专利名称：：利用大气压放电冷等离子体提高酶的活性的方法
技术领域：
：本发明涉及，冷等离子体技术在微生物领域的应用，尤其涉及冷等离子体在控制酶催化活性中的应用。
背景技术：
：等离子体是物质的第四态，是由大量的分子、原子、离子和电子等粒子组成的体系，由于正粒子和负粒子带电量相等，因此宏观上呈现电中性。冷等离子体是一种非平衡等离子体，活性粒子能量高,能够在低温时(小于5(TC)保持足够高的化学活性，因而在生物化工领域有着非常广阔的应用前景。酶是-种具有催化活性和高度专一性的特殊蛋白质，环境因素对其稳定性和活性影响很大，高温、高压、强酸、强碱或者紫外线等均可使蛋白变性，从而失去催化活性。要维持酶活稳定,最基本的方法是在酶的处理或者催化过程中，使其处于最佳状态。生物学上提高酶活的方法通常是通过分子生物学方法,对编码酶的基因进行随机改造或者定点突变，进而对表达出的不同氨基酸序列的酶进行筛选，以期获得高催化活性的酶。酶活通常依赖于其三维立体结构，其分子内部的各种化学键以及表面电荷对其空间结构乃至酶活影响很大。通常的一些剧烈的物理处理(如紫外线、温度、pH调节等等)过程往往使酶变性，丧失活性。本发明采用常压低温等离子体这种条件温和且能量密度较高的物理手段对酶进行处理，可以高效、方便的提酶的酶活。
发明内容本发明的目的在于提供一种利用大气压冷等离子体提高酶活的方法。该方法具有简单方便、高效的特点。本发明的特征在于依次按以F步骤进行步骤(1)制备酶溶液把取自假丝酵母的分子量为5TKD的脂肪酶放在10K分子量透析袋中，在50raM、PH为7.()、浓度为4rag/mL的磷酸缓冲液中透析24小时得到待用酶溶液，在-20t!4"C环境中低温保存；步骤(2)采用内置两个同轴型水冷裸露金属电极的大气压辉光放电等离子体发生器，以氦气作为放电气体,所述同轴型水冷裸露金属电极之间的间距为1mm10mm，氦气流量为Islpm5()slpra，单位为标准升每分钟，外加电压的有效值为0.lkVl()OkV，电源频率为OMHz100MHz;歩骤(3)把所述待用酶溶液载于不锈钢载片，置于所述大气压辉光放电冷等离子体发生器的射流区中，在4"C环境温度下处理10s20min。本发明具有高效、方便以及不会引发酶变性的优点，并可以达到提高脂肪酶活性的效果。图1.大气压辉光放电等离子体发生器处理酶示意图图2.利用大气压放电冷等离子体发生器提高酶的活性的方法流程图具体实施例方式实现本发明方法的歩骤如下1.酶溶液准备将酶溶解于缓冲液中(缓冲液种类根据酶本身所需条件选择，粗酶液需要经透析处理)。待用酶液需低温(_20°C4°C)保存备用。2.选择大气压放电冷等离子体发生器的种类并设定工作参数本发明使用的大气压冷等离子体发生器为采用两个水冷裸露金属电极的大气压辉光放电冷等离子体发生器。根据需要大气压冷等离子体发生器也可以采用单个或多个都涂有绝缘电介质层的水冷金属电极的大气压介质阻挡放电冷等离子体发生器、采用单个或多个都涂有电阻率很高的电阻性材料的水冷金属电极的大气压电阻性阻挡放电冷等离子体发生器以及采用单个针状金属电极或针状金属电极阵列和单个水冷平板金属电极的大气压电晕放电冷等离子体发生器中的一种代替。需要产生大气压辉光放电冷等离子体时，放电气体可以采用氦气、氩气、氮气、氧气、空气以及上述气体的混合气体中的一种，水冷裸露金属(平板型或同轴型，材料为铜、铝、不锈钢等)电极之间间距为(110)咖，气流量为(150)slpm(标准升每分钟)，外加电压有效值为(0.1100)kV,电源频率为(0100)腿z。3.