
实施例6瞬时表达期间的蛋白生产以下实验说明本瞬时表达系统可用于根据前述实施例所述方法快速大量生产由导入受体细胞的外源基因表达的蛋白产物。
进行15个培养板实验，其中向SW480细胞的培养基中加入表9所示的化学化合物，所述细胞在6孔培养板中按详细描述于实施例1的方法转染。计算X、G14和K因子，以及2×104细胞14天产生的蛋白累积量，结果显示于表9的最后一栏。表9所示数据说明在所有列出的组合物存在时产生的蛋白量均优于对照。用于这些实验的硫酸软骨素同实施例2。按照它们的效用排列，最有效的制剂是在培养板6、3、13和14中使用的制剂。在同时接受A型和B型制剂的培养板中可观察到更好的结果，因此这些组合物对于动物测试尤为有用，例如使用毒性蛋白治疗肿瘤、给特定组织递送激素、或其它可能需要递送生物活性蛋白的病理情况。在其它实验中，观察到，当与硫酸软骨素联合使用时(正如培养板6或13)，α-硫辛酸可作为苯甲酸盐缓冲剂的替代物产生相似的结果。
表9
注所有培养板中的培养基均包括庆大霉素，并且除了对照外还含有4mML-谷氨酰胺。
这些实验还说明增强的瞬时表达可用于非常快速的生产毫克级蛋白，而无需先建立外源基因已稳定整合的细胞系。因此，增强的瞬时表达提供了一种有效表达足量候选生物药物的新方法，以便对该药物进行回收和快速筛选药物活性。因此，本发明提供实现加速药物开发项目的方法。例如培养板6，每2×104细胞在14天内可产生约26ng的β-半乳糖苷酶(见表9)。按比例扩大至含约2×106细胞的常规培养，采用该制剂产生的蛋白积累量将为约2.6mg。在实施例2应用的HPBr装置中，常规生长有109细胞，因此在该培养物中几天内可获得几十毫克或甚至数百毫克新的或感兴趣的蛋白。
实施例7肝细胞的瞬时表达来源于猪胚胎细胞(外胚层阶段)的全能(干细胞样)克隆非转化细胞系(PICM-19 3BT细胞；之后称为“PICM-19细胞”)从Dr.N.Talbots(U.S.D.A.,Beltsville,MA)处获得。这些细胞的行为类似肝干细胞，当在5％或更少的CO2存在下培养时数月内其表现出自我再生的性质。在更高的CO2水平(例如达到约10％)，这些细胞开始分化。已从分化的PICM-19细胞中分离出至少两种不同的分化细胞表型，即成熟的肝细胞和产生胆汁的可塑性肝细胞。已诱导分化的PICM-19细胞可用作检测原代肝细胞(与其极为类似的一种细胞类型)转染特征的一种手段。在以原代猪肝培养物进行的早期实验中获得的结果印证了SW480细胞的上述结果。因为原代肝细胞培养物含有肝细胞以外的细胞类型，所以用提供肝细胞样细胞相同来源的PICM-19细胞重复这些实验。
使用的操作程序与用于转染SW480细胞的实施例1所述程序一致，每孔使用1×107细胞，只是PICM-19细胞接种在丝裂霉素C-失活的STO鼠成纤维饲养细胞(CRL1503)层上，因为正常情况下无这种饲养细胞存在时PICM-19细胞不能生长。在脂质体制备中，DNA/脂质与细胞的比例同实施例1。整个这些实验中孵育箱维持10％CO2。PICM-19细胞增殖并在该培养条件下分化成成熟肝细胞。为确保分化完全，培养物在转染步骤前在10％CO2中维持3周。
表10描述了以这些细胞进行的转染研究中使用的培养基，以及这些培养物中测定的X、G7和K因子。用于这些实验的硫酸软骨素同实施例2。表10所示结果与以SW480获得的发现一致，并且当在相同条件下转染成年猪肝原代分离物时也观察到这些结果。
令人惊奇的是，还观察到，缺乏饲养细胞的培养板能支持分化的PICM-19细胞至少4周。正如图3所示，这些细胞还表达转染DNA，虽然相对于其它测试培养板效率降低。该结果十分令人吃惊，因为在不含饲养细胞层或加入细胞前培养板未应用蛋白质包被(例如胶原)的情况下，肝细胞在培养基中生长或维持超过几天的报道从未有过。引人注意的是，培养板4中的细胞与在含有饲养细胞的培养板中的细胞一样贴壁，说明硫酸软骨素为细胞的生长和维持创造了类似体内的条件。因此，这些实验首次说明硫酸软骨素可用于在无饲养细胞的低价培养基组分中培养肝细胞并维持其类似于所观察到的体内肝细胞的表型。
