专利名称：以病毒mRNA核转运为靶点的抗HIV-1药物筛选方法
技术领域：
本发明涉及生物医药领域，具体涉及一种抗Hiv-I药物的筛选方法。
背景技术：
艾滋病(acquired immunodeficiency syndrome, AIDS)是由人免疫缺陷病毒 (human immunodeficiency virus, HIV)感染导致人体免疫机能缺陷，而易于发生机会性感 染和肿瘤的临床综合征。在过去的20多年里造成2000多万人死亡，目前全世界艾滋病病 毒感染者已达4000万左右。艾滋病不仅成为我国严重的卫生健康问题，同时每年造成了上 千亿的直接经济损失。据中国卫生部2008年通报，全国累计报告HIV感染者达25万多人， 预计则高达约70万人。目前临床使用的传统的抗艾滋病药物虽在抗HIV-I方面起到了很大的作用，但仍 存在一些问题，如在人体内活性不高、口服生物利用度低、易产生耐药性或交叉耐药性及生 产成本高等。耐药是病毒的药物作用靶位蛋白变异的结果。因为耐药株经常对一组抗病毒 药物耐药，并且同一类药物之间交叉耐药非常常见。因此，急需寻找作用于新靶点的高效低 毒的抗艾滋病药物。21世纪以来，研究人员的视线已集中到很多的新的靶点上。HIV-I基因组由两条单链正链RNA组成，每个基因组约为9. 71Λ。结构上包括 LTR，结构蛋白编码区(gag)，多种酶活性的蛋白编码区(pol)，外膜蛋白(erw)编码区以 及6个调节基因。gag基因编码病毒的核心蛋白，翻译时先形成一个分子量大约是55kD 的前体蛋白(P55)，然后在HIV蛋白酶的作用下裂解成matrix(MA)、Capsid(CA)、p2、 nucleocapsid(NC)、pl和p6g#。pol基因产物与各种酶的功能相关，如HIV-1蛋白酶(PR)， 逆转录酶(RT)、整合酶(IN)等。Pol基因不能单独翻译，gag基因翻译过程中，会有5% 10%的几率发生特定的移码，使翻译继续下去，得到160kD的feig-Pol。Gag-Pol在HIV蛋 白酶的作用下裂解成MA、CA、p2、NC、移码蛋白(TF)、PR、RT、IN。HIV-I病毒的增殖、有效表达都依赖于一种调控蛋白一Rev蛋白。Rev蛋白即病毒 颗粒蛋白表达调节因子(Regulator of expression ofvirion protein，Rev)，是 HIV-1 病 毒复制非常重要的的一个反式激活因子，能够促进HIV-I的基因转录由早期向晚期转变， 即由调节蛋白基因的转录向结构蛋白基因的转录进行转变。Rev蛋白大小为19KD，由Rev 基因编码。Rev基因是由HIV-I病毒mRNA完全剪辑后的两个外显子组成，分别编码25个氨 基酸和91个氨基酸的肽段，两个肽段聚合形成116个氨基酸的Rev蛋白。Rev蛋白含有四 个功能结构域核定位信号(NLQ、RNA连接区域(RBD)、NLS/RBD侧面低聚合区、核转运信号 (NES)。其中RBD域在HIV-I基因组RNA核转运时特异性地与HIV-I的RRE片段结合；NES 与CRMl蛋白的HllA和H12A片段特异性结合。逆转录病毒HIV-I的mRNA通过转录后剪辑成为30多种mRNA，按照大小可分 为三类未剪辑mRNA、部分剪辑mRNA、完全剪辑mRNA。在病毒的生命过程中，这些mRNA 只有转运出细胞核才能完成其生物功能。其中，未剪辑mRNA和部分剪辑mRNA都因含 有 RRE (Rev-response element, Rev 蛋白效应原件)片段，从而通过 Rev (Regulator ofexpression of virion protein)依赖性途径从细胞核内转运到细胞质中的，前者作为 基因组RNA进行病毒包装，后者作为编码feg/Pol的mRNA进行翻译；完全剪辑mRNA因无 RRE片段则由另一种途径一 NXFl途径转运出核，其主要是作为编码调控蛋白和Env蛋白的 mRNA。HIV-ImRNA的Rev蛋白依赖性转运途径是依赖于Rev蛋白与核膜上的CRMl蛋白特异 性结合而完成的。CRMl是一个较为保守的蛋白，属于RNA转运超家族蛋白。其专一性抑制 剂为来普霉素B(1印tomycin B，Iiffi)。寻找新的有效的抗HIV药物，一直是本领域研究的热点。然而，到目前为止仍然鲜 有有关简便、高效地筛选抗HIV的方法的报道。
发明内容
