Cul4蛋白的应用

Cul4蛋白的应用
【专利摘要】本发明提供了Cul4蛋白的应用，属于基因治疗技术领域。本发明通过在酵母中过表达Rtt101蛋白，相当于人类的Cul4蛋白，发现其能够抑制Eco1基因缺失而引起的生长缺陷。因此本发明提供了Cul4蛋白在制备治疗ESCO2(Eco1在人细胞中的同源蛋白为ESCO1和ESCO2)基因突变、缺失或ESCO2蛋白功能缺失引起的遗传疾病药物中的应用，进而治疗ESCO2基因突变、缺失或ESCO2蛋白功能缺失引起的相关遗传疾病，例如罗伯茨综合症，具有良好的临床应用前景，且能够取得显著的社会效益。
【专利说明】
Cu 14蛋白的应用
技术领域
[0001 ] 本发明属于基因治疗技术领域，具体地说，涉及Cul4蛋白（包括Cul4A和Cul4B)及 其在治疗ESC02基因功能缺失而引起的生长缺陷中的应用。
【背景技术】
[0002] DNA复制是一切生命活动的基础，约40种疾病的产生和DNA复制相关，目前至少有 14种药物靶向作用于DNA复制过程中的蛋白。研究DNA复制与人类疾病的关系能从深层次挖 掘疾病发生的机制，为新药研发和疾病治疗提供理论基础。遗传物质的正确传递对基因组 的稳定性至关重要，姐妹染色单体粘连在其中发挥不可或缺的作用。
[0003] 姐妹染色单体粘连(sister chromatid cohesion，SCC)是两条姐妹染色单体结合 在一起建立粘连并解离的过程，其过程受到严格调控，SCC的建立对于姐妹染色单体的分离 和遗传物质的正确传递具有重要的意义。SCC功能的发挥主要依靠粘连蛋白及其调节蛋白 共同完成，其中粘连蛋白是由Smcl，Smc3,Sccl和Scc3构成的四元环状复合物。在细胞周期 的Gl期，粘连蛋白结合到染色体上，此时在负调控因子的作用下，结合是不稳定的，环形的 粘连蛋白会在染色体上进行滑动；随着细胞周期的行进，细胞进入S期，乙酰转移酶Ecol将 粘连蛋白的Smc3亚基进行乙酰化，乙酰化后的粘连蛋白稳定结合在染色体上;在G2期，姐妹 染色单体粘连稳定建立，并能拮抗负调控因子的作用;细胞进入有丝分裂期的后期以后，分 离酶将粘连蛋白的Sccl亚基进行切割，粘连蛋白从染色体上脱离，去乙酰化酶Hosl对Smc3 进行去乙酰化，两条姐妹染色单体被分向两个子细胞的两极，确保遗传物质的稳定性。SCC 不仅参与DNA复制，DNA损伤修复等多种生物学过程也需要SCC的参与。已有文献报道，当SCC 的建立发生问题后，将会造成包括黑色素瘤，结肠癌，胚胎癌，乳腺癌，前列腺癌等在内的多 种严重疾病的发生。研究SCC的建立和疾病的关系，将会给治疗多种遗传疾病带来新的希 望。
[0004] 姐妹染色单体粘连的建立需要乙酰转移酶Ecol参与其中。Ecol首次发现是在酵母 突变体中，此突变体表现出染色体丢失率提高，且在异染色质重组过程中也有缺陷。随后， Ecol相继在其它生物中被发现，并且都是必需基因。通过对不同物种中Ecol的序列进行比 对发现不同物种的N端长度有所不同，但是其C端序列非常保守，为乙酰转移酶活性中心。缺 失乙酰转移酶活性的细胞会产生大量的姐妹染色单体粘连缺陷，继而导致死亡，表明Ecol 的主要功能是其乙酰转移酶的作用。
[0005] 在人细胞中，存在两种Ecol的同源蛋白ES⑶1和ESC02,此两种蛋白都可以对Smc3 进行乙酰化，但它们的功能也有所不同，并非完全冗余。不管缺失哪个ESCO蛋白，另一个蛋 白均无法完全回补其所引起的缺陷。ESC02突变后会导致一种发育失常疾病，称为罗伯茨综 合症（Roberts syndrome，RBS)。罗伯茨综合症（Roberts Syndrome)是由并且仅仅由ESC02 基因的突变导致的疾病，症状包括患者生长迟缓、肢体发生畸形、手畸形、颅面骨畸形等，还 会引起心脏、肾、生殖器及头发的异常。