表10
实施例8从生长在生物反应器中的转染细胞内回收转基因mRNA和DNA在32天的实验中使用实施例3所述高效生物反应器装置(HPBr)，其中按实施例3和表5所述转染并增殖SW480。除非以下特别描述，所用条件和分析与实施例3所述相同。实验开始时，将从组织培养瓶中新鲜收获的1×107个SW480细胞注射至HPBr装置，同时加入1×106个预溶胀微球。然后在含有1mm苯甲酸和1mm 4-乙基苯甲酸(一种A型制剂)的培养基中不转动地培养细胞24小时。24小时后，加入编码β-半乳糖苷酶的质粒DNA，并以30 cpm的速度转动该生物反应器4小时。然后用含有1mm苯甲酸、1mm 4-乙基苯甲酸和0.1mM硫酸软骨素(Biorelease Corp.No.409-4k)的饲养培养基冲洗3次，将含有DNA的培养基从生物反应器的毛细管外空间(ECS)中除去。该后一种试剂组合是B型制剂。之后，用于循环生物反应器的1升培养基更换为1升含有同样B型制剂的饲养培养基。在以后的实验中，循环生物反应器的培养基每7天以1升新鲜的含有B型制剂的饲养培养基更换。DNA除去后该装置不再转动以便细胞能形成肿瘤样实体块。
从DNA从生物反应器中除去后24小时开始，每天从ECS取出等量的细胞和培养物上清，持续32天。通过用培养基流冲打细胞块以分离出一些细胞然后回收少量所获细胞悬液的方法进行细胞取样。通过瞬时离心分离每个样品的细胞和培养基。每天等量样品中取2×104细胞用于β-半乳糖苷酶的分析，每个上清用于其代谢信号的分析，即葡萄糖、乳酸和氨的浓度。在第32天收集了每天样品后，通过胰蛋白酶消化从ECS中收获剩余细胞，并且取2.8×105个收获细胞用于RNA和DNA的提取。
按实施例3所述方法分析每天细胞样品中的β-半乳糖苷酶，这些分析的结果见图4。图4显示了β-半乳糖苷酶表达峰出现于第4天，并且直到约第12天基本上一直保持不变，之后的值不大恒定但仍保持相对高水平。最后的数据点，相应于该实验结束时通过胰蛋白酶消化收集的细胞，在图4中以正方形标记显示，并且该值是峰值的大约60％。因此，在整个32天期间该培养物中产生了相对高水平的β-半乳糖苷酶。
使用实施例2所述程序测定上清中的葡萄糖、乳酸和氨的浓度，这些测定的结果见图5A-5C。从图5A和5B可见葡萄糖和乳酸浓度在整个实验过程中均无显著变化(考虑到这些样品中存在的乳酸量低并且在第7天后测定的量相对恒定，因此并不认为乳酸的波动是显著的)。相反，到培养基更换间的每7天时期结束时，在每次提供新鲜培养基氨浓度值落回基值之前，氨浓度增加2倍以上。每次培养基更换后氨的这种重复累积充分支持这个想法，即暴露于转染稳定化化合物会使细胞改变其代谢，从使用葡萄糖(糖酵解)转变为使用蛋白或氨基酸作为主要碳源(三羧酸循环)。如果该实验中细胞使用葡萄糖作为其主要能量来源，则在每7天的期间中增加的是乳酸而非氨的浓度(注意，图5B提示在第一个7天的期间中可能发生了一些糖酵解)。
氨是氨基酸代谢物进入三羧酸循环的早期步骤脱氨基反应的副产品。因此，在培养基中氨积累的最可能解释是细胞在暴露于用于稳定瞬时表达的化合物的过程中使用氨基酸或可能是肽或蛋白作为其能量来源。例如这些氨基酸可能来源于培养基中存在的肽。这些肽可能是在培养基的血清热灭活过程中血清蛋白的热诱导分解产生的。
瞬时表达稳定化化合物引起细胞从使用葡萄糖作为能源转变成使用氨基酸作为能源的能力是其用途的重要暗示。例如氨基酸代谢的三羧酸循环在脂肪和脂质代谢中同样十分重要。因此，用瞬时表达诱导化合物处理细胞或人对象也可通过激活三羧酸循环导致脂肪和脂质代谢的增加。因此，该化合物可用作例如控制体重的试剂。这些结果也说明图5A-5C中特有的代谢信号与增强和稳定转染基因瞬时表达的生理状态间相关。