针对上述不足，本发明的提供一种用于筛选HIV药物的方法。为实现上述目的，本发明首先提供一种真核表达载体，该表达载体具有报告基因， 在所述报告基因的上游和下游分别具有SD序列的UTR片段和RRE片段。所述报告基因可 以是常规报告基因，为了便于检测，所述报告基因优选为荧光蛋白基因，所述荧光蛋白可以 是GFP、RFP、YFP等。为了提高表达效率，根据密码子的偏爱性对荧光蛋白基因作适当的改 造是必要的。在本发明中，优选根据HIV-I病毒密码子的偏爱性设计荧光蛋白编码基因。在本发明的实例中，将正常GFP蛋白的密码子改造成为Hiv-I病毒偏爱性的 hivGFP密码子。使得hivGFP与正常GFP基因的同源性最终达到68%。在此基础上，本发明提供一种筛选抗HIV-I药物的方法，其是将上述的表达载体 与表达Rev的表达载体共转染宿主细胞，添加待检样品至共转染后的宿主细胞，检测细胞 中报告基因编码产物的表达量，判断样品是否对Rev蛋白具有抑制作用。当报告基因为荧 光蛋白基因时，则可方便地通过检测荧光的强弱来进行判断。必要时，可以在检测时以LMB 作为阳性药物对照，来检测细胞中荧光的强弱。这里所述的宿主细胞是指能够表达Rev所 述报告基因的细胞，如动物细胞。在本发明的实例中，用于共转染宿主细胞的表达载体(质粒载体)分别是 pUTR-hivGFP-RRE和pCDNA3_Rev，宿主细胞是^3T。该实例通过将正常GFP蛋白的密码子 改造成为HIV-I病毒偏爱性的hivGFP密码子，使得hivGFP与正常GFP基因的同源性最终达 到68%，然后将hivGFP基因片段克隆到ρ⑶NA3质粒载体上，转染到细胞即可表达hivGFP 蛋白。为了模拟自然生境下HIV-I的非剪切RNAs的核转运状态，在质粒PCDNA3-HIVGFP上 hiv-GFP片段上下游分别添加了含有SD序列(major splice donor)的UTR片段和可以与 Rev蛋白特异性结合的RRE片段。其中SD序列可以防止hiv-GFP基因被细胞降解并得以 顺利转录；RRE片段可以介导hivGFP mRNA通过Rev-CRMl途径转运出核。，药物对Rev蛋 白的抑制作用可以通过检测hivGF荧光的强弱来判断。通过将质粒pUTR-hivGFP-RRE和 ρ⑶NA3_Rev按照一定比例共转染到细胞中，由于hivGFP的表达量受Rev蛋白的特异性的调 控，LMB作为专一性抑制Rev-CRMl核转运途径的阳性药物，备筛选化合物作用于共转染的 细胞后，通过检测GFP荧光的强弱来判断药物对Rev蛋白的抑制作用。本发明以病毒mRNA核转运为靶点提供一种用于筛选抗HIV-I药物的方法，利用该 方法能够方便、快速地筛选抗HIV-I的药物，为抗HIV药物的筛选提供了新途径。
图 1 为 pUTR-hivGFP-RRE 的质粒图谱。
具体实施例方式以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离 本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明 的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。实施例11 质粒 pUTR-hivGFP-RRE 的构建根据HIV-I病毒密码子的偏爱性对正常GFP蛋白的密码子进行改造得到hivGFP 编码序列(其核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示)，使得hivGFP与正常GFP基因的同源性最终 达到68%，然后将hivGFP基因片段克隆到ρ⑶NA3质粒载体上，得到质粒ρ⑶NA3-HIVGFP。以BHlO质粒(为NIH AIDS Reagent Program提供)(含有HIV-1毒株全序列)为 模板，用以下引物 5 ‘ ATCGAATTCCGACGCAGGACTCGGCTTGC-3 和 5 ‘ GATCCCATGGCTCTCTCCTTC AGCCTCCG-3 ‘进行 PCR 扩增，得到 UTR 片段；用 5 ‘ GATCGGATCCGAGATCTTCAGACCTGGAGGAG-3 '禾Π 5' GATCCTCGAGGTTCACTAATCGAATGGATCTG-3'两个引物进行PCR扩增获得 RRE 片段。然 后分别在ρ⑶NA3-HIVGFP质粒上Kpn I和EcoR I两个酶切位点之间插入UTR片段；在BamH I和Β ο I两个酶切位点之间插入RRE片段。继而将所得质粒命名为pUTR-hivGFP-RRE。 (图谱见图1，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 5所示)。
