专利名称：一种植物多基因表达载体组合及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种植物多基因表达载体组合及其应用。
背景技术：
在过去的几十年里，科学家发展了大量在植物细胞中适于克隆，转移和表达外源 基因的载体。虽然这些载体在植物学研究和生物技术领域被证明具有可操作性，但是这些 载体的基本设计都存在很大的限制性，并且很少允许克隆和转移多于一个目的基因(除了 筛选基因)。由于对剖析复杂的代谢途径研究的逐渐关注，以及发掘多基因性状对植物生物 工程的潜力，致使需要一些新的方法和工具来同时转化多个基因。作为植物遗传工程的主要方法，农杆菌载体在过去的几十年里随着研究目的的不 同进行了不断的改进和修饰。纵观各种农杆菌双元载体，均具有一个基本结构T-DNA和 载体骨架。T-DNA由边界序列(LB，RB)所限定，包含多克隆位点(MCS)，植物选择标记基 因，报告基因和感兴趣的目的基因。长度一般在12 Μ1Λ，是在农杆菌侵染细胞时，从Ti 质粒上切割下来转移到植物基因组中的一段DNA序列。载体骨架包括质粒复制功能单位 (ColEl)，细菌的选择标记基因(Kan和Amp)，和一些对质粒移动具有功能的附属单位(OriT 禾口 bom)(Toshiyuki Komori et al,2007, Plant Physiology, December 2007, Vol. 145, pp. 1155-1160)。由农杆菌介导的T-DNA的转移和整合是细菌和植物细胞相互作用发生生 物学效应的过程，兼具原核生物中的细菌结合转移及真核细胞加工修饰的特点。最早构建的双元载体是 pBinl9(Bevan M (1984) Binary Agrobacterium vectors for plant transformation. Nucleic Acids Res 12 :8711-8721)，随后通过将一个标记基 因弓I入至Ij其中产生了 PBI121 (Jefferson RA(1987)Assaying chimeric genes in plants the GUS gene fusion system. Plant Mol Biol Rep 5:387-405)。随着时间的推移，还产 ^T pPZP (Hajdukiewicz P, Svab Ζ, Maliga P(1994)The small, versatile pPZP family of Agrobacterium binary vectors for plant transformation. Plant Mol Biol 25 :989-994)及其改进型pCAMBIA载体系列，也就是现在常用的载体，它们普遍具有广谱的 抗菌筛选范围，在大肠杆菌中保持高拷贝数，对宿主菌株有更高的兼容性，很高的转化效率 等特征。20世纪80年代以来，以转基因技术为代表的植物基因工程技术的广泛应用为植 物的遗传改良开拓了广阔的前景。传统的转基因植物绝大多数是通过单个目的基因的遗传 转化来定向改良单一性状来获得的。长期以来，培育具有多种优良品质，如高产、优质、高 抗、多抗、营养均衡、具备其他生产上有用的特性的作物品种一直是科学家进行植物遗传改 良的终极目标。而在这个目标的实现上，又有两个层次首先是如何通过表达一条代谢途径上的几个基因，来增强某一单一优质性状的表 达.因为在自然界中，生物体的生长发育是由一条条代谢途径组成的，而每条代谢途径是 由一个个基因组成，它们按序表达，依次衔接，构成生物自身的代谢网络.而具体到某一性 状，可以定向到某一段代谢途径，进而几个关键酶基因，通过表达或抑制关键酶基因来得到我们需要的性状.其次是如何同时表达某些特定性状的关键酶基因得到聚合有高产，高质等多优良 性状的植株，即所谓的植物多目标分子聚合育种。例如可以通过将植物耐盐代谢途径，抗旱 代谢途径，抗病代谢途径中的关键基因克隆，整合进入一个新的植株中，实现植物品质的多 目标整体提高。为此，多基因组装与转化技术便应运而生，以便将多个目的基因导入到植物基因 组中并在植物中进行表达。多基因转化的载体构建策略，大概可以分为以下几个方面1.基于单基因单载体的转化就是每个载体携带有一个外源基因(筛选基因除外)，为了达到将多个基因整合 进入生物体的目的，这就需要许多个载体利用不同的方法进行操作。例如有性杂交聚合 法，重复转化法，共转化法，功能结构域融合法等。2.基于多基因单载体的转化将多个目的基因构建在一个载体上，只通过一次转化就可将几个基因同时转化进 入宿主的基因组中.同时还避免了有性杂交法，重复转化法等繁琐费时的弊病，还能克服 共转化法整合模式复杂及后代不确定整合和分离的缺点.基于多基因单载体转化的方法 也可以分为两个层面蛋白质水平和基因水平。蛋白质水平将几个蛋白的编码序列(coding sequences,⑶Ss)组装融合成为一 个特异的表达盒，进而在细胞中可以只产生一个转录单位。在翻译的过程中，编码的多蛋白 聚合体可以被特异的蛋白酶加工和切割，最终产生独立的蛋白。基因组水平将需要组装的外源基因的两端分别放上启动子，终止子，增强子等调 控元件，形成一个个独立的开放阅读框，然后将它们串联起来转化进入植物体中。每个基因 在植物体内部分别转录，翻译成各自的产物并作用。这种方法还可以还可以利用多顺反子 策略来进行基因的组装，将需要表达的目的基因依次连接在同一个启动子下，在植物体中 顺次表达。目前，利用现有的植物表达载体进行载体构建时，只是需要将基因或DNA片段按 照载体上的多克隆位点通过传统的酶切连接的方法组装成最终表达载体。由于最终表达载 体上多克隆位点只有一个，所以可以选择的酶切位点具有数量上的限制，尤其是当要同时 连接多个基因或DNA片段时，随着片段的增多，可以选择的酶切位点就少之又少。