为制备核酸，离心沉淀在32天孵育期结束时收获的2.8×105胰蛋白酶消化细胞，用5ml无钙无镁PBS洗涤，在室温下与1ml TRIZOLTM(LifeTechnologies)混合。然后将悬浮于TRIZOLTM中的细胞在4℃孵育10分钟。在此，将样品冻存于-70℃。解冻后，样品置于室温20分钟，然后加入200ul氯仿，剧烈混合15秒，室温孵育5-20分钟。然后，在4℃以2,000×g离心样品以将该乳浊液分为两相。
为分离RNA，仔细收集上层水相不要包含任何中间相，转移至另一管中以沉淀RNA，取0.5ml异丙醇与该液相混合，该管在室温孵育10-20分钟，然后4℃以12,000×g离心收集RNA沉淀。用1ml 70％(v/v)的乙醇仔细洗涤该沉淀，室温空气干燥5-10分钟，重悬于30ul无RNA酶的水(Five Prime Three Prime)中。
为分离DNA，收集上述下相有机层，与300ul 100％的乙醇颠倒混合，然后置于室温2-3分钟沉淀DNA。在4℃以2,000×g离心5分钟收集DNA沉淀，然后用含有0.1mM的柠檬酸钠的10％乙醇洗涤两次。第二次洗涤后，4℃2,000×g离心5分钟再次收集DNA沉淀，并室温重悬于70％的乙醇洗涤10-20分钟。离心再次收集沉淀，简单干燥，于8mM氢氧化钠中重悬和溶解。
为检测β-半乳糖苷酶序列的存在，于260nm读取吸光值以确定RNA浓度，然后用无RNA酶的水稀释RNA溶液至终浓度100ug/ml。然后取50ul稀释的RNA溶液与150ul 50∶50的37％甲醛和20×SSC溶液混合。将样品加热至55-60℃ 20分钟以变性靶核酸，置于冰上，再加入200ul无RNA酶的水。振荡样品并瞬时离心以沉淀不溶物，在轻度真空状态下上样至狭缝印迹装置的孔中以收集RNA至GeneScreen PlusTM膜(NewEngland Nuclear)。用50ul 10×SSC洗涤孔，并将该膜暴露于紫外光下以使RNA与膜交连，然后在约90℃干烤1小时除去甲醛。用相同程序对DNA样品作狭逢印迹，只是不使用真空。
通过与转染所用质粒中存在的β-半乳糖苷酶基因的一部分相应的32p标记的寡核苷酸杂交，测定狭缝印迹膜上β-半乳糖苷酶基因mRNA或DNA的存在。该寡核苷酸的核苷酸序列是5′CTCCAACGCAGCACCATCAC 3′(SEQ ID NO:1)。为了杂交，取10ml杂交缓冲液(1ml 50×Denhardt′s溶液，10ul 10mg/ml聚腺苷酸，12.5ml 20×SSC,5ml 10％十二烷基硫酸钠，和2.5ml 0.5M NaPO4(pH6.5)，终体积50ml)放入含有狭缝杂交膜和1×106记数/ml32P标记探针的塑料袋中。将袋密封，在52-53℃孵育过夜。杂交之后用含有5×SSC和0.1％十二烷基硫酸钠的缓冲液在室温洗膜5-10分钟，共两次，然后再用相同缓冲液在52-53℃洗膜2次，每次20-30分钟，然后用X光片曝光。
在获得的放射自显影片上，显示的信号表明在转染后32天收获的细胞中存在含有β-半乳糖苷酶基因的转染DNA。因此，很明显该DNA在整个32天实验期间保持相对高的量。同样，用β-半乳糖苷酶探针杂交后RNA狭缝印迹的放射自显影显示惊人的强信号。在无数以前的实验中，显示出在从培养基中除去诱导化合物之后2-3天内细胞中β-半乳糖苷酶的产生降低并消失。因此，很明显本实验中观察到的可检测β-半乳糖苷酶DNA和mRNA的保持不是由于整合了外源DNA的细胞的生长造成的。而且，mRNA的典型半衰期仅约1-3天，因此32天孵育期间结束时β-半乳糖苷酶mRNA的存在提示该mRNA是最近转录的，这样转染外源DNA必定保持在整个32天实验期间存在。
32天孵育之后检测到β-半乳糖苷酶DNA提示在该期间外源DNA复制和数量增加的可能性。因为在实验过程中细胞持续生长和分裂，人们会预期在第0天加入的质粒DNA已被稀释，因此32天后分析的细胞将含有极少的β-半乳糖苷酶DNA。因此，令人吃惊地存在容易检测数量的β-半乳糖苷酶mRNA和DNA，提示转染DNA可能已在实验过程中复制，这可能在线粒体内进行。
