专利名称：具有降血压作用的地龙蛋白质及其制备方法
技术领域：
本发明涉及具有降血压作用的地龙蛋白质及其制备方法。
背景技术：
目前，临床上治疗高血压病的一线药物是血管紧张素转换酶抑制剂，大多属于普利(pril)系列，如卡托普利(captoril)、exapril、lisinapril等，是人工合成的含脯氨酸的二肽衍生物，制备这类药物存有工艺复杂的弊端。在我国，中药地龙(蚯蚓)作为降血压药物历史悠久，近年来仍不断见到有关的报道，如中国中西医结合肾病杂志2001年2月第2卷第2期第80页-82页报道的“蚯蚓提取物治疗肾实质性高血压的研究”一文，在这些报道中，使用的都是地龙的水煎剂，至今未见到揭示地龙中降血压成分化学本质这一难题的报道，这在一定程度上妨碍了地龙作为降血压药物的应用。
发明内容
本发明的第一个目的是提供具有降血压作用的地龙蛋白质；本发明的第二个目的是提供从地龙中制备具有降血压作用的地龙蛋白质的方法。
为了实现第一个目的，所提供的具有降血压作用的地龙蛋白质是将地龙的40℃-100℃的热水浸取液经过凝胶过滤、层析制得的分子量为2000-24000的蛋白质(肽)。
为了实现第二个目的，从地龙中制备具有降血压作用的地龙蛋白质的方法，依次包括以下的步骤1)制备地龙的水提取液按单位是g/ml的重量体积比将1份地龙加入到4份-20份蒸馏水中，在温度为100℃的条件下浸泡，浸泡时间不少于15分钟，制得地龙的水提取液；2)验证地龙的水提取液中含有蛋白质取地龙的水提取液，做12000g、4℃离心4分钟-6分钟去沉淀，200nm-800nm波长扫描，在扫描图的260nm处和280nm处有吸收峰，证明该地龙的水提取液中含有核酸和蛋白质；3)从地龙的水提取液中提取蛋白质取经过2)步骤离心去沉淀、验证含有蛋白质的地龙水提取液的上清液，上Sephadex G50柱，用流速为0.6ml-1.2ml/min的三蒸水洗脱，用试管收集洗脱液，将这些洗脱液进行200nm-800nm波长扫描，以马尿酰-甘氨酰-甘氨酸(HGG)或马尿酰-组氨酰-亮氨酸(HHL)为底物做血管紧张素转换酶(ACE)活性抑制试验，然后将具有抑制作用的收集液合并、在低于-15℃的条件下冻干，获得地龙蛋白质初提物，将地龙蛋白质初提物用高压液相层析(HPLC)进行氨基酸种类测定，结果证明含有门冬氨酸、谷氨酸、丝氨酸、甘氨酸、组氨酸、精氨酸、苏氨酸、丙氨酸、脯氨酸、酪氨酸、缬氨酸、蛋氨酸、胱氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸和赖氨酸，该地龙蛋白质初提物即是血管紧张素转换酶抑制剂(ACEI)；4)提纯蛋白质将地龙蛋白质初提物经过阴离子交换层析、疏水作用层析、亲和层析中的任何一种或两种层析，将地龙蛋白质提纯，并进一步进行质谱分析和氨基酸顺序测定。
上述1)步骤中的地龙，是洗净的干地龙或经三蒸水洗净、并用静电刺激排除腹腔液的鲜活地龙。
上述1)步骤中，之所以将地龙选择在温度为100℃的条件下、浸泡时间不少于15分钟来制得地龙的水提取液，是因为浸泡时间更长、如30分钟、45分钟、60分钟、75分钟、90分钟和105分钟的地龙水提取液中，经测试其蛋白质浓度与浸泡15分钟没有明显差异，对血管紧张素转换酶(ACE)的比抑制活力也非常相似，同时100℃、15分钟也能达到灭菌要求。