发明内容
本发明的目的是提供一种方便、快捷构建可表达多个基因的植物表达载体组合。本发明的植物多基因表达载体组合，由载体A和载体B组成；所述载体A和载体B 必须同时存在，整合成为一个整体。所述载体A的核苷酸序列包括依次串连的一个T-DNA 末端序列、多克隆位点序列和特异重组位点序列；所述载体B的核苷酸序列包括依次串连 的特异重组位点序列、多克隆位点序列和一个T-DNA末端序列；其中，当载体A中的T-DNA 末端序列为T-DNA LB末端序列时，所述载体B中的T-DNA末端序列为T-DNA RB末端序列； 当载体A中的T-DNA末端序列为T-DNA RB末端序列时，所述载体B中的T-DNA末端序列为 T-DNA LB末端序列。所述特异重组位点优选为Loxp位点；所述Loxp位点序列为序列表中序列3。
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所述的特异重组位点可以是但不限于修饰Loxp，修饰FRT，修饰R，修饰attB，修饰 attP。所述T-DNA LB末端序列为序列表中序列1 ；所述T-DNA RB末端序列为序列表中 序列2。所述载体A中的多克隆位点序列为序列表中序列4 ；所述载体B中的多克隆位点 序列为序列表中序列5。所述载体A和载体B上还分别带有细菌抗性基因；所述载体A和载体B上的细菌 抗性基因不相同。载体A或载体B可以带有起筛选作用的复制子，形成自杀质粒，如复制子R6K γ，以 便进行阴性筛选。所述载体A为将所述依次串连的一个T-DNA末端序列、多克隆位点序列和特异重 组位点序列插入到PUNI20中，并用所需要的细菌抗性基因替换PUNI20中的细菌抗性基因 得到的重组载体。所述载体B为将所述特异重组位点序列插入到pCambial302的SacII和EcoRI酶 切位点之间，并将GFP基因表达盒切除得到的重组载体。也可以保留GFP基因表达盒，即利 用已有的35S启动子表达盒，通过限制性内切酶NcoI和BglII可以方便地在GFP基因前插 入其他外源基因，方便了后期载体的构建。所述载体A上还带有的植物筛选基因，如卡那霉素，潮霉素，抗除草剂等，以便于 可以根据需要变换植物筛选基因。本发明的植物多基因表达载体组合，可将基因或DNA片段连接到两个自身规模较 小的植物多基因表达载体组合载体上，然后利用重组酶介导的位点特异性重组将两个DNA 片段(中间载体)组装成一个完整的最终表达载体。这样即使是同样的一套多克隆位点也 可以分别在中间载体上利用，同时也可以利用中间载体方便快捷的变换最终表达载体的植 物选择标记基因。本发明的植物多基因表达载体组合的大小缩减至最小，随着质粒DNA大 小的缩减，质粒的拷贝数，稳定性和转化效率都有所增加。在保证转化效率不显著降低的条 件下，质粒越小，可容纳的外源DNA的区段就越长，并且非常有利于实验的操作。通过转基 因实验也证明了这一点，本发明的质粒载体可以同时将至少四个外源基因转入植物中并达 到稳定的表达。本发明由于两个重组元件上的DNA序列依次是LB-MCS-Loxp和Loxp-MCS-RB，通过 重组酶的作用，重组元件所在的质粒进行整合，DNA序列进行新的排布，会形成如下相对位 置LB-MCS-LoXp-MCS-RB，即一个完整的T-DNA片段，进而适合进行植物的遗传转化。针对 多基因转化载体的构建，我们可以先将感兴趣的目的基因根据载体A和载体B上的多克隆 位点通过传统的分子克隆方法连接到连个载体上，由于此时载体的自身规模较小，常规的 分子克隆方法很方便快捷。然后将载体A和载体B在体外利用重组酶进行重组反应，通过 自身的重组位点发生重组整合，转化大肠杆菌感受态细胞，根据载体A和载体B上的选择标 记基因进行重组质粒的筛选，进而得到所需的最终表达载体。载体A也可以选择含有复制 子R6KY等可以进行重组后阴性筛选的克隆载体，这样可以大大提高筛选效率。将载体A 上构建一系列的植物筛选基因表达盒，例如卡那霉素抗性基因，潮霉素抗性基因，抗除草剂 抗性基因等(包含但不限于以上筛选基因)，这样可以根据育种需要方便的更换最终表达载体的植物筛选标记基因，而不用重新做起，大大加速了转基因进程。
图1 重组元件pEIementA和pElementB。pEIementA片段依次由T-DNA的左端 (LB)，多克隆位点(MCS)和重组位点(Loxp)组成。pElementB片段依次由重组位点(Loxp)， 多克隆位点(MCS)和T-DNA的右端(RB)组成。其中外源基因插入在多克隆位点上。图2 载体A上上植物筛选基因种类。Kan 卡那霉素抗性基因，HptII 潮霉素抗性 基因，Bar 抗除草剂抗性基因。图3 最终表达载体的组装流程。载体A和载体B在体外经过重组酶CRE的作用 后，将反应物转化进入大肠杆菌，筛选得到整合有载体A和载体B的最终表达载体的克隆。 RESl和RES2 不同的细菌抗性基因。LB和RB =T-DNA的两端。R6K y Ori 大肠杆菌R6K γ 复制子。ori:大肠杆菌复制子。Loxp:重组位点。MCSl和MCS2 多克隆位点，两者可以相 同也可以不同。图4 构建载体A示意图。pMD18_T，pBluescript SK 质粒载体。Amp 氨苄青霉素 抗性基因。Kan 卡那霉素抗性基因。R6KY0ri 大肠杆菌R6KY复制子。fl ori :fl复制 子。MCS:多克隆位点。图5 构建载体B示意图。pCambial302 植物表达载体。pVSl 农杆菌复制子。 pBR322ori 大肠杆菌复制子。Hyg 潮霉素抗性基因。MCS 多克隆位点。GFP 绿色荧光蛋白。图6 含有GFP，⑶S，BADH，BAR四个外源基因的植物最终表达载体T-DNA区域示意 图。图7 转基因烟草的RT-PCR检测电泳图。图7中，泳道O为分子量11Λ Marker,泳 道1为抗除草剂抗性基因片段对照，泳道2为甜菜碱醛脱氢酶基因片段对照，泳道3为⑶S 基因片段对照，泳道4为GFP基因片段对照，泳道5-8为非转基因烟草对照，泳道9-12为转 pModularB-bar-badh-gfp-gus图8 禾Ij用⑶S组织化学染色法㈧和激光共聚焦显微镜⑶对转基因植株进行 表达分析结果。
