专利名称：蚯蚓体腔细胞提取方法
技术领域：
本发明涉及一种生物工程技术领域的细胞提取方法，具体地说，涉及的是一 种蚯顿体腔细胞提取方法。
背景技术：
近年来，国内外己相继开展了利用蚯蚓作为载体对可能造成土壤环境污染的 化学物质进行测试，并根据这些化学物质对蚯蚓的毒害程度来评价其可能对环境 的危害程度。也就是说利用蚯蚓作为土壤环境的一种指示生物。这方面的研究工 作最早在上世纪四、五十年代就已开展，但只是在近二、三十年来随着化学药品 在农业生态系统中的大量使用和城市及工业固体废弃物的大量排放，土壤污染问 题日益严重的情况下，蚯蚓生态毒理学研究工作才得到了较为普遍的重视和发 展。1981年欧共体(EEC)做出规定 一种新的化学药品登记进入市场之前要求具 有针对于一种藻类， 一种水蚤， 一种高等植物， 一种鱼类， 一种蚯蚓和一种有富 积作用的物种的毒理试验资料以及生物降解试验资料。
蚯蚓的免疫系统由先天免疫屏障、细胞免疫和体液免疫三方面构成。蚯蚓的 免疫防御体系由外部屏障结构和防止毒物入侵体内后进一步蔓延的内部免疫机 制所组成，这种内部免疫机制有自然免疫和获得性免疫两种类型，包括细胞免疫 和体液免疫。在蚯顿的免疫防御体系中，屏障免疫和自然免疫起主要作用，而获 得性免疫不发达。目前己有报道蚯蚓免疫系统作为生物标志物对土壤中重金属的 污染的指示作用。
作为环节动物的典型代表，蚯顿的体细胞依据形态学和来源分为两类(1)
具有红细胞的血液系统，这一部分与免疫关系不大。(2)体腔液中的细胞群，这
些细胞都不同程度的与免疫过程有关，或者他们的代谢作用和分泌作用与体液免 疫相关。此外，排除速度快、特异性小、记忆时间短是蚯顿细胞免疫防卫的特点。 蚯蚓的先天性免疫和适应性免疫的细胞功能主要是通过体腔细胞执行，因此，蚯 蚓体腔细胞在细胞免疫中发挥着重要的作用。体腔细胞依染色方法和超微结构形 态学、以及功能特性又分为阿米巴样细胞和油细胞。
早期获得蚯顿体腔细胞主要是刺破蚯蚓体腔获取细胞。目前多采用超声波刺 激，针刺，电压剌激、酒精等刺激物的非损伤方法获取蚯蚓的体腔细胞。随着生 物技术在细胞水平、亚细胞水平和分子水平的发展，以上各种方法提取的蚯蚓体 腔细胞的数量和成活率已不能满足目前对土壤污染快速检测的需要。
纤维针结合超声波刺激法提取的蚯蚓体腔细胞的数量多且成活率较目前已 报道的其他方法高，可用于以蚯蚓体腔细胞为实验对象的细胞流式技术的单细胞 凝胶电泳实验，满足对土壤污染快速、灵敏、准确检测的需要。
经对现有技术的文献检索发现，M. Hendawi等在《Ecotoxicology and Environmental Safety》(生态毒理与环境安全)(2004， 59: 17-22)上发表的 "A new ultrasound protocol for extrusion of coelomocyte cells from the earthworm Eisenia fetida"(—种从赤子爱胜蚓提取体腔细胞的新的超声波 提取法)，该文中提出用超声波提取法、乙醇法和电压刺激法获取蚯蚓体腔细胞， 且该超声波提取法获得的蚯蚓体腔细胞数量明显大于用乙醇法和电压刺激法获 得的蚯躬l体腔细胞数量。具体方法为将放置于缓冲液的蚯蚓多次(10次)暴 露于超声波2-3s。其不足在于该方法虽然提取的蚯蚓体腔细胞数量较其他两 种方法多，但成活率仅为68.2±7.8% ，不能满足以蚯蚓体腔细胞为实验对象的 细胞流式技术和单细胞凝胶电泳实验的需要。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术的不足，提供一种蚯蚓体腔细胞提取方法，即 用纤维针结合超声波刺激法提取的蚯蚓体腔细胞的技术，保证所提取的离体细胞 的数量和成活率，为进一步开展蚯蚓细胞毒理实验打下基础。
本发明是通过以下技术方案实现的，本发明包括如下步骤
第一步，蚯顿(Eisenia andrei)清肠。