实施例9在用瞬时表达稳定化化合物处理的细胞中碱性磷酸酶的诱导下列实验的结果指出，除了诱导三羧酸循环外，按实施例8所述处理的细胞的代谢信号还包括正常情况下在培养基中几乎不能从SW480细胞检测到的内源性磷酸酶活性的诱导。将细胞在塑料组织培养皿中生长，并使用实施例8所述相同培养基转染和增殖。每天加入几毫升饲养培养基饲养细胞。从转染后第一天开始，每天从培养板收获培养基的等分试样，按实施例8所述分析这些等分试样的葡萄糖、乳酸、和氨的浓度。出人意料地，当用标准碱性磷酸酶实验分析这些相同样品的内源性磷酸酶活性时，检测到高数量的活性。与传统生长的SW480细胞相比，观察到的提高程度的范围在从约2倍到约20倍。
按如下设计测量“分泌的碱性磷酸酶活性”(SEAP)的实验。每个样品取0.5ml与2×SEAP缓冲液(1×SEAP缓冲液=1M二乙醇胺，0.50mM氯化镁，pH 9.8)混合。作为对照，同时检测牛肠粘膜碱性磷酸酶。牛碱性磷酸酶是用1×SEAP制备的。这些实验的生色底物是0.15M磷酸对硝基苯基酯，它在被碱性磷酸酶切割后产生可在405nm处检测的产物。给每个分析管中加入(100ul)底物，然后将该管置于37℃。之后，对照样品每分钟读一次吸光度，共10分钟，同时在第1和6分钟测定每个实验样品的吸光度。采用下列公式计算实验样品的磷酸酶活性单位/ml 其中A405nm=405nm处的吸光度，V=分析管中的体积，df=稀释因子，VE=加入分析管中的样品体积。
对于该组实验，V=1.1 ml,df=2.2，和VE=0.5 ml。
为测定诱导的磷酸酶活性是否热敏感，用与上述SEAP缓冲液相同但含有0.01 M L-高精氨酸的分析缓冲液对相同样品进行第二组实验。将对照酶样品(Clontech Laboratories)和培养基样品在该缓冲液中加热至65℃5-10分钟，然后加入底物。已知该加热处理破坏表达该酶的大多数哺乳动物细胞中发现的碱性磷酸酶，的确，它破坏了这些样品中的磷酸酶活性以及对照碱性磷酸酶样品中的磷酸酶活性。诱导的磷酸酶的最佳pH还未确定，因此，这些结果并不一定说明所诱导的磷酸酶是“碱性磷酸酶”。尽管还存在其它磷酸酶，在动物细胞中常见的磷酸酶包括在溶酶体中发现的酸性磷酸酶和胰腺碱性磷酸酶。
在许多实验中，在转基因产物开始从转染培养物中消失的期间开始时，培养基中检测到突发性的诱导磷酸酶活性。因此，磷酸酶活性的波峰提供涉及转基因DNA从转染细胞有效排除的细胞内事件的标志。
实施例10分子量对硫酸软骨素的有效性的影响进行下列实验以测定多糖大小对其增强瞬时表达的有效性的影响。对于这些实验，所用程序是实施例6中所述用于培养板#6(见表8)的程序，只是用下面描述的化合物替代加至培养板#6/表8的硫酸软骨素。
为了评价在应用本程序时可期望的变异性程度，在使用平均分子量为4 kDa的硫酸软骨素的4个分开的实验中对X和G14值取平均值。在所有4个实验中，进行培养板#6/表8的程序。这些比较所用的硫酸软骨素或从Biorelease获得，或通过用碱然后是酸处理大(＞20 kDa)的硫酸软骨素(A型)来制备。非购买制品的大小通过根据厂家说明(Pharmacia)使用PhastSystem凝胶与Biorelease 4 kDa硫酸软骨素进行电泳比较来确定。结果见表11，其中在4次实验中观察到的X和G14的范围显示在平均值下边的括弧内。这些数据表明所述程序是相当可重复的，因为使用两个不同硫酸软骨素制品获得了类似的结果。而且，除了一个例外(即409-4K制品的X因子)，X和G因子观察到非常窄的变化范围。假定瞬时表达结果典型地变化约20％，这些结果说明变异程度可以接受。
表11变异性
为了确定大小对多糖增强瞬时表达的能力的影响，测定了各种大小的硫酸软骨素。这组实验包括A型和C型硫酸软骨素，见表12。表12的结果清楚地显示＞20 kDa的硫酸软骨素在根据该程序使用时无效，而9kDa和4 kDa的制品均有效。表12还给出了鲎变形细胞溶解物(LAL)内毒素实验结果，表示为内毒素单位/ml(Eu/ml)，该实验在转染之前、过程中和之后但在加入血清之前对所有使用的培养基进行。该实验提供水溶液中革兰氏阴性细菌内毒素的定量测定。LAL实验是用BioWhittaker(Walkersfield，MD)的Pyrogent_03 Plus试剂盒按厂家说明书进行的。表12中LAL结果是在加入血清之前分析的转染后培养基的结果。所有用于这些实验的溶液均在超净工作台中用标准无菌程序制备。