具体实施例方式下面结合具体的实例来说明本发明的内容，但本发明不限于下面提供的应用，以 下的描述不对本发明的权利要求构成限制。下述实施例中的方法，如无特别说明，均为常规方法。下述实施例中的百分含量，如无特别说明，均为质量百分含量。本实施例中所采用的基因工程基本技术均来自Jowph Sambrook和David W. Russell 编写的《Molecular Cloning :A Laboratory Manual (Third Edition)》，有些试 剂产品等按照说明书来进行。实施例1、植物多基因表达载体组合的构建本发明考虑到与其费时，费力的将基因或DNA片段拼装到自身规模已经很大(大 约101Λ)的最终载体上，不如先将基因或DNA片段连接到两个自身规模较小的中间载体上，然后利用重组酶介导的位点特异性重组将两个DNA片段(中间载体)组装成一个完整的最 终表达载体。这样即使是同样的一套多克隆位点也可以分别在中间载体上利用，同时也可 以利用中间载体方便快捷的变换最终表达载体的植物选择标记基因。因此，本发明的植物 多基因表达载体组合由两个表达载体组成，载体A和载体B，具体特征有两者均具有一个特异重组位点(如Loxp)两者分别具有一个植物表达载体T-DNA末端(LB或RB)两者均具有一个多克隆位点(MCS)载体A和载体B上分别带有细菌抗性基因，但两者不同。载体A或载体B带有起筛选作用的复制子如R6K γ等，可以进行阴性筛选。载体A上可以带有不同的植物筛选基因(卡那霉素，潮霉素，抗除草剂等，但不限 于)，以便于可以根据需要变换植物筛选基因。构建过程如下所述一、载体A的构建UAmp抗性基因片段的获得根据pMDIS-T(Takara公司)上氨苄青霉素抗性基因(Amp)序列设计引物Pl和 P2(invitrogen公司)，引物序列如下所示Pl :CGACGCGTTTACCAATGCTTAATCAG,标下划线部分为限制件内切酶MluI位点。P2 CTAGCTAGCGACGAAAGGGCCTCGTGATAC，标下划线部分为限制性内切酶 Nhe I 位
点ο以pMDIS-T为模板，以Pl和P2为引物，进行PCR反应扩增，扩增片段进行测序验 证，表明扩增得到1078bp的Amp抗性基因片段，两端分别是MluI和NheI酶切位点。2、多克隆位点(MCS)的获得根据pBluescript SK (Clotech公司)载体上多克隆位点(MCS)序列设计引物P3 和P4，引物序列如下所示P3 GGTACC tggcaggata tattgtggtg taaaca GGGCCCCCCCTCGAGGTCG，标下划线部 分为限制性内切酶Acc65I位点，小写字母为LB端(序列表中序列1所示)。P4 =TCGCGA fp^TiTWT今今I^MWTT今T AATTAACCCTCACTAAAGG，标 下划线部分为限制性内切酶NruI位点，标着重号的为重组位点Loxp。以pBluescript SK为模板，以P3和P4为引物，进行PCR反应扩增，扩增片段进行 测序验证，表明扩增得到205bp的MCS片段，两端分别是Acc65I和NruI酶切位点。该MCS片 段由依次串连的T-DNA末端LB、pBlueSCript SK多克隆位点和重组位点Loxp组成(具体结 构如图1所示的pElementA)。该MCS片段具有序列表中序列4所示的片段，自序列4的5' 端第7-32位核苷酸为T-DNA末端LB，自序列4的5'端第33-134位核苷酸为pBluescript SK多克隆位点的序列；自序列4的5'端第166-199位核苷酸为重组位点Loxp。3、载体A的构建载体A包括图1中pElementA所示结构的元件，即依次串连的T-DNA末端LB、 pBluescript SK多克隆位点和重组位点Loxp。载体A插入表达基因和细菌抗性基因、植物 筛选标记后可以与插入需要外源基因的载体B重组后形成最终表达载体。筛选标记和细菌 抗性基因可根据需要选择不同的基因，我们以Amp抗性基因、选抗除草剂标记基因为例说明该技术。我们以PUNI20作为载体的基本骨架，因为该载体具有R6KY复制子，在后期的 重组筛选中，可以起到负筛选的作用。具体方法如下所示将步骤1获得的Amp抗性基因片段经MluI和NheI双酶切后，与同样用MluI和 NheI 双酶切 pUNI20 (Arabidopsis Biological Resource Center (ABRC))得到的 DNA 片段 连接，转化大肠杆菌感受态DH5 α (Tiangen公司)，得到重组载体，将该重组载体进行测序 验证，将测序表明正确的重组载体命名为pUNI20-Amp。将步骤2获得的MCS片段经Acc65I和NruI双酶切后，回收纯化，插入到载 体pUNI20-Amp的Acc65I和NruI酶切位点之间，转化大肠杆菌感受态DH5 α (Tiagen公 司)，得到重组载体，对该重组载体进行测序验证，得到正确的重组载体命名为pModularA。 