一种提取人肿瘤细胞膜蛋白的方法
【专利摘要】本发明公开了一种提取人肿瘤细胞细胞膜蛋白的方法，包括细胞的破碎、差速离心分离细胞膜、膜蛋白的溶解以及膜蛋白纯度的Western Blot检测。本发明主要是针对人肿瘤细胞膜蛋白的提取，为肿瘤细胞膜蛋白组学研究提供新的方法。此发明将有助于进一步进行关于抗肿瘤药物致人肿瘤细胞膜蛋白表达水平影响的机制研究，为抗肿瘤药物靶点的筛选及相关研究提供有用的技术手段。
【专利说明】-种提取人肿瘤细胞膜蛋白的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物制品领域，具体的说是提供一种人肿瘤细胞膜蛋白的提取方法。 技术背景
[0002] 细胞膜是细胞对外界的屏障和细胞内外环境交流的界面，它使细胞与周边环境隔 离，维持着相对稳定的细胞内环境。膜蛋白是细胞膜的重要组成部分，执行着细胞内外物质 交换、细胞识别与免疫应答、信号转导和调控，W及能量传递等重要功能。在基因组中，编码 膜蛋白的基因约占基因总数的H分之一。在已知的药物祀标中，大约有70%是膜蛋白，包括 G蛋白偶联受体，离子通道蛋白，转运蛋白，细胞色素P450等。关于膜蛋白的动态观察和表 征对深入理解生理过程，疾病机制和药物祀点的筛选具有十分重大的意义。
[0003] 膜蛋白的异常表达和修饰与肿瘤细胞的恶性行为密切相关。信号受体如离子通 道偶联受体、G蛋白偶联受体、酪氨酸激酶受体等的异常可W激活或启动一系列生物化学反 应，在肿瘤的发生、发展和转移过程具有关键作用。膜转运蛋白如载体蛋白发现与肿瘤的抗 药性有非常密切的关系。细胞黏附蛋白作为一类介导细胞与细胞、细胞与细胞外基质间相 互作用的蛋白，在肿瘤转移过程发挥重要作用。由上可见，肿瘤细胞中膜蛋白的研究对探索 肿瘤细胞的形成机制，筛选肿瘤标志物和药物祀点都是非常重要的。
[0004] 对于肿瘤细胞膜蛋白的研究，膜蛋白的分离纯化是研究的基础和起点。由于大多 数膜蛋白是低丰度蛋白、具有很强的疏水性，该些特点给膜蛋白的提取纯化带来了挑战。当 前膜蛋白的提取方法通常使用表面活性剂、超声波破碎、藏糖梯度密度离也、差速梯度离 也、生物素化等方法。在膜蛋白的研究过程中，表面活性剂对膜蛋白的提取、纯化W及稳定 膜蛋白的生物活性具有非常重要的作用。目前，研究膜蛋白的表面活性剂有SDS、Triton X-100、NP-40、0G、CHAINS等等。然而，该些表面活性剂由于自身的特点，在膜蛋白质组学的 具体应用中具有各自的局限性，如对膜蛋白增溶性不好，不能有效稳定膜蛋白的生物活性， 或者不兼容后续的酶解和质谱鉴定等。对称型表面活性剂（Gemini surfactant)是一类具 有对称结构的二聚型双亲分子。近年来，在膜蛋白体系的研究中崭露头角。为膜蛋白科学 的研究提供新型的分子工具。
【发明内容】
[0005] 针对现有技术的缺乏和不足之处，本发明提供一种人肿瘤细胞膜蛋白的提取方 法。
[0006] 本发明通过W下方案实现；一种提取人肿瘤细胞膜蛋白的方法，按照W下步骤进 行；1.对所收集的人肿瘤细胞使用lOmmol/L Tris-肥1溶液中，于冰上使用Dounce匀浆器 匀浆；
[0007] 2.匀浆液在4°C W 4000rpm的离也后收集上清液，沉淀为未破碎细胞及细胞核；
[0008] 3.细胞上清液在4C W 1440化pm离也后收集上清液，沉淀为线粒体；
[0009] 4.细胞上清液在4°C W 35300巧m离也后收集沉淀，上清液为细胞浆溶液；
[0010] 5.沉淀用膜蛋白裂解液于冰上裂解；使用的膜蛋白裂解液组成有效成分为 7mmol/L尿素，2mmol/L硫脈，4%对称型表面活性剂化合物，40mmol/L DTT ;
[0011] 6.经过截留分子量为3000道尔顿的超滤膜超滤处理后，分装。
[0012] 步骤（1)中使用Dounce匀浆器的细胞破碎方法。
[0013] 步骤（4)中使用离也条件为35300巧m离也60分钟。
[0014] 步骤化）中使用截留分子量为3000道尔顿的超滤膜。
[001引步骤（5)中的对称型表面活性剂的结构为：
[0016]
【权利要求】
1. 一种提取人肿瘤细胞膜蛋白的方法，其特征在于，按照以下步骤进行： (1) 对所收集的人肿瘤细胞使用lOmmol/LTriS-HCl溶液中，于冰上使用Dounce匀浆 器匀浆； (2) 匀浆液在4°C以4000rpm的离心后收集上清液，沉淀为未破碎细胞及细胞核； (3) 细胞上清液在4°C以14400rpm离心后收集上清液，沉淀为线粒体； (4) 细胞上清液在4°C以35300rpm离心后收集沉淀，上清液为细胞浆溶液； (5) 沉淀用膜蛋白裂解液于冰上裂解；使用的膜蛋白裂解液组成有效成分为7mmol/L 尿素，2mmol/L硫脲，4%对称型表面活性剂化合物，40mmol/LDTT; (6) 经过截留分子量为3000道尔顿的超滤膜超滤处理后，分装。
2. 根据权利要求1所述的提取人肿瘤细胞的方法，其特征在于，步骤（1)中使用 Dounce匀浆器的细胞破碎方法。
3. 根据权利要求1所述的提取人肿瘤细胞的方法，其特征在于，步骤（4)中使用离心条 件为35300rpm离心60分钟。
4. 根据权利要求1所述的提取人肿瘤细胞的方法，其特征在于，步骤（6)中使用截留分 子量为3000道尔顿的超滤膜。
5. 根据权利要求1所述的提取人肿瘤细胞的方法，其特征在于，步骤（5)中的对称型表 面活性剂的结构尹
【文档编号】C07K1/34GK104447975SQ201410657259
【公开日】2015年3月25日 申请日期:2014年11月18日 优先权日:2014年11月18日
【发明者】洪文旭, 欧阳建平, 邓晰月, 曾序春, 段山 申请人:深圳市人口和计划生育科学研究所