血管紧张素转换酶抑制剂(ACEI)的降血压原理是肾素-血管紧张素系统(renin-angiotensin system，RAS)在调节血压和体内水电平衡方面具有重要作用，而血管紧张素转换酶(ACE)又在该系统中起关键作用。首先，血管紧张素在肾素的作用下生成10个氨基酸残基的血管紧张素I(AngI)，AngI在ACE的作用下从C-末端水解掉组胺酰亮氨酸，生成具有升高血压作用的8个氨基酸残基的血管紧张素II(Ang II)，Ang II一方面与靶细胞受体结合，使小动脉平滑肌收缩增殖，血管壁增厚，外周阻力增加，另一方面还能使交感神经发放增加、醛固酮分泌增加、体内钠水潴留，最终导致血压升高。近年来的研究表明，人体局部组织Ang II浓度过高，可导致心肌细胞肥大、左心室肥厚、肾小球硬化，对高血压的发生起着重要作用。ACE的另一个天然底物是舒缓激肽(bridykinin)，舒缓激肽具有舒缓血管、降低血压的作用，但ACE使舒缓激肽从C-末端水解掉2个氨基酸残基后，产物便不再具有降低血压的作用。血管紧张素转换酶抑制剂(ACEI)一方面能抑制血管紧张素转换酶(ACE)的水解活性，降低了Ang II的生成，从而降低了血压，另一方面又抑制了ACE对舒缓激肽的作用，使舒缓激肽能持续发挥降血压作用。
本发明所提供的从地龙中制备具有降血压作用的蛋白质的方法，以对血管紧张素转换酶(ACE)的活性影响为指标来选取所提取的蛋白质，方法简便、快速。为了验证所制备的蛋白质在进入体内后具有降血压作用，对自发性高血压大鼠(SHR)进行了试验，结果是具有显著的降血压作用，无毒副作用，对患有高血压大鼠的心、肾等组织病变部分具有明显改善功能。
具体实施例方式
例1称取5g干地龙，洗净，置于带盖三角瓶内，加入三蒸水100ml，加热到100℃后持续煮20分钟，得地龙的水提取液，取地龙的水提取液做12000g、4℃离心4分钟-6分钟去沉淀，200nm-800nm波长扫描，以马尿酰-甘氨酰-甘氨酸(HGG)或马尿酰-组氨酰-亮氨酸(HHL)为底物，取0.2ml地龙水提取液的上清液做ACE活性影响试验，同时做SDS-PAGE电泳，考马斯亮兰染色，在确认具有ACEI作用后，用冻干机将此上清液冻干，称取0.5g，加入1ml三蒸水，用CTA purifer层析仪上Sephadex G50柱(1.8×70cm)层析，用流速为0.6ml-1.2ml/min的三蒸水洗脱，260nm波长、280nm波长扫描，按每试管1ml收集洗脱液，随之检测各试管的ACEI活性，并计算各试管的比抑制活力，该步较原上清液的比抑制活力提高20.1倍，将具有ACEI活性的各试管洗脱液合并、用冻干机冻干为白色粉末，该白色粉末即是地龙蛋白质初提物，经检验，该地龙蛋白质初提物中含有门冬氨酸4.21％、谷氨酸7.70％、丝氨酸2.59％、甘氨酸2.49％、组氨酸1.10％、精氨酸2.49％、苏氨酸1.94％、丙氨酸3.37％、脯氨酸2.09％、酪氨酸1.42％、缬氨酸2.46％、蛋氨酸0.62％、胱氨酸0.35％、异亮氨酸2.14％、亮氨酸3.73％、苯丙氨酸2.17％、赖氨酸4.74％，用该地龙蛋白质初提物做动物降血压试验并进行例2的分离纯化。
比抑制活力的计算方法是在以马尿酰-甘氨酰-甘氨酸(HGG)为底物时比抑制活力＝107.2×(标准管228nm吸光度-待测管228nm吸光度)/蛋白浓度；在以马尿酰-组氨酰-亮氨酸(HHL)为底物时，取在228nm每改变0.01nm为一个单位比抑制活力＝100×(标准管228nm吸光度-待测管228nm吸光度)/蛋白浓度；其中蛋白浓度(g/ml)＝1.5×280nm吸光度-0.74×260nm吸光度，或蛋白浓度(g/ml)＝0.75×280nm吸光度。