pModularA含有依次串连的T-DNA末端LB、pBluescript SK多克隆位点和重组位点 Loxp (即含有如图1所示的pElementA元件结构)。pModularA具体结构如图3和图4所示。克隆抗除草剂标记基因(BAR)表达盒，酶切连接到载体pModularA上，产生 pModularA-bar。具体方法为设计引物P5和P6，序列为P5 GGTACCGCTGAAAGCGACGTTGGATG,标下划线部分为限 制性内切酶Acc65I位点；P6 :GGTACCTCCTGCTGAGCCTCGACATG,标下划线部分为限制件内切 酶Acc65I位点。以pSATlA-ocsAocsP-bar-ocsT(购自ABRC)为模板，以P5和P6为引物 进行PCR扩增，扩增得到1683bp的片段，经测序表明该片段具有自GENBANK号为DQ00M57 的5'端第412位到2094位核苷酸序列，即扩增得到抗除草剂标记基因(BAR)表达盒， Acc65I限制性内切酶(NEB公司)酶切后连接到载体pModularA的Acc65I限制性内切酶 点，经测序验证，将验证正确的插入了抗除草剂标记基因(BAR)表达盒的重组载体命名为 pModularA—bar。二、载体B的构建载体B包括图1中pElementB所示结构的元件，即包括依次串连的重组位点 Loxp、多克隆位点和T-DNA末端RB。为了验证该载体效果以及方便载体构建，我们选择了 pCambia1302(购自于www. cambia. org机构)作为最终载体骨架，由于它已经具有了一个多 克隆位点和含有35S启动子的GFP基因表达盒，其中GFP基因前又可以通过NcoI和BglII 或SpeI方便的插入别的外源基因，这就很利于我们进行后继载体的构建。载体B的具体构 建方法如下所述根据植物表达载体pCambial302 (www. cambia. org)的序列，由于其已经 含有一个完整的多克隆位点(GAATTCGAGC TCGGTACCCG GGGATCCTCT AGAGTCGACC TGCAGGCATGCAAGCTT ；序列表中序列 5)以及 T-DNA 右端(RB) (gtaaacctaa gagaaaagag cgttta 序列表中序列2)，只是需要亚克隆一个含有重组位点Loxp的DNA片段进入载体 替换T-DNA左端(LB)。人工合成DNA接头片段(invitrogen公司合成)，序列如下所述 CCGCGG ATAA CTTCGTATAG CATACATTAT ACGAAGTTAT GAATTC,标下划线部分分别为限制
性内切酶SacII位点和EcoRI位点，标着重号的为重组位点Loxp。该序列两端分别是SacII 和EcoRI酶切位点，片段中含有重组位点Loxp，将该片段连接到植物表达载体pCambia1302 的SacII和EcoRI酶切位点之间，转化大肠杆菌感受态DH5 α，得到重组载体，将重组载体进 行测序验证，将验证正确的载体命名为pModularB-gfp (由于pCambial302载体上自身含有一个GFP表达盒，所以载体B上已经含有一个外源基因GFP)。GFP基因也可以根据需要按 照酶切位点方便的更换为别的感兴趣基因或者将该GFP表达盒切除，获得不含外源基因的 载体B。pModularB-gfp具体结构和构建过程如图5所示。实施例2、本发明的植物多基因表达载体组合的效果验证实施例1制备的植物多基因表达载体组合载体A和载体B可以分别加入需要转 入植物的外源基因表达盒，重组整合成一个可以表达多个基因的植物表达载体。其中， pModularB-gfp已经携带了一个外源基因GFP。以下述方法为例，说明本发明的植物多基因表达载体组合的效果。1、在载体A中插入外源基因表达盒1)含有甜菜碱醛脱氢酶(BADH)基因表达盒的重组载体的获得根据GENEBANK号DQ497233，人工合成(invitrogen公司)植物山菠菜中的甜菜碱 醛脱氢酶(BADH)基因，该序列两端分别带有BioI和BamHI限制性内切酶酶切位点，人工合 成的植物山菠菜中的甜菜碱醛脱氢酶(BADH)基因序列如序列6所示。合成P7和P8 :P7 GTTAATTAATGAGATTTTTCAAATCAG,标下划线部分为限制件内切酶 PacI 位点；P8 :GGCGCGCC.CTCGAG TCGATTTGGTGTATCGAG,标下划线部分为限制件内切酶 AscI 位点，标着重号的部分为限制性内切酶》ιοΙ位点。pEar 1 eyGate 100 (Arabidopsis Biological Resource Center(ABRC)) ^IlIS., 以P7和P8为引物，进行PCR扩增，得到410bp的mas启动子片段，将该片段连接到载体 PMD18-T 中，得到载体 pMD18-T-mas-pro。合成引物P9 和 PlO :P9 :ctcgagc GGATCC tcttggactcccatgttgg,标下划线部分