表12
*Biorelease公司，340 Granite St.,2ndFl.,Manchester,NH 03102+Soft Gel Technologies公司，6982 Bandini Blvd.Los Angeles,CA 90040
因为表12中显示的结果提示多糖链越小产生的结果越好，所以进行了另一些实验以确定来自硫酸软骨素的单个重复单位是否对增强瞬时表达有效。如表13所示，尽管来自C型(ΔDi-6S)硫酸软骨素的二糖单位比对照给出了更好的结果，但确定来自A型的二糖单位(是主要单体)有细胞毒性，因此不适于在本程序中使用。还测定了聚甘露糖、甘露糖和2-羟丙基醚形式的半乳甘露聚糖，发现它们对增强瞬时表达有效，见表13。
表13
*Sigma,#C4045(ΔDi-45)；#C4170(ΔDi-65)**Carrington Laboratories,Irving,TX+Carbomer,Inc.,Westborough,MA总之，看起来平均分子量为4 kDa的C型硫酸软骨素对在瞬时表达第二期过程中增强转基因蛋白生产特别有效。
尽管已阐述了本发明优选实施方案，应当理解，可在其中进行各种修改而不脱离本发明的主旨和范围。
权利要求
1．在真核细胞中增强外源基因瞬时表达的方法，其包括以能在该细胞中表达的形式将编码蛋白质的外源DNA分子导入该细胞；在导入DNA之前、过程中或之后用生物适合的瞬时表达增强剂接触该细胞；导入DNA之后，在非选择性培养基中维持细胞；和在非选择性培养基中维持细胞至少4天之后，检测细胞中的外源蛋白质。
2．权利要求1的方法，其中瞬时表达增强剂包含至少一种具有如下分子式的羧酸衍生物 其中R1是CHNH2R3，其中R3是天然存在氨基酸的侧链；C6H4R4，其中R4是H,CH3,(CH2)nCH3、NH2、COCH3、CO(CH2)nCH3、C(CH3)3、CH(CH3)2、(CH2)nCH(CH3)2、(CH2)nCOCH3、OCH3或O(CH2)nCH3，其中n=1-3；CHNH2(CH2)nR5，其中n=1-7,R5是CH3、OH、CONH2、C6H4OH或CONHNH2；(CH2)nR6，其中n=1-9,R6是吲哚基、NCH3C(=NH)NH2、SCH3、NH2、CH3、CO2H、CONH2或NHC(=NH)NH2；(CH2)nCHNH2CO2H，其中n=1-8；CH(CO2H)NHCONH2；或C5H4N；而且其中R2选自H,CH3,(CH2)nCH3，其中n=1-8,(CH2)xO(CH2)yCH3或(CH2)xCO(CH2)yCH3，其中x+y=2-7，或M，其中M是金属平衡离子或低分子量有机阳离子。
3．权利要求2的方法，其中瞬时表达增强剂包含选自3-甲基-L-组氨酸、α-酮戊二酸、β-丙氨酸、肌肽、瓜氨酸、肌酸、叶酸、谷胱甘肽、马尿酸、高丝氨酸、N-(4-氨基苄基)-L-谷氨酸二乙酯、N-氨甲酰天冬氨酸、N-甲酰-L-甲硫氨酸、和鸟氨酸的氨基酸衍生物。
4．权利要求2的方法，其中R1是pH在4.5-10.5之间的非极性或疏水的。
5．权利要求1的方法，其中瞬时表达增强剂包含具有下列分子式的磺酸衍生物R7-SO2-OR8其中R7是低级烷基、芳基、取代的低级烷基、芳基、取代的低级烷基或取代的芳基；而且R8是氢、金属平衡离子或低分子量的有机阳离子。
6．权利要求5的方法，其中R7是氨基取代的低级烷基或氨基取代的芳基。
7．权利要求5的方法，其中磺酸衍生物选自3-氨基苯磺酸、牛磺酸和其盐。
8．权利要求1的方法，其中瞬时表达增强剂包含糖胺聚糖。
9．权利要求8的方法，其中糖胺聚糖是磺酸化氨基多糖。
10．权利要求9的方法，其中磺酸化氨基多糖包含N-乙酰化氨基多糖。