ACE活性检测方法如下1、溶液配制1)、0.05mol/L Tris-HCl缓冲液(pH7.1，内含0.1mol/L NaCl)；2)、14m mol/L底物缓冲液，称取41.06mg马尿酰-甘氨酰-甘氨酸(HGG)溶于10ml该缓冲液；3)、0.1mol/L HCl；4)、样品为具有ACEI活性的地龙洗脱液，浓度是0.01mg/ml；5)、血管紧张素转换酶(ACE)的制取将新鲜猪肺清洗后，剔除大血管、脂肪，切成碎块，加入温度为4℃、含0.25mol/L蔗糖的Tris-HCl缓冲液，该缓冲液的pH7.2，新鲜猪肺与该缓冲液的重量体积比按克∶毫升计为3∶10，匀浆8分钟，在温度为4℃的条件下9000g离心30分钟，得上清液，再在温度为0℃的条件下进行硫酸铵二级沉淀，第一级沉淀硫酸铵的浓度为1.6-2.0mol/L，放置2小时后3000g-4500g离心1小时，得上清液，第二级沉淀硫酸铵的浓度为2.1-2.6mol/L，放置10小时后15000g-25500g离心2小时，取沉淀进行透析，去掉硫酸铵得酶液，将该酶液上Sephadex G25凝胶柱，取酶峰部分再进行Q HyperD离子交换层析，用冻干机冻干后获得比活力为1300u-1400u/mg的酶制剂，该酶制剂即为血管紧张素转换酶(ACE)。
2、加样设待测管、对照管、标准空白管和标准对照管，在待测管和对照管内分别加入0.15ml的ACE、0.1ml的底物缓冲液和0.2ml的样品，在标准空白管和标准对照管内分别加入0.15ml的ACE、0.1ml的底物缓冲液和0.2ml的Tris-HCl缓冲液，各管充分混匀后，在温度为37℃的条件下水浴60分钟，然后再进行以下的步骤3、向对照管和标准对照管内加入1mol/L的HCl 0.25ml，反应5分钟终止；4、向各管内加入乙酸乙酯1.5ml，用震荡器强力混合15秒后，1250g离心5分钟，吸取上层0.5ml，移入对应的四种玻璃小试管内，在120℃-130℃的条件下蒸发15分钟，再分别向四种玻璃小试管内加入1mol/L NaCl 3.0ml，用震荡器强力混合15秒，放置15分钟后，再用1cm比色杯在UV-2501紫外分光光度计在228nm波长处测吸光度。
用例1置备的地龙蛋白质初提物做动物降血压试验的详细内容是试验动物成年健康雄性的自发性高血压大鼠SHR和wister大鼠、体重为200±10g，由上海斯莱克实验动物有限公司提供。
试验内容、方法及结果一、急性毒性试验序贯法测定地龙蛋白质的半数致死量，结果无明显毒副作用。
二、急性降血压试验1、麻醉取wister大鼠8只，称重后以3％戊巴比妥钠1ml/kg进行腹腔注射麻醉；2、气管插管在经麻醉的wister大鼠颈部作一切口，暴露气管，在气管两软骨环之间作一T形切口，将插管由该T形切口向胸腔方向插入气管内，再用细线结扎插管；3、颈总动脉插管在气管旁分离出颈总动脉，用细线结扎其远心端、用动脉夹夹住其近心端，在靠近远心端处插入用肝素冲洗过的留置针、并结扎固定；
4、以不同剂量舌静脉给药，观察血压的变化并记录，结果证明地龙蛋白质能明显降低正常wister大鼠的血压。