UTR片段的PCR扩增反应体系(总体积50 μ 1)上游引物(10 μ Μ) :2μ 1下游引物(10 μ Μ) :2 μ 1模板质粒 BHlO :1 μ 1Takara 公司 Pfu DNA 聚合酶 2 XMIX :25 μ 1ddH20 20 μ 1反应条件95°C预变性:3min ；94°C变性30s，56°C退火30s，72°C延伸30s，四个循 环；72°C衍生IOmin ；4°C保存。RRE片段PCR扩增的条件与UTR片段的PCR扩增相同。2细胞培养取细胞进行培养，待细胞长满培养瓶后，弃培养瓶中的培养基，用含0. 25% 胰酶、0. 02% EDTA的消化液消化。待细胞变圆，弃消化液，立即加入含10% FBS的高糖DMEM 培养基(HyClone)，用吸管轻轻吹打瓶底，使细胞完全脱离瓶底且使之分散为单细胞悬液。 血球计数板计数后，IOcm细胞培养皿共接种2. 4 X IO6个细胞，培养24h后转染。3细胞转染转染步骤按Lipofectamine 2000 Qnvitrogene)的说明书进行。具体操作如下 用1. 5ml高糖DMEM培养基稀释质粒，pUTR-hivGFP-RRE和pCDNA Rev质粒用量分别为20 μ g 和 2 μ g，比例为 10 1。用 1. 5ml 高糖 DMEM 培养基稀释 60 μ 1 Lipofectamine 2000。室 温孵育5min，将含有转染质粒和Lipofectamine 2000的培养基轻轻混勻(总体积为:3ml)，5室温孵育20min，加到IOcm培养皿的细胞培养上清中。转染后，37°C，5%的CO2培养12h。然后吸去培养皿的培养基，用含0. 25 %胰酶、0.02% EDTA的消化液消化，弃消化液，立即加入含10% FBS的高糖DMEM培养基，轻轻吹打， 使细胞分散为单细胞悬液。血球计数板计数后，用培养基将细胞浓度调整为2. 5X105个/ ml，混勻后于四周黑色不透明、底部透明、平底的96孔板(Costar)每孔接种150 μ 1细胞悬液。4样品制备化合物样品IOmg纯品化合物溶到ImlDMSO中，50 % DMSO稀释到lmg/ml，取1.5μ 1作用于150 μ 1细胞体系，使其终浓度为 ομ g/ml。发酵液样品菌种发酵，从斜面上挑取一小块培养物种入盛有50ml发酵培养基的 250ml三角瓶中，28°C、190rpm旋转摇床培养4d。取IOml发酵液用IOml的丙酮抽提，挥干 后，用Iml的DMSO溶解。取IOyl加IOyl水倍比稀释，取1.5μ1作用于150μ1细胞体系。来普霉素B(1印tomycin B，LMB)购于USB公司(Lot No. 115925)，甲醇稀释至终 浓度为ι μ g/ml。可以专一性抑制Rev-CRMl核转运途径，从而降低hivGFP的表达。在本筛 选模型里作为阳性化合物。5样品活性检测96孔板培养1 后，按以下分组进行操作溶剂对照组加入1. 5 μ 1 50% DMSO于细胞培养上清中，该组反映DMSO对hivGFP 蛋白表达的影响程度。阳性药对照组加0. 75 μ 1的1 μ g/mlLMB于150 μ 1的细胞体系中。该组反映LMB 对Rev-CRMl核转运途径的特异性抑制程度，同时反映hivGFP在Rev蛋白的介导下表达受 抑制程度。样品实验组加药筛选的样品1. 5 μ 1于150 μ 1的细胞体系中。该组反映筛选样 品程度对Rev-CRMl核转运途径的特异性抑制程度，同时反映hivGFP在Rev蛋白的介导下 表达受抑制程度。继续培养16h后，吸去96孔板中的培养基，每孔加入100 μ L PBS,使用 480nm(±10nm)激发光，520nm(士 lOnm)处发射光，检测GFP强度。结果，阳性药物对照组的荧光强度显著弱于溶剂对照组，表明LMB对hivGFP在Rev 蛋白的介导下表达产生了抑制作用。从组合化学库共筛选3000个样品，其中初筛阳性化合 物23个。序列表<110>中国医学科学院生物技术研究所<120>以病毒mRNA核转运为靶点的抗HIV-I药物筛选方法<130>KHP09113514. 4<160>5<170>PatentIn version 3. 5<210>1<211>720