11．权利要求10的方法，其中N-乙酰化氨基多糖是硫酸软骨素。
12．权利要求1的方法，其中瞬时表达增强剂包含选自肾上腺素、辅酶B12和甲钴胺的化合物。
13．权利要求1的方法，其中所述试剂包含苯甲酸和4-乙基苯甲酸；或苯甲酸盐缓冲剂和硫酸软骨素；或苯甲酸盐缓冲剂和谷氨酸；或谷光甘肽、甲硫氨酸、甘氨酸、α-氨基-正丁酸、牛磺酸、苯丙氨酸、苯甲酸盐缓冲剂和丙氨酸；或4-乙基苯甲酸、苯甲酸和硫酸软骨素；或α-硫辛酸和硫酸软骨素。
14．权利要求1的方法，其中瞬时表达增强剂的浓度是1-15mM。
15．权利要求9的方法，其中瞬时表达增强剂的浓度是0.01-0.5mM。
16．权利要求11的方法，其中硫酸软骨素的平均分子量不超过9000道尔顿。
17．权利要求11的方法，其中硫酸软骨素的平均分子量不超过4000道尔顿。
18．权利要求1的方法，其中在外源DNA导入细胞之前和过程中用第一瞬时表达增强剂接触细胞，其中该试剂包含至少一种具有如下分子式的化合物 其中R1是CHNH2R3，其中R3是天然存在氨基酸的侧链；C6H4R4，其中R4是H、CH3、(CH2)nCH3、NH2、COCH3、CO(CH2)nCH3、C(CH3)3、CH(CH3)2、(CH2)nCH(CH3)2、(CH2)nCOCH3、OCH3或O(CH2)nCH3，其中n=1-3；CHNH2(CH2)nR5，其中n=1-7,R5是CH3、OH、CONH2、C6H4OH或CONHNH2；(CH2)nR6，其中n=1-9,R6是吲哚基、NCH3C(=NH)NH2、SCH3、NH2、CH3、CO2H、CONH2或NHC(=NH)NH2；(CH2)nCHNH2CO2H，其中n=1-8；CH(CO2H)NHCONH2；或C5H4N；而且其中R2选自H,CH3,(CH2)nCH3，其中n=1-8,(CH2)xO(CH2)yCH3或(CH2)xCO(CH2)yCH3，其中x+y=2-7，或M，其中M是金属平衡离子或低分子量有机阳离子；或第一瞬时表达增强剂包含具有如下分子式的化合物R7-SO2-OR8其中R7是低级烷基、芳基、取代的低级烷基、或取代的芳基；而且R8是氢、金属平衡离子或低分子量的有机阳离子；在外源DNA导入之后，用第二瞬时表达增强剂接触细胞，其中第二试剂包含磺酸化氨基多糖。
19．权利要求18的方法，其中在DNA导入细胞之后细胞进一步持续暴露于第一试剂中。
20．权利要求1的方法，其中细胞是培养细胞。
21．权利要求20的方法，其中培养细胞选自稳定转化细胞、肿瘤细胞系、杂交瘤细胞和原代培养细胞。
22．权利要求21的方法，其中培养细胞是SW480 P3细胞。
23．权利要求1的方法，其中收获外源基因编码的蛋白质。
24．权利要求1的方法，其中细胞存在于活宿主中，并且瞬时表达增强剂通过口服或注射导入宿主。
25．权利要求1的方法，其中外源DNA通过选自脂转染、病毒载体、细胞暴露于磷酸钙的共沉淀和在树状聚合物存在时转染的方法导入细胞。
26．权利要求25的方法，其中DNA通过病毒载体导入细胞，并且该病毒载体包含腺病毒。
27．权利要求1的方法，其中所述试剂含有至少一个酸性部分和至少一个pH在4.5-10.5之间时疏水的部分，而且其中酸性基团可修饰形成盐或酯。
28．权利要求27的方法，其中酸性部分在pH4.5-10.5之间时是疏水和有机的。
29．筛选含有至少一种化学化合物的试剂以确定该试剂是否能增强真核细胞中外源基因瞬时表达的方法，其中该试剂是生物适合的并含有至少一个疏水部分和至少一个酸性部分，该方法包含步骤在第0天给第一和第二SW480 P3细胞导入能在细胞中表达的编码蛋白质的外源DNA分子；在导入DNA之前、过程中或之后，用所述试剂接触第二细胞；积累测量两种细胞中第0和4天之间或第4和7天之间或第4和14天之间从外源DNA表达的蛋白质的量，并用这些量按照下列等式分别计算X、G7或G14的值 其中“A”是在第一细胞中表达的外源基因编码蛋白质的量，“C”是在第二细胞中表达的蛋白质的量；和如果X或G7或G14大于10，则确定该试剂能增强瞬时表达。