大气压冷等离子体发生器处理酶如图所示,将待处理酶载于不锈钢载片，置于大气压辉光放电冷等离子体发生器的射流区中进行处理，处理时间在10s20min之间。处理过程需在4。C环境中进行。4.经过等离子体处理后酶的活性检测根据酶的特性使用对应的方法测量经过等离子体处理后酶的浓度以及活性。处理后待检测酶液需在4t:环境中保存。以下结合大气压辉光放电冷等离子体发生器处理脂肪酶的实验过程详细叙述本发明的具体实施方法。—.所用的材料及其准备脂肪酶(来源假丝酵母，购于Sigma公司)，分子量约为57KD使用前需用10K分子量透析袋在磷酸缓冲液(50画1/L，pH7.0)中透析24小时；实验浓度约为4mg/mL。二.实验步骤1.制备酶溶液，约l(ML。2.根据需要设定大气压辉光放电冷等离子体发生器的工作气体为氦气，工作参数为电极间距2咖，气流量15slpm，功率120W，电源频率13.56MHz。3.使用大气压辉光放电冷等离子体发生器对脂肪酶进行处理,处理时间分别为0,1()s,2()s,3()s,4()s,5()s。4.对大气压辉光放电冷等离子体发生器处理后的脂肪酶的酶量和酶活进行检测。检测方法如下(1)酶活的测定采用对硝基苯棕榈酸酯法对脂肪酶的活性进行测定。测量时，添加50ul酶溶液(酶浓度为50ug/mL)至底物溶液中，底物溶液为用Tris-HCl缓冲液配制0.5mmol/L的对硝基棕榈酸酯(p-NPP)。使用紫外-可见光分光光度计(ShimadzuMultispec-1501)在348nm下检测13min，所得扫描曲线之斜率比例即为相对酶活。[,](2)酶量的测定(蛋白浓度的测定)BCA法(试剂盒购于碧云天公司)。待测蛋白的浓度应稀释为0.5mg/mL左右对比经过不同时间的大气压辉光放电冷等离子体发生器处理后的脂肪酶与参照脂肪酶发现，脂肪酶酶量经过等离子体处理后基本不变(处理前后均为4.(Mg/m:l.)，但脂肪酶的酶活得到了很大程度的增加，结果见表1，和处理前相比，处理50秒后的酶活提高21.8%。表1经过不同时间大气压冷等离子体处理后的脂肪酶酶活<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>权利要求利用大气压放电冷等离子体发生器提高酶的活性的方法，其特征在于，依次按以下步骤进行步骤(1)制备酶溶液把取自假丝酵母的分子量为5TKD的脂肪酶放在10K分子量透析袋中，在50mM、PH为7.0、浓度为4mg/mL的磷酸缓冲液中透析24小时得到待用酶溶液，在-20℃～4℃环境中低温保存；步骤(2)采用内置两个同轴型水冷裸露金属电极的大气压辉光放电等离子体发生器，以氦气作为放电气体，所述同轴型水冷裸露金属电极之间的间距为1mm～10mm，氦气流量为1slpm～50slpm，单位为标准升每分钟，外加电压的有效值为0.1kV～100kV，电源频率为0MHz～100MHz；步骤(3)把所述待用酶溶液载于不锈钢载片，置于所述大气压辉光放电冷等离子体发生器的射流区中，在4℃环境温度下处理10s～20min。全文摘要利用大气压放电的冷等离子体发生器提高酶的活性的方法，属于冷等离子体技术应用领域，其特征在于，依次含有以下步骤制备酶溶液、选择大气压放电的冷等离子体发生器的种类并设定工作参数，用大气压放电的冷等离子体处理所述酶溶液。本发明具有高效、方便改变酶的活性的优点。文档编号C12N9/20GK101701212SQ20091023761公开日2010年5月5日申请日期2009年11月13日优先权日2009年11月13日发明者乐沛思,冯权,包成玉,李和平,李果,王立言,邢新会申请人:清华大学;北京思清源生物科技有限公司