选用蚯蚓为安德爱胜蚓(Eisenia andrei)，预养一段时间，然后选择具有 环带的健壮成体，平均体重在300mg左右。蚯蚓清肠24小时后，用浓度为0. Olmol L—'、pH7. 2的PBS缓冲液反复冲洗干净蚯蚓，加入3mL含有2. 5mM乙二醇-双-(2-氨基乙基)四乙酸(EGTA)的PBS。
第二步，将纤维针细管插入蚯蚓体腔。
纤维针选用长lcm，内径为0.5mm中空的纤维针细管。
第三步，用超声波仪震荡刺激蚯蚓。
选用的超声波仪频率为2服Hz 、功率为300W，震荡刺激蚯蚓。用超声波仪 震荡刺激蚯蚓的时间为1秒或2秒。目测溶液微黄后移去蚯蚓，用移液器收集 黄色细胞。
第四步，细胞记数和镜检。
加入12mL的Hank， s液清洗三次。4。C下离心20min，转速为250g mirf1， 除去上清液，加入RPMI-1640细胞培养液，进行细胞记数和镜检。
与现有技术相比，本发明的优点是纤维针结合超声波刺激法因为有直接 的、中空的通道与体腔相连接，当蚯蚓遭受超声波刺激时会在较短时间内迅速释 放大量的体腔细胞，且在短时间内超声波的轻微刺激不会对细胞造成损伤，成活 率较高，达到了90%以上，保证了以蚯蚓体腔细胞为实验对象的细胞流式技术的 单细胞凝胶电泳实验结果的准确性。
具体实施例方式
下面结合实施例作详细说明本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实 施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述 的实施例。
纤维针结合超声波刺激法在操作时一定要注意超声波刺激的时间，因为超声
波刺激时间如过长虽然获得的单位体重细胞数量多，但往往在超声波连续刺激的
作用下把最初已离体的蚯蚓体腔细胞致死，如只保证获取的离体细胞数量而没有
保证成活率，在蚯蚓细胞毒理实验中，对毒物毒性评价无法判断是否是因为毒物
的胁迫对蚯蚓体腔细胞造成了损伤，还是因为操作过程中，特别是提取蚯蚓体腔
细胞过程中已经对细胞造成损伤。因此，保证离体体腔细胞的成活率是保证后期
细胞毒理学实验结果的准确性，尽量减少实验误差的一个重要环节。
以下实施例中，所用的Hank' s液、RPMI-1640细胞培养液分别如下
Hank' s液
磷酸二氢钾 0.06g
氯化钠 8.0g
碳酸氢钠 0. 35g
氯化钾 0. 4g
葡萄糖 l.Og
磷酸氢二钠 0. 06g 加三蒸水H20至1000ml。然后高压灭菌，4'C下保存。
RPMI-1640细胞培养液
RPMI-1640 104g
H印es 2.38g
丙酮酸钠 0.1 lg
碳酸氢钠 2. Og
葡萄糖 2.5g
用三蒸水定容到1000ml溶解后，用0. 22 p m孔径的滤膜过滤除菌。分装成 每瓶200-250ml， 4 。C保存，可用1个月左右。
实施例1
将平均体重为300mg具有环带的健壮成体安德爱胜蚓(Eiseniaandrei)。清 肠24小时，用浓度为0. Olmol L—'、 pH7. 2的PBS缓冲液反复冲洗干净蚯蚓，加 3mL含有2. 5mM乙二醇-双-(2-氨基乙基)四乙酸(EGTA) PBS于10mL离心管，用 长lcm，内径为0.5mm中空的纤维针细管插入蚯蚓体腔后放入离心管。迅速用频 率为28KHz 、功率为300W的超声波仪震荡刺激蚯蚓1秒，可看到纤维针细管内 液体迅速变黄色，将细胞移入50mL离心管然后加入12mL的Hank' s液清洗三次。
4 。C下离心20tnin，转速为250g min—1，除去上清液，加入RPMI-1640细胞 培养液。台盼蓝染色法计算细胞存活率。
将血球计数板及盖片擦试干净，并将盖片盖在计数板上；将细胞悬液吸出少 许，滴加在盖片边缘，使悬液充满盖片和计数板之间，静置3min;镜下观察， 计算计数板四大格细胞总数，压线细胞只计左侧和上方的。然后按下式计算细 胞数/ml二4大格细胞总数/ 4X10000。