30．权利要求29的方法，其中X或G7或G14大于25。
31．增强细胞中外源基因瞬时表达的方法，包括给细胞导入能在细胞中表达的编码蛋白质的外源DNA分子；和用当根据权利要求29的分析评价试剂时X或G7或G14大于25的试剂接触细胞。
32．操作细胞代谢降低细胞葡萄糖消耗的方法，包括用诱导细胞使用蛋白质或氨基酸作为其主要能量来源的试剂接触细胞。
33．权利要求32的方法，其中所述试剂进一步诱导细胞表达内源性磷酸酶活性。
34．权利要求32的方法，其中所述试剂能增强细胞中外源基因瞬时表达，其中该试剂包含至少一种具有如下分子式的化学化合物 其中R1是CHNH2R3，其中R3是天然存在氨基酸的侧链；C6H4R4，其中R4是H、CH3、(CH2)nCH3、NH2、COCH3、CO(CH2)nCH3、C(CH3)3、CH(CH3)2、(CH2)nCH(CH3)2、(CH2)nCOCH3、OCH3或O(CH2)nCH3，其中n=1-3；CHNH2(CH2)nR5，其中n=1-7,R5是CH3、OH、CONH2、C6H4OH或CONHNH2；(CH2)nR6，其中n=1-9,R6是吲哚基、NCH3C(=NH)NH2、SCH3、NH2、CH3、CO2H、CONH2或NHC(=NH)NH2；(CH2)nCHNH2CO2H，其中n=1-8；CH(CO2H)NHCONH2；或C5H4N；而且其中R2选自H,CH3,(CH2)nCH3，其中n=1-8,(CH2)xO(CH2)yCH3或(CH2)xCO(CH2)yCH3，其中x+y=2-7，或M，其中M是金属平衡离子或低分子量有机阳离子；或组成如下分子式的磺酸衍生物的基团R7-SO2-OR8其中R7是低级烷基、芳基、取代的低级烷基、或取代的芳基；而且R8是氢、金属平衡离子或低分子量的有机阳离子；或一种磺酸化氨基多糖。
35．权利要求34的方法，其中所述试剂包含选自苯甲酸、4-乙基苯甲酸、苯甲酸盐缓冲剂和硫酸软骨素的化合物。
36．权利要求34的方法，其中将试剂体内施用给哺乳动物。
37．增强细胞贴附培养基质的方法，其中向培养细胞的培养基中加入一种磺酸化氨基多糖。
38．权利要求37的方法，其中细胞是为了在培养时生长正常情况下需要饲养层的细胞。
39．权利要求37的方法，其中细胞是肝细胞，并且磺酸化氨基多糖是硫酸软骨素。
40．增强真核细胞中外源基因瞬时表达的方法，其包括以能在该细胞中表达的形式将编码蛋白质的外源DNA分子导入该细胞；在外源DNA导入细胞过程中用第一试剂接触该细胞，其中第一试剂包含至少一种具有如下分子式的化合物 其中R1是CHNH2R3，其中R3是天然存在氨基酸的侧链；C6H4R4，其中R4是H、CH3、(CH2)nCH3、NH2、COCH3、CO(CH2)nCH3、C(CH3)3、CH(CH3)2、(CH2)nCH(CH3)2、(CH2)nCOCH3、OCH3或O(CH2)nCH3，其中n=1-3；CHNH2(CH2)nR5，其中n=1-7,R5是CH3、OH、CONH2、C6H4OH或CONHNH2；(CH2)nR6，其中n=1-9,R6是吲哚基、NCH3C(=NH)NH2、SCH3、NH2、CH3、CO2H、CONH2或NHC(=NH)NH2；(CH2)nCHNH2CO2H，其中n=1-8；CH(CO2H)NHCOMH2；或C5H4N；而且其中R2选自H,CH3,(CH2)nCH3，其中n=1-8,(CH2)xO(CH2)yCH3或(CH2)xCO(CH2)yCH3，其中x+y=2-7，或M，其中M是金属平衡离子或低分子量有机阳离子；或第一试剂包含至少一种具有如下分子式的化学化合物R7-SO2-OR8其中R7是低级烷基、芳基、取代的低级烷基或取代的芳基；而且R8是氢、金属平衡离子或低分子量的有机阳离子；并在外源DNA导入过程中和/或之后，用第二试剂接触细胞，其中第二试剂包含至少一种磺酸化氨基多糖，或其中第二试剂包含至少一种具有如下分子式的化学化合物 