[0006] ESC02基因的转录产物有3376个核苷酸，成熟的mRNA由1806个核苷酸组成，编码 601个氨基酸。ESC02蛋白N端含有与染色质结合的结构域，C端具有乙酰转移酶活性。ESC02 突变会导致罗伯茨综合症。除两例外，大部分突变都是移码突变或者无义突变，造成蛋白质 截短或者无功能的蛋白质。另外两例属于错义突变，由于乙酰转移酶结构域高度保守的氨 基酸残基被替代，造成乙酰转移酶活性丧失。在人细胞中，ESC02是建立染色单体粘连所必 需的。
[0007] DNA的复制和修复过程受到泛素化修饰的调节，尤其是受到Cullin 4(Cul4)-RING E3泛素连接酶的调控。所有的Cullin通过C-端区域与RING finger protein Rbxl/Hrtl相 互作用，然后招募E2泛素结合酶。Cul I in的N-端结构域分别与不同种类的底物特异的接头 蛋白（adaptor)相互作用。人基因组表达两种Cul4的同源蛋白：Cul4A蛋白和Cul4B蛋白，它 们通过N-端区域与Ddbl蛋白相互作用，然后Ddbl蛋白与各种底物特异的接头蛋白相互作 用。这些接头蛋白（adaptor)叫做DCAFs(Ddbl_Cul4associated factors)。但是，对于DNA复 制和修复中泛素化底物以及DCAFs参与的调节机制尚不清楚。
[0008] 目前常用的基因治疗方法有两种：一种方法是"体外法"，即将外源基因导入体外 培养的受体细胞，经过适当的筛选方法，把重组的受体细胞回输患者体内，让外源基因表达 发挥作用，以缓解患者症状。另一种称为"体内法"，指直接将外源DNA注射至机体内，DNA可 以单纯注射，也可以与辅助物如脂质体一起注射，使外源基因在体内转录、翻译而发挥治疗 作用。体内法的基因治疗方式比体外法简单、直接、经济，疗效也比较确切。常用的方式有病 毒介导、寡核苷酸直接注射、脂质体介导和体内基因直接注射等。
[0009] 现有技术中，涉及Cul4蛋白的研究主要体现在通过降低Cul4B的活性，从而抑制肿 瘤细胞的生长（专利号CN201210313850.8，CN201380055020.2)。没有涉及Cul4蛋白在ESC02 基因缺陷引起的遗传疾病方面的研究报道。

【发明内容】

[0010] 本发明的目的是针对目前的基因疗法存在靶向性不够精确、需要开发更多的治疗 基因以获得更好的疗效的现状，提供与ESC02突变引起的遗传疾病相关的基因及其应用。
[0011] 为实现本发明的目的，本发明通过在酵母中过表达RttlOU相当于人类的Cul4蛋 白），发现过表达Cul4蛋白能够抑制Ecol基因缺失而引起的生长缺陷。
[0012] 进而，本发明提供了Cul4蛋白在制备治疗ES⑶2基因突变、缺失或ES⑶2蛋白功能 缺失引起的疾病药物中的应用，所述Cul4蛋白含有如SEQ ID NO. 1所示的氨基酸序列或含 有如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列。
[0013] 上述应用中，所述的疾病为罗伯茨综合症。
[0014]本发明提供了编码Cul4蛋白的基因在制备治疗ESC02基因突变、缺失或ESC02蛋白 功能缺失引起的疾病药物中的应用，所述编码Cul4蛋白的基因含有如SEQ ID NO.3所示的 核苷酸序列或含有如SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列。
[0015] 上述应用中，所述的疾病为罗伯茨综合症。
[0016] 本发明提供了一种蛋白过表达促进剂在制备ESC02基因突变、缺失或ESC02蛋白功 能缺失引起的疾病治疗药物中的应用，所述蛋白含有Cul4A蛋白或Cul4B蛋白；所述Cul4A蛋 白含有如SEQ ID NO. 1所示的氨基酸序列；所述Cul4B蛋白含有如SEQ ID NO.2所示的氨基 酸序列。
[0017] 上述应用中，所述的疾病为罗伯茨综合症。