所得的细胞沉淀加入RPMI-1640细胞培养液，取一滴细胞液于载玻片上，用 甲醛固定3min，瑞氏染液染色、镜检(10X40)。计算得单位体重细胞数为4.60±0.05 (106个/ g)，成活率(％)为 97. 51±0. 87。
实施例2
将平均体重为300mg具有环带的健壮成体安德爱胜顿(Eiseniaandrei)。清 肠24小时，用浓度为O.Olmol L—'、 pH7. 2的PBS缓冲液反复冲洗干净蚯蚓，加 3mL含有2. 5mM乙二醇-双-(2-氨基乙基)四乙酸(EGTA) PBS于10mL离心管，用 长lcm，内径为0.5mm中空的纤维针细管插入蚯蚓体腔后放入离心管。迅速用频 率为28KHz 、功率为300W的超声波仪震荡刺激蚯蚓2秒，可看到纤维针细管内 液体迅速变黄色，将细胞移入50mL离心管然后加入12mL的Hank， s液清洗三次。
4 。C下离心20min，转速为250g min—、除去上清液，加入RPMI-1640细胞 培养液。台盼蓝染色法计算细胞存活率。
将血球计数板及盖片擦试干净，并将盖片盖在计数板上；将细胞悬液吸出少 许，滴加在盖片边缘，使悬液充满盖片和计数板之间，静置3min;镜下观察， 计算计数板四大格细胞总数，压线细胞只计左侧和上方的。然后按下式计算细 胞数/ml二4大格细胞总数/ 4X10000。
所得的细胞沉淀加入RPMI-1640细胞培养液，取一滴细胞液于载玻片上，用 甲醛固定3min,瑞氏染液染色、镜检(10X40)。
计算得单位体重细胞数为6.057± 0 . 044 (106个/ g)，成活率(％)为 97. 25±0. 10。
权利要求
1.一种蚯蚓体腔细胞提取方法，其特征在于包括以下步骤第一步，蚯蚓清肠；第二步，将纤维针细管插入蚯蚓体腔；第三步，用超声波仪震荡刺激蚯蚓第四步，细胞记数和镜检。
2. 根据权利要求1所述的蚯蚓体腔细胞提取方法，其特征是，所述蚯蚓为 安德爱胜蚓，预养一段时间，然后选择具有环带的健壮成体，平均体重在300mg 左右，蚯顿清肠24小时后，用PBS缓冲液反复冲洗干净蚯蚓，加入含有乙二醇-双-(2-氨基乙基)四乙酸的PBS。
3. 根据权利要求2所述的蚯蚓体腔细胞提取方法，其特征是，所述PBS缓 冲液浓度为O.Olmol lA pH7.2。
4. 根据权利要求2所述的蚯蚓体腔细胞提取方法，其特征是，所述加入含 有乙二醇-双-(2-氨基乙基)四乙酸的PBS，是指加入3mL含有2. 5mM乙二醇-双-(2-氨基乙基)四乙酸的PBS。
5. 根据权利要求1所述的蚯蚓体腔细胞提取方法，其特征是，所述纤维针 选用长lcm、内径为0.5mm中空的纤维针细管。
6. 根据权利要求2所述的蚯蚓体腔细胞提取方法，其特征是，所述超声波 仪频率为28KHz，功率为300W。
7. 根据权利要求2所述的蚯蚓体腔细胞提取方法，其特征是，所述超声波 仪震荡刺激蚯蚓的时间为1秒或2秒，目测溶液微黄后移去蚯蚓，用移液器收 集黄色细胞。
8. 根据权利要求1所述的蚯蚓体腔细胞提取方法，其特征是，所述细胞记 数和镜检，是指加入12mL的Hank， s液清洗三次，4。C下离心20min，除去上 清液，加入RPMI-1640细胞培养液，台盼蓝染色法计算细胞存活率。
9. 根据权利要求1所述的蚯蚓体腔细胞提取方法，其特征是，所述离心， 其转速为250g rain—全文摘要
一种生物工程技术领域的蚯蚓体腔细胞提取方法，包括以下步骤第一步，蚯蚓清肠；第二步，将纤维针细管插入蚯蚓体腔；第三步，用超声波仪震荡刺激蚯蚓第四步，细胞记数和镜检。本发明用纤维针结合超声波刺激法提取的蚯蚓体腔细胞的技术，保证所提取的离体细胞的数量和成活率，为进一步开展蚯蚓细胞毒理实验打下基础。
文档编号C12N5/06GK101343622SQ20081004248
公开日2009年1月14日 申请日期2008年9月4日 优先权日2008年9月4日
发明者江 朱, 陆贻通 申请人:上海交通大学