三、慢性降血压试验取自发性高血压大鼠SHR 24只，随机均分为模型组、高剂量组和低剂量组，另外取8只wister大鼠为正常对照组，四组均腹腔注射，每天一次，连续给药28天，其中的模型组和正常对照组给生理盐水、每日剂量为0.8g/kg，高剂量组和低剂量组给地龙蛋白质，前者每日剂量为0.8g/kg，后者每日剂量为0.4g/kg，给药后每间隔7天无创尾动脉法测血压，并且于末次给药10小时后，各组分别由颈总动脉取血，放射免疫分析法(radioimmunoassay，RIA)测定对血液、心肌和肾脏局部血管紧张素II(Ang II)、血浆醛固酮(Ald)、血浆内皮素(ET)、血浆前列环素(PGI2)的含量，具体数据如下1、地龙蛋白质对自发性高血压大鼠SHR血压的影响表1用药前基础血压
与正常对照组比较，★★P＜0.01表2用药14天的血压
与正常对照组比较，★★P＜0.01；与模型组比较，△P＜0.05；与低剂量组比较，▲P＜0.05。
表3用药28天的血压
与正常对照组比较，★★P＜0.01；与模型组比较，△P＜0.05；与低剂量组比较，▲P＜0.05。
表1、表2和表3的数据证明，地龙蛋白质能明显降低自发性高血压大鼠SHR的血压，与模型组比较有显著性差异。
2、地龙蛋白质对大鼠血管紧张素(Ang II)表达的影响表4地龙蛋白质对大鼠血浆血管紧张素II(Ang II)含量的影响
与正常对照组比较，★★P＜0.01；与模型组比较，△P＜0.05；与低剂量组比较，▲P＜0.05。
表5地龙蛋白质对大鼠心肌血管紧张素II(Ang II)含量的影响
与正常对照组比较，★★P＜0.01；与模型组比较，△P＜0.05；与低剂量组比较，▲P＜0.05。
表4、表5的数据证明，地龙蛋白质能明显降低自发性高血压大鼠SHR的血浆、心肌的血管紧张素(Ang II)的水平，与模型组比较有显著性差异。
3、地龙蛋白质对大鼠血浆前列环素表达的影响表6地龙蛋白质对大鼠血浆前列环素含量的影响
与正常对照组比较，★★P＜0.01；与模型组比较，△P＜0.05；与低剂量组比较，▲P＜0.05。
表7地龙蛋白质对大鼠肾脏组织前列环素含量的影响
与正常对照组比较，★★P＜0.01；与模型组比较，△P＜0.05；与低剂量组比较，▲P＜0.05。
表6、表7的数据证明，地龙蛋白质能提高自发性高血压大鼠SHR血浆和肾脏组织的前列环素的水平，与模型组比较有显著性差异。
4、地龙蛋白质对大鼠醛固酮表达的影响
表8地龙蛋白质对大鼠血浆醛固酮含量的影响
与正常对照组比较，★★P＜0.01；与模型组比较，△P＜0.05；与低剂量组比较，▲P＜0.05。
表9地龙蛋白质对大鼠肾脏组织醛固酮含量的影响
与正常对照组比较，★★P＜0.01；与模型组比较，△P＜0.05；与低剂量组比较，▲P＜0.05。
表8、表9的数据证明，地龙蛋白质能降低自发性高血压大鼠SHR血浆和肾脏组织的的醛固酮水平，与模型组比较有显著性差异。
5、地龙蛋白质对大鼠血浆内皮素表达的影响表10地龙蛋白质对大鼠血浆内皮素含量的影响
与正常对照组比较，★★P＜0.01；与模型组比较，△P＜0.05；与低剂量组比较，▲P＜0.05。
表10的数据证明，地龙蛋白质能降低自发性高血压大鼠SHR血浆内皮素的水平，与模型组比较有显著性差异。
6、通过HE染色观察地龙蛋白质对大鼠左心室肌细胞大小的影响自发性高血压大鼠SHR组的左心室肌细胞的面积、周长、最长直径(LD)和最短直径(SD)的增加非常显著，与wister组比较其差异有统计学意义(P＜0.01)，与高剂量组相比，高剂量组的左心室肌细胞的面积、周长、最长直径(LD)和最短直径(SD)则有明显下降(P＜0.01)，与低剂量组相比，低剂量组的左心室肌细胞的面积、周长、最长直径(LD)和最短直径(SD)下降较小(P＜0.05)。