[0018] 本发明提供了含有Cul4蛋白编码基因的生物材料在制备治疗ES⑶2基因突变、缺 失或ESC02蛋白功能缺失引起的疾病药物中的应用，所述Cul4蛋白编码基因含有如SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列或含有如SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列。
[0019]上述应用中，所述的生物材料为表达载体或宿主细胞。所述的疾病为罗伯茨综合 症。
[0020] 本发明还提供了含有Cul4蛋白或其编码基因的药物，所述Cul4蛋白含有如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列或含有如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列；Cul4蛋白编码基因含有 如SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列或含有如SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列。
[0021] 本发明能够解决目前的基因疗法存在的不足:靶向性不够精确；需要开发更多的 治疗基因以获得更好的疗效。本发明中发现Cul4基因可作为新的治疗基因，具有广阔的前 景。本发明发现在酵母中过表达RttlOl能够抑制Ecol基因缺失而引起的生长缺陷（图1)，同 时也可以回补由于Ecol基因缺失而引起的Smc3乙酰化水平的下降（图2)。这一机制在真核 生物中是保守的。因此，对于ESC02基因功能缺陷引起恶性罗伯茨综合症的患者，本领域技 术人员可以通过以下技术方案实现该疾病的治疗：（1)在体细胞内导入Cul4基因（包含 Cul4A和/或Cul4B基因），利用病毒方法或非病毒方法两种方式之一。病毒方法可以采用将 Cul4构建至腺病毒载体中，非病毒方法可以将外源DNA片段直接导入至细胞中。使Cul4蛋白 在患者体内过表达，以抑制ESC02基因功能缺陷，达到治疗的目的。（2)直接注射Cul4重组蛋 白，弥补ESC02基因功能缺陷。构建表达Cul4重组蛋白质粒，令Cul4重组蛋白大量表达，对表 达的Cul4重组蛋白进行纯化，将纯化后的Cul4蛋白直接注射至罗伯茨综合症患者体内。
【附图说明】
[0022]图1为过量表达泛素连接酶复合物Rttl01Mmsl的RttlOl亚基能抑制ecol-Ι突变体 的高温生长缺陷示意图。用梯度稀释实验观察各突变菌株在25°C，30°C，34°C，37°C的生长 情况。实验结果显示，过量表达Rtt 101使在30°C，34°C，37°C致死的突变体得以正常生长。 AD-Ecol为正对照。
[0023]图2为过量表达泛素连接酶复合物Rttl01Mmsl的RttlOl亚基能修复ecol-Ι突变体 中Smc3的乙酰化缺陷示意图，野生型和各突变体菌株中通过TCA提取的全细胞蛋白分别用 图中所示抗体进行免疫印迹(Western Blot)检测。结果显示在eco 1-1突变体中过量表达 Rtt 101时，可将突变体中较低量的Smc3乙酰化回补至与野生型同一水平。其中Western Blot结果以微管蛋白（Tubulin)作为上样量对照。AD为载体pGADT7的简称，指在酵母细胞中 表达了PGADT7的空载体作为对照。AD-RttlOl为载体pGADT7-Rttl01的简称，在酵母细胞中 表达了 pGADT 7 -Rt 1101作为实验组。a -a c-Smc 3指识别Smc 3乙酰化的抗体，a -Smc 3指识别 Smc 3的抗体，a -Tubu I i η指识别Tubu I i η的抗体。