其中R1是CHNH2R3，其中R3是天然存在氨基酸的侧链；C6H4R4，其中R4是H、CH3、(CH2)nCH3、NH2、COCH3、CO(CH2)nCH3、C(CH3)3、CH(CH3)2、(CH2)nCH(CH3)2、(CH2)nCOCH3、OCH3或O(CH2)nCH3，其中n=1-3；CHNH2(CH2)nR5，其中n=1-7,R5是CH3、OH、CONH2、C6H4OH或CONHNH2；(CH2)nR6，其中n=1-9,R6是吲哚基、NCH3C(=NH)NH2、SCH3、NH2、CH3、CO2H、CONH2或NHC(=NH)NH2；(CH2)nCHNH2CO2H，其中n=1-8；CH(CO2H)NHCONH2；或C5H4N；而且其中R2选自H,CH3,(CH2)nCH3，其中n=1-8,(CH2)xO(CH2)yCH3或(CH2)xCO(CH2)yCH3，其中x+y=2-7，或M，其中M是金属平衡离子或低分子量有机阳离子；或第二试剂包含至少一种具有如下分子式的化学化合物R7-SO2-OR8其中R7是低级烷基、芳基、取代的低级烷基或取代的芳基；而且R6是氢、金属平衡离子或低分子量的有机阳离子；而且其中当X按如下公式计算时第一试剂的X值大于25X=100-(A×100)C,]]>而且其中第二试剂的G7或G14值大于25，其中G7或G14按如下公式计算 其中对于X或G7或G14,“A”是用第一和第二试剂接触的第一细胞中表达的外源基因编码蛋白的量，而“C”是没有用第一或第二试剂接触的第二细胞中表达的蛋白的量。
41．权利要求40的方法，其中细胞在外源DNA导入之前、之后持续地、或之前和之后持续地与第一试剂接触。
42．权利要求40的方法，其中第一试剂含有苯甲酸盐缓冲剂，而且第二试剂含有硫酸软骨素。
43．权利要求40的方法，其中第一试剂含有苯甲酸和4-乙基苯甲酸，而且第二试剂含有苯甲酸盐缓冲剂和硫酸软骨素。
44．权利要求40的方法，其中第一试剂含有苯甲酸盐缓冲剂和谷氨酸，而且第二试剂含有硫酸软骨素。
45．权利要求40的方法，其中在外源DNA导入细胞之前细胞与第一试剂接触约24小时。
46．增强真核细胞中外源基因瞬时表达的方法，其包括以能在该细胞中表达的形式将编码蛋白质的外源DNA分子导入该细胞；并且，在外源基因导入DNA之前、过程中或之后用瞬时表达增强剂接触该细胞；其中瞬时表达增强剂包含选自如下物质的化合物3-甲基-L-组氨酸、α-酮戊二酸、β-丙氨酸、肌肽、瓜氨酸、肌酸、谷胱甘肽、马尿酸、高丝氨酸、N-氨甲酰天冬氨酸、N-甲酰基-L-甲硫氨酸、鸟氨酸、N-(4-氨基苄基)-L-谷氨酸二乙酯、4-乙酰丁酸乙酯、肾上腺素、甲钴胺、苯甲酸、苯甲酸盐缓冲剂、4-乙基苯甲酸和磺酸化N-乙酰基氨基多糖、来源于C型硫酸软骨素的二糖单体单位、聚甘露糖、甘露糖；或具有如下分子式的磺酸衍生物R7-SO2-OR8其中R7是低级烷基、芳基、取代的低级烷基、芳基、取代的低级烷基、或取代芳基，而R8是氢、金属平衡离子、或低分子量有机阳离子；或苯甲酸和4-乙基苯甲酸；或苯甲酸和4-乙基苯甲酸和硫酸软骨素；或苯甲酸和L-谷氨酰胺；或苯甲酸盐缓冲剂和硫酸软骨素；或苯甲酸盐缓冲剂和谷氨酸；或硫辛酸和硫酸软骨素；或苯甲酸盐缓冲剂、硫酸软骨素和L-谷氨酰胺；或硫酸软骨素和L-谷氨酰胺；或丁酸盐缓冲剂和L-谷氨酰胺；或含有谷光甘肽、甲硫氨酸、甘氨酸、α-氨基-正丁酸、牛磺酸、苯丙氨酸、苯甲酸盐缓冲剂和丙氨酸的混合物。
全文摘要
本发明提供用于增强真核细胞中瞬时表达的方法和化学试剂。还提供在实体瘤中获得延长的瞬时表达的模式系统、在无饲养细胞或与基质结合的细胞外基质时培养肝细胞的方法、操作细胞代谢以降低葡萄糖消耗的方法以及诱导内源磷酸酶活性分泌的方法。
文档编号A61K31/131GK1306569SQ99807164
公开日2001年8月1日 申请日期1999年6月7日 优先权日1998年6月8日
发明者R·A·格菲, A·S·格菲 申请人:基因斯潘公司