表11地龙蛋白质对大鼠左心室重量的影响
与正常对照组比较，★★P＜0.01，★P＜0.05；与模型组比较，△P＜0.05；与低剂量组比较，▲P＜0.05。
表12地龙蛋白质对大鼠左心室重量指数的影响
与正常对照组比较，★★P＜0.01；与模型组比较，△P＜0.05；与低剂量组比较，▲P＜0.05。
7、通过电镜观察各组心肌超微结构的改变wister组心肌肌原纤维排列整齐、清晰，线粒体结构、闰盘结构正常；SHR对照组心肌纤维排列稀疏、紊乱，线粒体膜不完整，线粒体结构肿胀、破坏、呈空泡状间质纤维无增生；高剂量组心肌纤维排列稀疏、稍模糊、紊乱，但线粒体、内质网结构均正常；低剂量组部分线粒体结构正常，有的线粒体空泡变性，嵴断裂内质网结构正常。
例2用例1制取的地龙蛋白质初提物进行分离纯化1、阴离子交换层析(Anion exchange chromatography，IEX)层析柱为手动填装的DEAE-SepharoseTMFast Flow；缓冲液A选用50mmol/L Tris缓冲液，pH8.8；缓冲液B选用50mmol/L Tris缓冲液+1.0mol/LNaCl，pH8.8；洗脱梯度0→1mol/L NaCl；洗脱流速5ml/min；上样量2.0ml；收集速度1min/管；检测波长280nm，260nm；收集柱用例1制取的白色粉末为样品，用缓冲液A溶解，调节pH8.8；层析柱用缓冲液A平衡至基线稳定，上样后继续用缓冲液A冲洗至基线稳定，线性梯度洗脱100％A至100％B；收集柱分离后得到的组分进行ACE抑制活性的测定，该步较上步提纯4.1倍，并用SDS-PAGE进一步观察其纯度，收集具有ACE抑制活性的蛋白质洗脱峰，浓缩冻干为第一次纯化的白色粉末，储存于-20℃的环境中备用。
2、疏水作用层析(Hydrophobic interaction chromatography，HIC)层析柱为HiTrap Phenyl FF(high sub)；缓冲液A选用50mmol/L Tris缓冲液，pH7.0；缓冲液B选用50mmol/L Tris缓冲液+1.0mol/L(NH4)2SO4，pH7.0；洗脱梯度0.4mol/L→0(NH4)2SO4；洗脱流速1ml/min；上样量1.0ml；收集速度1min/管；检测波长280nm，260nm；收集柱用第一次纯化的白色粉末为样品，用缓冲液B溶解，调节pH7.0；层析柱用缓冲液A平衡至基线稳定，上样后继续用缓冲液A冲洗至基线稳定，线性梯度洗脱100％B至100％A；收集柱分离后得到的组分进行ACE抑制活性的测定，该步较上步提纯3.2倍，并用SDS-PAGE进一步观察其纯度，收集具有ACE抑制活性的蛋白质洗脱峰，浓缩冻干为第二次纯化的白色粉末，储存于-20℃的环境中备用。
例3称取鲜活赤子爱胜蚯(购于北京农业大学，人工饲养)15g，三蒸水洗净，利用静电刺激排除腹腔液，置于具塞三角瓶内，加三蒸水100ml，加热到100℃后持续煮15分钟，得地龙的水提取液，取地龙的水提取液做12000g、4℃离心6分钟去沉淀，200nm-800nm波长扫描，以下的步骤同例1。
例4对例1制取的地龙蛋白质初提物进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，人工取分子量在12000附近的条带进行基质辅助激光解析电离质谱(maldi-tof-ms)分析。以胰蛋白酶水解，并对其肽谱进行同源性序列比对，发现其序列与gi 456321，g-crystallin(clarias fuscus)有一定相似性。