[0024] 图3为人细胞ESC02与酵母Ecol蛋白序列比对结果图，ESC02和Ecol在NCBI中gi号 分别为gi62899035和gil4318550,从图中可以看出此两种蛋白N端变化较大，但是C端乙酰 转移酶结构域非常保守(ESC02 534-601位氨基酸，Ecol 211-281位氨基酸）。
【具体实施方式】
[0025]以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例 中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。
[0026] 下列实施例中，Phusion高保真聚合酶购自Thermo fisher，Pfu购自全式金生物公 司，Tag聚合酶购自Takara公司，限制性内切酶购买自NEB公司，T4连接酶购买自NEB公司， pRS313，pRS316，pGADT7，pAG25购自Addgene，引物由生工生物公司合成。
[0027]实施例1 ecol-Ι突变体菌株的构建
[0028] 1、构建酿酒酵母中乙酰转移酶Eco 1的表达载体:pRS316-EcoI，pRS313-Eco 1
[0029] pRS316是以URA为营养筛选标记的酵母表达载体，
[0030] PRS313是以HIS为营养筛选标记的酵母表达载体
[0031 ] (1)以酿酒酵母（3&(^11&1'〇1115^6 8。6代￥181&6)13￥4741的基因组0嫩为模板，用？;1^11 聚合酶PCR扩增Ecol目的片段：
[0032] Ecol-F:5 '-CGCGGATCCCAATTTGATCTTTTTATAAA-3 '；
[0033] Ecol-R:5 '-CCGGAATTCTCATATGTATACCGGCAATA-3 '
[0034]然后用多功能DNA纯化试剂盒回收PCR产物。
[0035] (2)用BamHI和EcoRI双酶切Ecol目的片段和载体pRS316。反应体系：反应缓冲液5μ L，分别加入BamHI和EcoRI 1.5yL，DNA2yg，加水至50yL，37 °C酶切2小时。
[0036] (3)电泳，用胶回收试剂盒回收酶切产物。
[0037] (4)取3yL回收产物进行电泳，估测DNA浓度。设置连接反应体系：载体lOOng，目的 片段（目的片段与载体摩尔比为3:1-10:1)，了40嫩连接酶以1^，加水至1(^1^，16°(：过夜连接。 [0038] (5)取5yL连接产物转化大肠杆菌DH5a，涂布于LB固体培养基(含氨苄霉素），37°C 倒置培养16小时。
[0039] (6)挑取菌落至5mL LB液体培养基(含氨苄霉素）中，37°C、220rpm培养12小时。
[0040] (7)用碱裂解法提取质粒。
[00411 (8)将质粒进行酶切鉴定，反应体系为:反应缓冲液IyL，BamHI和EcoRI各0.5yL，质 粒3yL，加水至I OyL，37 °C酶切1小时，电泳检测大小。
[0042] (9)将酶切正确的质粒送测序，得到正确的pRS316-Ecol载体，pRS313-Ecol载体的 构建与pRS316-Ecol载体的构建方法相同。
[0043] 2、构建酿酒酵母中乙酰转移酶Ecol突变体ecol-Ι的表达载体
[0044] pRS313-ecol-l
[0045] (1)设计突变位点引物。点突变引物为：
[0046] ecol-l(G211D)-F：
[0047] 5-CCCGATTTTAAGATTGACATATCGAGAATTTGGGTGTG-3'；
[0048] ecol-l(G211D)-R：
[0049] 5-CCAAATTCTCGATATGTCAATCTTAAAATCGGGGTAC-3'〇