为限制性内切酶》101位点，标着重号的部分为限制性内切酶BamHI位点。PlO GGCGCGCCGATAATTTATTTGAAAATTC，标下划线部分为限制性内切酶AscI位点。 以 pEarleyGatelOO (Arabidopsis Biological Resource Center (ABRC))为模板，以 P9 禾口 PlO为引物，进行PCR扩增，得到27^p的mas终止子片段，将该片段连接到载体pMD18_T 中，得至丨J pMD18-T-mas-ter。利用XhoI和AscI双酶切将pMD18-T-mas_ter上的mas终止子片段切下连接到 pMD18-T-mas-pro上的BioI和AscI限制性内切酶酶切位点之间，得到含有mas启动子和 终止子的表达盒，经测序表明正确后命名为pMD18-T-mas 0RF。将上述合成的植物山菠 菜中的甜菜碱醛脱氢酶(BADH)基因利用BioI和BamHI双酶切，连接到pMD18-T-maS的 XhoI和BamHI酶切位点之间中得到含有BADH表达盒的重组载体，该载体含有依次串连的 mas启动子、BADH基因和mas终止子片段，将经测序表明正确的载体命名为pMD 18-T-mas pro-BADH-mas ter。2)在pModularA-bar中插入甜菜碱醛脱氢酶(BADH)基因表达盒合成引物P11 :GCGGCCGCTGAGATTTTTCAAATCAG，标下划线部分为限制性内切酶 NotI位点；P12 :GATAATTTATTTGAAAATTC，标下划线部分为限制性内切酶McI位点。以 pMD18-T_mas pro-BADH-mas ter 为模板，以 Pll 和 P12 为引物，进行 PCR扩增， 得到2185bp的BADH表达盒序列，酶切测序验证正确后通过NotI和McI双酶切，将酶切片 段连接到载体PModularA-BAR的NotI和McI酶切位点之间，得到插入了 BADH表达盒的重组载体，将经测序表明正确的重组载体命名为pModularA-BAR-BADH。2、在载体B中插入外源基因表达盒由于pModularB-GFP上已经存有一个外源基因GFP，该基因在常见的植物组成型 表达启动子35S作用下进行表达。同时GFP基因前可以通过已有的限制性内切酶NcoI和 BglII或SpeI方便的插入别的外源基因，于是采用pCambial302载体作为pModularB载 体的构建骨架具有一定的优越性。此处再在pModularB-GFP上插入β-葡糖醛酸酶基因 (⑶S)。具体方法如下所述1)含有β -葡糖醛酸酶基因(⑶幻表达盒的表达载体的获得合成引物Ρ13 和 Ρ14 :Ρ13 GAATTCGATCATGAGCGGAGAATTAAGG,标下划线部分 为限制性内切酶 EcoRI 位点；Ρ14 AAGCTT CTCGAG AGATCCGGTGCAGATTATTTG,标下划
线部分为限制性内切酶HindIII位点，标着重号的部分为限制性内切酶B10I位点。以 pBI121 (Arabidopsis Biological Resource Center (ABRC))为模板，以 P13 和 P14 为引物 进行PCR扩增，得到的nos启动子片段，将该片段连接到载体PMD18-T中，含有得到 nos启动子片段的载体pMD18-T-nos pro。合成弓丨物P15 禾Π Ρ16 :Ρ15 CTCGAG TCTAGA GATCGTTCAAACATTTGGC,标下
划线部分为限制性内切酶XhoI位点，标着重号的部分为限制性内切酶)(bai位点。 P16 AAGCTTCCCGATCTAGTAACATAG,标下划线部分为限制性内切酶HindIII位点。以 pBI121 (Arabidopsis Biological Resource Center (ABRC))为模板，以 P15 和 P16 为引物， 进行PCR扩增，得到274bp的nos终止子片段，将该片段连接到载体pMD18_T中，得到含有 nos终止子片段的载体pMD18-T-nos ter。利用XhoI和HindIII双酶切将pMD18-T_nos ter上的nos终止子片段切下连接 到pMD18-T-n0S pro上的BioI和HindIII限制性内切酶酶切位点之间，得到含有nos启动 子和终止子的表达盒，经测序表明正确后命名为pMD18-T-nos-ORF。 合成引物P17 CTCGAGATGGTCCGTCCTGTAGAAAC，标下划线部分为限制性内切 酶)(hoI位点；P18 TCTAGATCATTGTTTGCCTCCCTG，标下划线部分为限制性内切酶)(bal位 点。以pENTR-gusGnvitrogen公司)为模板，以P17和P18为引物，进行PCR扩增，得到 1824bp的⑶S基因，酶切测序验证正确后通过BioI和)(baI双酶切，将酶切片段连接到载体 pMD18-T-nos-ORF的BioI和)(baI酶识别位点之间，得到含有⑶S表达盒的重组载体，将测 序验证正确的重组载体命名为pMD18-T-nos pro-GUS-nos ter。2)在pModularB-gfp插入β -葡糖醛酸酶基因(⑶S)表达盒将pMD18-T_nos pro-GUS-nos ter 通过 EcoRI 和 HindIII 双酶切，得到 GUS 表达 盒片段，将酶切片段插入到载体pModularB-GFP的EcoRI和HindIII酶识别位点之间，得到 含有得到β-葡糖醛酸酶基因(GUQ表达盒和GFP表达盒的重组载体，将测序表明正确的 载体命名为 pModularB-GFP-GUS。3、利用CRE重组酶将两个载体拼装成最终表达载体两个载体拼装的示意图如图3所示。具体方法如下所述利用CRE 重组酶将 pModularA-BAR-BADH 和 pModularB-GFP-GUS 进行重组反 应，反应体系为20 μ L，由2 μ L IOXCRE重组酶缓冲液(NEB公司)，0. 5 μ L(0. 3ug) pModularA-bar-badh,0. 5μ L(0. 3ug)pModularB-gfp-gus, 1 μ L CRE 重组酶(20units, NEB公司)，16 μ L水。将反应体系置于37 °C反应半小时，70°C温浴10分钟使CRE重组酶失活， 然后转化大肠杆菌感受态细胞DH5 α，在含有氨苄青霉素的培养基上进行筛选，将 筛选得到的阳性克隆提取质粒进行酶切和测序验证，将验证正确的重组载体命名为 pModularB-bar-badh-gfP-gus (结构示意图如图6所示)。