例5称取干地龙50g，加入200ml三蒸水，匀浆，取等量分别置于具塞三角瓶内，在温度为4℃、24℃、40℃、60℃、80℃的条件下依次对应的浸泡8小时、6小时、4小时、2小时、1小时后，经12000g离心，取上清液在200nm-800nm波长扫描，分别做血管紧张素转换酶(ACE)活性抑制试验，证明在40℃以上时能获得较高的比抑制活力上清液。
权利要求
1.一种具有降血压作用的地龙蛋白质，其特征是将地龙的40℃-100℃的热水浸取液经过凝胶过滤、层析制得的分子量为2000-24000的蛋白质(肽)。
2.一种从地龙中制备具有降血压作用的地龙蛋白质的方法，其特征是依次包括以下的步骤1)制备地龙的水提取液按单位是g/ml的重量体积比将1份地龙加入到4份-20份蒸馏水中，在温度为100℃的条件下浸泡，浸泡时间不少于15分钟，制得地龙的水提取液；2)验证地龙的水提取液中含有蛋白质取地龙的水提取液，做12000g、4℃离心4分钟-6分钟去沉淀，200nm-800nm波长扫描，在扫描图的260nm处和280nm处有吸收峰，证明该地龙的水提取液中含有核酸和蛋白质；3)从地龙的水提取液中提取蛋白质取经过2)步骤离心去沉淀、验证含有蛋白质的地龙水提取液的上清液，上Sephadex G50柱，用流速为0.6ml-1.2ml/min的三蒸水洗脱，用试管收集洗脱液，将这些洗脱液进行200nm-800nm波长扫描，以马尿酰-甘氨酰-甘氨酸(HGG)或马尿酰-组氨酰-亮氨酸(HHL)为底物做血管紧张素转换酶(ACE)活性抑制试验，然后将具有抑制作用的收集液合并、在低于-15℃的条件下冻干，获得地龙蛋白质初提物，将地龙蛋白质初提物用高压液相层析(HPLC)进行氨基酸种类测定，结果证明含有门冬氨酸、谷氨酸、丝氨酸、甘氨酸、组氨酸、精氨酸、苏氨酸、丙氨酸、脯氨酸、酪氨酸、缬氨酸、蛋氨酸、胱氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸和赖氨酸，该地龙蛋白质初提物即是血管紧张素转换酶抑制剂(ACEI)；4)提纯蛋白质将地龙蛋白质初提物经过阴离子交换层析、疏水作用层析、亲和层析中的任何一种或两种层析，将地龙蛋白质提纯，并进一步进行质谱分析和氨基酸顺序测定。
3.根据权利要求2所述的从地龙中制备具有降血压作用的地龙蛋白质的方法，其特征是1)步骤中的地龙，是洗净的干地龙或经三蒸水洗净、并用静电刺激排除腹腔液的鲜活地龙。
全文摘要
一种具有降血压作用的地龙蛋白质是将地龙的40℃－100℃的热水浸取液经过凝胶过滤、层析制得的分子量为2000－24000的蛋白质(肽)。从地龙中制备具有降血压作用的地龙蛋白质的方法，包括以下的步骤制备地龙的水提取液、验证地龙的水提取液中含有蛋白质、从地龙的水提取液中提取蛋白质、提纯蛋白质。这种从地龙中提取具有降血压作用的蛋白质的方法，以对血管紧张素转换酶(ACE)的活性影响为指标来选取所提取的蛋白质，方法简便、快速，所提取的蛋白质不但具有显著的降血压作用，无毒副作用，并且对患有高血压大鼠的心、肾等组织病变部分具有明显改善功能。
文档编号C07K1/34GK101020714SQ20071001378
公开日2007年8月22日 申请日期2007年3月12日 优先权日2007年3月12日
发明者唐胜建, 任维栋, 唐彬 申请人:唐胜建