[0050] (2)以口1^3161(：〇141^3131(3〇1为模板，进行？0?。设置？0?反应体系 ：5\冊 Buff erl OyL ;dNTPs( IOmM) IyL; Temp late (5_5〇ng) IyL;上述上下游引物各 0 · f5yL; Phus ion 高 保真聚合酶0.5yL;DMS0 1.5yL加 H2O至50yL。注意Phusion聚合酶需要热启动，应最后加入， 加入后立即反应。反应程序:98 °C 5分钟；98 °C 10秒，58 °C 30秒，7 2 °C 4分钟（延伸时间=模板 长度/2kb/分钟），17个循环;72°C 20分钟;采用如上PCR体系和程序进行PCR扩增。
[0051 ] (3)取IOyL PCR产物加入IyL DpnI，37°C消化模板（因为质粒DNA存在甲基化修饰， 而PCR产物没有甲基化修饰，而DpnI只作用于存在甲基化修饰的DNA)。
[0052] (4)将消化后的体系取5yL转化DH5a，将转化子提取质粒并测序。得到正确的 pRS313-ecol-l 载体。
[0053] 3、运用Plasmid Shuffling实验获得ecol-Ι突变菌株
[0054]因乙酰转移酶对于酿酒酵母的生长是必需的，因此对基因组上的ECOl基因进行改 造时，需提前转入一个能够表达Ecol蛋白的质粒。
[0055] (l)pRS316_Ecol 和 pRS313-ecol_l 质粒的酵母转化
[0056] 1)以酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)BY4741作为背景菌株接入液体培养 基中，30°C 培养至 2X107 个细胞/mL (0D600 = 1.0)。
[0057] 2)5mL的培养菌液以2500g，30s的离心条件将细胞收集至无菌1.5mL离心管中，去 掉上层液体培养基。
[0058] 3)将细胞悬浮于ImL无菌超纯水中，再以2500g，30s的离心条件将细胞收集于离心 管中，去掉上清。
[0059] 4)将细胞悬浮于ImL 0.1mol/L乙酸锂溶液中，再以2500g，30s的离心条件将细胞 收集于离心管中，去掉上清。
[0060] 5)将ImL单链载体DNA样品煮沸5min，快速在冰水中冷却。
[0061 ] 6)在离心后的细胞上层添加转化混合液，转化混合液组成如下，按下列顺序添加： PEG3350(50%W/V)240yL，lmol/L LiOAc(乙酸锂）36yL，单链载体DNA(2mg/mL)50yL，需转化 的 pRS316-Ecol 和 pRS313-ecol-l 各 IyL,无菌超纯水 32yL，总体积 360yL。添 [0062] 7)以2500g，30s的离心条件将细胞收集于离心管中，去掉上清。
[0063] 8)将细胞悬浮于ImL无菌超纯水中，再以2500g，30s的离心条件将细胞收集于离心 管中，去掉上清。
[0064] 9)将细胞悬浮于IOOyL无菌超纯水中，均匀涂抹于SC-URA-HIS固体培养基上，30°C 倒置培养24-72h，即可得到带有pRS316-Ecol和pRS313-ecol-l质粒的菌株：BY4741 pRS316-EC01pRS313-eco卜1〇
[0065] (2)利用同源重组对基因组上的ECOl进行敲除
[0066] 1)以pAG25质粒为模板，设计5'末端含有目标序列位置上下游各39nt同源臂的一 对引物，PCR扩增该置换片段。所用引物如下：
[0067] ecol-del-F:
[0068] 5 '-ACATATTAGGGTTCAACAGAATATAAATCGTTGCACAAAACATGGAGGCCCAGAATACCCT-3 '；
[0069] ecol-del-R:
[0070] 5 '-ATTTTTCCAGTGTCCCTTCTCGCTGTCTTTTCGAAAGAGCAGTATAGCGACCAGCATTCAC-3 '。