atggtaagcaaaggagaagaattatttacaggagtagtaccaatattagtagaattagac60ggtgacgtaaatggacataaatttagcgtaagcggagaaggagaaggtgacgcaacatat120ggaaaattaacatttttatatgtacaacaggaaaattaccagtaccctggccaaca180ttagtaacaacatttacatatggagtacaatgttttagcagatatccagaccatatgaaa240caacatgacttttttaaaagcgcaatgccagaaggatatgtacaagaaag300tttaaagacgacggaaattataaaacaagagcagaagtaaaatttgaaggagacacatta360gtaaatagaatagaattaaaaggaatagactttaaagaggacggaaatatattaggacat420aaattagaat3. 3.3. 3. 3.3.tagccataatgtatatataatggcagacaa3. C 3.3.3.3.3.3.3. 480ggaataaaag 3.3.3.3.3.aataagacataatatagaggacggaagcgtacaattagca540gaccattatc3.3. C 3.3.3.3. 3. Caccaataggtgacggaccagtattattaccagacaatcat600tatttaagcacacaaagcgcattaagcaaagacccaaatgaaaaaagagaccatatggta660ttattagaatttgtaacagcagcaggaataacattaggaatggacgaatt3. 3. 3.3.3. 3.3.720<212>DNA <213>人工序列 <400>1<210>2 <211>29 <212>DNA <213>人工序列 <400>2atcgaattcc gacgcaggac tcggcttgc29<210>3<211>29<212>DNA<213>人工序列<400>3gatcccatgg ctctctcctt cagcctccg29<210>4<211>32<212>DNA<213>人工序列<400>4gatcggatcc gagatcttca gacctggagg ag32<210>5<211>7034<212>DNA<213>人工序列<400>权利要求
1.一种真核表达载体，其具有报告基因，在所述报告基因的上游和下游分别具有SD序 列的UTR片段和RRE片段。
2.如权利要求1所述的表达载体，其特征在于，所述报告基因为荧光蛋白。
3.如权利要求2所述的表达载体，其特征碍于，所述荧光蛋白为GFP、RFP、YFP。
4.如权利要求1或2所述的表达载体，其特征在于所述报告基因基因的密码子为 HIV-I病毒偏爱性的密码子。
5.如权利要求1所述的所述的表达载体，其特征在于该表达载体为pUTR-hivGFP-RRE。
6.权利要求1 5任一项所述表达载体与表达Rev的表达载体共转染的细胞。
7.一种筛选抗HIV-I药物的方法，其特征在于，将权利要求1 5任一项所述的表达载 体与表达Rev的表达载体共转染宿主细胞，添加待检样品至共转染后的宿主细胞，检测细 胞中报告基因编码产物的表达量，判断样品是否对Rev蛋白具有抑制作用。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，在检测时还包括以LMB作为阳性药物对照。
9.如权利要求7或8所述的方法，其特征在于，所述表达Rev的表达载体为 pCDNA3-Rev0
10.如权利要求7或8所述的方法，其特征在于，所述宿主细胞为细胞。
全文摘要
本发明提供了一种筛选抗HIV-1药物的方法，该方法以病毒mRNA核转运为靶点，通过构建带有报告基因的表达载体，在所述报告基因的上游和下游分别具有SD序列的UTR片段和RRE片段，将该表达载体与表达Rev蛋白的质粒共转染宿主细胞，添加待检样品至共转染后的宿主细胞，检测细胞中报告基因表达量，判断样品是否对Rev蛋白具有抑制作用。利用该方法能够方便、快速地筛选抗HIV-1的药物，为抗HIV药物的筛选提供了新途径。
文档编号C12N5/10GK102051378SQ200910237159
公开日2011年5月11日 申请日期2009年11月9日 优先权日2009年11月9日
发明者刘振龙, 岑山, 张全, 李晓宇, 杨亮, 贾平平, 魏晓露 申请人:中国医学科学院医药生物技术研究所