该载体含有两个报告基因(GFP 和GUS)，一个植物筛选基因(BAR)，一个植物耐盐功能基因(BADH)。4、多基因载体转化烟草验证将最终表达载体pModularB-bar-badh-gfP-gus转化农杆菌感受态细胞得到含有 pModularB-bar-badh-gfp-gus的农杆菌，利用该农杆菌侵染法转化烟草。具体方法如下所 述1)农杆菌菌液的准备将含有植物表达载体pModularB-bar-badh-gfp-gus的农 杆菌接种于含有100 μ g/mL Kan (卡那霉素)和100 μ g/mL利福平的YEB液体培养液(IOg/ L酵母提取物，10g/L蛋白胨，5g/L氯化钠)中，28°C振荡培养至0D600 > 1.0，用MS液体培 养基(pH 7. 0)将菌液稀释10倍；2)将无菌的烟草(Nicotiana tabacum L. cv Xanth购自中国农业科学院烟草研究 所)组培苗叶片切去边缘和主要叶脉，切成0. 5X0. 5cm2大小；3)切好的外植体在农杆菌菌液中浸泡5min ；4)用无菌滤纸吸干植物材料表面的菌液，转入上铺一层滤纸的MS基本培养基 (含有大量元素硝酸钾1900mg/L，硝酸铵1650mg/L，磷酸二氢钾170mg/L，硫酸镁370mg/ L, CaCl2 · 2H20 44mg/L ；微量元素:KI0. 83mg/L, Η3Β036 · 2mg/L, MnSO4 · 4H20 22. 3mg/L, ZnSO4 · 7H20 8. 6mg/L, Na2MoO4 · 2H20 0. 25mg/L，硫酸铜 CuS04 · 5H20 0. 025mg/L，氯化钴 CoCl2O. 025mg/L，铁盐乙二胺四乙酸二钠 37. !3mg/L，硫酸亚铁 · 7H20 27. 8mg/L ；有 机成分肌醇100mg/L，甘氨酸ang/L，盐酸硫胺素(VB1)O. lmg/L,盐酸吡哆醇VB60. 5mg/L, 烟酸0. 5mg/L,蔗糖30g/L，琼脂7g/L)，25°C暗培养。5)三天后，将材料转到适当筛选压的分化培养基(MS基本培养基+2mg/ L6-BA(6-苄氨基嘌呤)+0. 5mg/L NAA(萘乙酸)+300mg/L Cb (羧苄青霉素))中进行光照培 养，温度25士2°C，光周期14hr光照/8hr黑暗；6)待抗性芽生长至2-3cm高时，切下小芽转入适当筛选压的生根培养基(MS基本 培养基+200mg/L Cb (羧苄青霉素))中诱导生根；7)根长至IOcm以上(约4周)，且具有一定数量即可去掉封口膜，在组培室 中锻炼2-3天，然后移栽在花盆中在室温下生长2-3周，最后移栽至田间种植，得到转 pModularB-bar-badh-gfp-gus 烟草 T0 代植株。提取上述获得的10株转pModularB-bar-badh-gfp-gus烟草Ttl代植株的基因组 DNA，利用聚合酶链式反应进行基因组水平的转基因检测。具体方法是以萌发20天后的转 pModularB-bar-badh-gfp-gusT0转基因烟草幼叶提取基因组DNA，以表1所示的引物barz 和bary，gusz和gusy分别进行聚合酶链式反应，扩增得到如表1所示大小的片段的，即为 转基因阳性植株。结果表明，获得6株阳性转pModularB-bar-badh-gfp-gus烟草植株。表1.转基因检测引物及其扩增片段大小引物名称引物序列扩增片段大小退火温度barzGGTCTGCACCATCGTCAACC448bp50 °CbaryATCTCGGTGACGGGCAGGACbadhzTTCTGGTGCTCATCGTGC509bp45 °CbadhyCTCCCAGTAAATGCTACCTTGguszCTGTTGACTGGCAGGTGGTG918bp45 0CgusyACGCCGTATTCGGTGATGgfpzGAGGGTGAAGGTGATGC410bp44 0CgfpyGCGGGTCTTGAAGTTGG利用trizol试剂(invitrogen公司)按照说明书提取上述获得的阳性转 pModularB-bar-badh-gfP-gus 烟草或烟草(Nicotiana tabacum L. cv Xanth) S 生型萌发 20天植株叶片RNA，利用聚合酶链式反应进行mRNA水平的转基因RT-PCR检测。引物和退火 温度采用的是表1中的四对引物，PCR产物电泳检测，扩增得到如表1所示大小的片段的，即 为转基因阳性植株。结果表明所有阳性转pModularB-bar-badh-gfP-gus烟草植株的四个 外源基因均得到表达。其中第一号样品植株的结果如图7所示。泳道1，5，9为BAR基因检 测；泳道2，6，10为BADH基因检测；泳道3，7，11为⑶S基因检测；泳道4，9，12为GFP基因检 测。其中泳道1，2，3，4为质粒正对照检测；泳道5，6，7，8为野生型非转基因烟草(Nicotiana tabacum L. cv Xanth)检测；泳道 9，10，11，12 为转 pModularB-bar-badh-gfp-gus 烟草检 测。将上述RT-PCR检测结果为阳性的转pModularB-bar-badh-gfp-gus烟草Ttl代植 株幼叶利用GUS组织化学染色和激光共聚焦显微镜分别对转基因植株进行表型观察检测。 参考植物分子生物学实验指南 methods in plant moIec μ Iar biology :A laboratory course manual (马利加D. F.克莱森W.格瑞森姆A. R.卡什莫尔A. R.瓦尔纳)的方法， 略有改进。具体方法为将N，N-二甲基甲酰胺加入到X-Gluc中，搅拌，直到溶解(约需要 2min)，再将0. IM磷酸盐缓冲液、50mM铁氰化钾和50mM亚铁氰化钾溶液加入到X-Gluc溶液 中，搅拌，最后加入TritonX-100 (用前现配)。取不同处理的⑶S阳性植株，浸入X-gluc溶 液中，于37°C黑暗反应2-Mhr至蓝色出现，磷酸缓冲液冲洗一次，用2% (ν/ν)甲醛、0. 5% (ν/ν)戊二醛、IOOmM磷酸缓冲液室温固定50min，然后用系列浓度乙醇(50^^70^^100%) (ν/ν)漂洗各5min，最后浸泡在75% (ν/ν)乙醇中。转化材料在kiss LSM510META型共聚 焦激光扫描显微镜下观察。用488nm argon-ion激光激发，545nm分光镜过滤，505-530nm 检测GFP绿色荧光信号。X-Gluc (5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-葡糖苷酸)溶液(Iml) :50μ 1 N，N-二甲基 甲酰胺，Img X-Gluc, 749 μ 1 0. IM磷酸盐缓冲液(ρΗ7· 0)，100 μ 1 50mM铁氰化钾(分子量 329. 3)，100 μ 1 50mM 亚铁氰化钾(分子量 422. 4)，1 μ 1 TritonX-IOO0结果表明，所有RT-PCR检测结果为阳性的转pModularB-bar-badh-gfp-gus烟草 植株的叶片均可被GUS染成了蓝色，并且激光共聚焦显微镜观察到绿色荧光，表明最终表 达载体pModularB-bar-badh-gfp-gus的T-DNA区域已经转化进入植物基因组中，并且稳定
12表达(图8)。本发明将植物表达质粒载体的大小缩减至最小，带来许多优点，随着质粒DNA大 小的缩减，质粒的拷贝数，稳定性和转化效率都有所增加。在保证转化效率不显著降低的条 件下，质粒越小，可容纳的外源DNA的区段就越长。于是，较小的质粒非常有利于实验的操 作。上述的转基因实验也证明了这一点，本发明的质粒可以同时将四个外源基因转入植物 中并达到稳定的表达。序列表<160>6<210>1<211>26<212>DNA<213>人工序列<220><223><400>1tggcaggata tattgtggtg taaaca26<210>2<211>26<212>DNA<213>人工序列<220><223><400>2gtaaacctaa gagaaaagag cgttta26<210>3<211>34<212>DNA<213>人工序列<220><223><400>3ataacttcgt ataatgtatg ctatacgaag ttat34<210>4<211>205<212>DNA<213>人工序列<220><223><400>40149]ggtacctggcaggatatattgtggtgtaaacagggccccccctcgaggtcgacggtatcg600150]ataagcttgatatcgaattcctgcagcccgggggatccactagttctagagcggccgcca1200151]ccgcggtggagctccagcttttgttccctttagtgagggtttcgtatagc1800152]cgaagttattcgcga2050153]<210>50154]<211>570155]<212>DNA0156]〈213〉人工序列0157]〈220〉0158]<223>0159]〈400>50160]gaattcgagctcggtacccg gggatcctct agagtcgacc tgcaggcatg caagctt570161]<210>60162]<211>15150163]<212>DNA0164]〈213〉人工序列0165]〈220〉0166]<223>0167]〈400>60168]ctcgagatggcgttcccaattcctgctcgtcaactcttcatcgatggagagtggagagaa600169]ccccttttaaaaaatcgcatacccatcatcaacccttctactgaagaaatcatcggtgat1200170]attcctgcagcaactgcagaggatgtggaggttgcagtggtggcagctagaaaagccttt1800171]aagaggaacaaaggcagagattgggctgcaacttctggtgctcatcgtgctaaatatttg2400172]cgtgctattgctgctaagataacagagaaaaaagatcattttgttaaactggaaaccctt3000173]gattctggaaaaccacgggatgaagcagtgttagatattgatgatgttgctacatgcttt3600174]gaatactttgccggtcaagcagaagctctggatgctaaacaaaaggctccagtcaccctg4200175]cctatggaaagatttaaaagtcatgttctcaggcagcccattggtgttgttggattaata4800176]tccccatggaattacccacttctaatggctacatggaaaattgctcccgcacttgctgct5400177]ggatgcacagctgtacttaaaccatcagaattggcatctgtgacttgtctagaattcggt6000178]gaagtgtgtaatgaagtgggacttcctccaggtgtgttaaatattttgacaggattaggt6600179]cctgatgctggtgccccaatagtatctcatcctgatattgacaaggtagcatttactggg7200180]agtagtgccactggaagcaagattatggcttctgctgcccaactagttaagcctgttact7800181]ttggagcttggaggtaaaagtcctgttatcatgttcgaagatattgatattgaaacagct8400182]gttgaatggactctttttggcgttttctggacaaatggtcaaatctgtagtgcaacatct9000183]agactgcttgtgcatgaaagcattgcagctgaatttgttgataggatggtgaagtggaca9600184]Q-Q-Q-Q-Q-C Q^ Q-Q-aaatttctgatccatttgaagaaggatgccggcttggccccgttattagt10200185]aaaggacagtacgacaagattatgaagttcatatcaacagcgaagagtgaaggggcaaca10800186]attttgtgtggaggctcccgtcctgagcatttgaagaaagggtattatattgaacccacc11400187]attataactgatattaccacatccatgcaaatatggaaagaggaagtgtttggccctgtc1200
atatgtgtta aaacatttaaaactgaagattatggtttag ctggtgccgtgttttctaaagctctagaag ttggagctgtttgggttaattggggaggag tcaagcgtagtggatttggatacttgaata tcaagcaggtgacgagtgattctccttgag gatcc
gaagccattg aattggcaaa tgatacagag 1260 gatcttgaaa gatgtgagag ggtaactaag 1320 tgctcacaac catgctttgt tcatgctcca 1380 cgtgaacttg gggaatgggg tatcgagaat 1440 atctctgatg aaccatgggg atggtacaag 1500
151权利要求
1.植物多基因表达载体组合，由载体A和载体B组成；所述载体A的核苷酸序列包括 依次串连的一个T-DNA末端序列、多克隆位点序列和特异重组位点序列；所述载体B的核苷 酸序列包括依次串连的特异重组位点序列、多克隆位点序列和一个T-DNA末端序列；其中， 当载体A中的T-DNA末端序列为T-DNA LB末端序列时，所述载体B中的T-DNA末端序列为 T-DNA RB末端序列；当载体A中的T-DNA末端序列为T-DNA RB末端序列时，所述载体B中 的T-DNA末端序列为T-DNA LB末端序列。
2.根据权利要求1所述的植物多基因表达载体组合，其特征在于所述特异重组位点 为Loxp位点；所述Loxp位点序列为序列表中序列3。
3.根据权利要求1或2所述的植物多基因表达载体组合，其特征在于所述T-DNALB 末端序列为序列表中序列1 ；所述T-DNA RB末端序列为序列表中序列2。
4.根据权利要求1-3中任意一项所述的植物多基因表达载体组合，其特征在于所述 载体A中的多克隆位点序列为自序列4的5'端第33-134位核苷酸序列；所述载体B中的 多克隆位点序列为序列表中序列5。
5.根据权利要求1-4中任意一项所述的植物多基因表达载体组合，其特征在于所述 载体A和载体B上还分别带有细菌抗性基因表达盒；所述载体A和载体B上的细菌抗性基 因不相同。
6.根据权利要求1-5中任意一项所述的植物多基因表达载体组合，其特征在于所述 载体A为将所述依次串连的一个T-DNA末端序列、多克隆位点序列和特异重组位点序列插 入到pUNI20中，并将所需要的细菌抗性基因替换PUNI20中的细菌抗性基因得到的重组载 体。
7.根据权利要求1-5中任意一项所述的植物多基因表达载体组合，其特征在于所述 载体A为将所述特异重组位点序列插入到pCambial302的SacII和EcoRI酶切位点之间得 到的重组载体。
8.根据权利要求1-7中任意一项所述的植物多基因表达载体组合，其特征在于所述 载体A或载体B还带有起筛选作用的复制子。
9.根据权利要求1-8中任意一项所述的植物多基因表达载体组合，其特征在于所述 载体A上还带有的植物筛选基因。
10.权利要求1-9中任意一项所述的植物多基因表达载体组合在培育转基因植物中的 应用。
11.权利要求1-9中任意一项所述的植物多基因表达载体组合在构建可表达多个外源 基因的植物表达载体中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种植物多基因表达载体组合及其应用。该载体组合，由载体A和载体B组成；所述载体A的核苷酸序列包括依次串连的一个T-DNA末端序列、多克隆位点序列和特异重组位点序列；所述载体B的核苷酸序列包括依次串连的特异重组位点序列、多克隆位点序列和一个T-DNA末端序列。本发明的植物多基因表达载体组合的大小缩减至最小，质粒的拷贝数，稳定性和转化效率都有所增加。在保证转化效率不显著降低的条件下，质粒越小，可容纳的外源DNA的区段就越长，非常有利于实验的操作。
文档编号C12N15/84GK102071217SQ20091023790
公开日2011年5月25日 申请日期2009年11月25日 优先权日2009年11月25日
发明者王涛, 董江丽, 马磊 申请人:中国农业大学