[0071] 2)以pAG25质粒为模板，用Tag聚合酶PCR扩增能同源替换基因组上ECOl的带有表 达NAT抗性的目的片段。PCR反应体系：2 X Tag聚合酶25yL; Temp late (5-50ng) IyL; Pr imer F 2yL;Primer R 2yL;;加 H2O至50yL。反应程序：95°C5分钟；95°C1 分钟，58°C30秒，72°C2分钟 (延伸时间=模板长度/lkb/分钟），30个循环；72°C20分钟；采用如上PCR体系和程序进行 PCR扩增。
[0072] (3)利用上述酵母转化的方法将PCR得到的目标片段转入BY4741 pRS316-Ecol pRS313-ecol-l菌株中。均匀涂抹于SC-URA-HIS+NAT的固体培养基，倒置培养。挑取转化子 单菌落，划线于新固体平板上。挑取菌体，快速提取酵母基因组，PCR鉴定DNA片段是否发生 置换。最后得到基因组上ECOl敲除的菌株:BY4741 ecolA::NAT pRS316-Ecol pRS313-ecol-1〇
[0073] (4)运用Plasmid Shuffling实验获得ecol-1突变菌株。5-氟乳清酸（5-F0A)是作 为一种负筛选药物，在酵母细胞能表达URA3时，URA3基因编码的酶可以使5-F0A变成对细胞 有毒性的物质，使酵母细胞在含5-F0A的培养基上不能生长。而上述实验提到的pRS316-Eco 1质粒可表达URA3，因此通过加入5-F0A可筛选到pRS316-Eco 1丢失的菌株。
[0074] 将上述步骤得到的菌株：BY4741 ecol Δ : :NAT pRS316-EcolpRS313-ecol-l划在 SC-HIS+5-F0A的平板上进行筛选，得到的菌株即为乙酰转移酶缺陷突变体ec〇l-l:BY4741 ecolA：：NAT pRS313-ecol-l〇
[0075] 实施例2泛素连接酶RttlOrfcsl的亚基RttlOl回补乙酰转移酶缺陷突变体ecol-1 的鉴定
[0076] 1、泛素连接酶RttlOrfcsl回补乙酰转移酶缺陷突变体ecol-Ι的相关载体?6六0丁7-Eco I、pGADT7-Rtt 101 的构建
[0077] pGADT7是以LEU为营养筛选标记的酵母表达载体
[0078] (1)以酿酒酵母(Saccharomycescerevi s iae)BY4741 的基因组 DNA 为模板，用Pf u 聚 合酶PCR扩增EcoURttlOl的目的片段。
[0079] 所用引物序列如下：
[0080] Ecol-2-F:5 '-CCGGAATTCATGAAAGCTAGGAAATCGCA-3 '
[0081 ] Ecol-2-R:5 '-CGCGGATCCTCATATGTATACCGGCAATA-3 '
[0082] RttlOl-F:5 '-TCCCCCCGGGACAGGAACAATGATAAATGAGAG-3 '
[0083] Rttl01-R:5'_
[0084] ACGCGTCGACTCGAGAGATGGCACCAGTCTTAGTAC-3 '
[0085] 然后用多功能DNA纯化试剂盒回收PCR产物。
[0086] (2)用BamHI和EcoRI双酶切目的片段ECOl和载体pGADT7。反应体系：反应缓冲液5μ L，分别加入BamHI和EcoRI 1.5yL，DNA 2yg，加水至50yL，37 °C酶切2小时。
[0087] (3)用XmaI和XhoI双酶切目的片段RttlOl和载体pGADT7。反应体系：反应缓冲液5μ L，分别加入XmaI和Xho 11 · 5yL，DNA2yg，加水至50yL，37 °C酶切2小时。
[0088] (4)电泳，用胶回收试剂盒回收酶切产物。
[0089] (5)取3yL回收产物进行电泳，估测DNA浓度。设置连接反应体系：载体lOOng，目的 片段（目的片段与载体摩尔比为3:1-10:1)，了40嫩连接酶以1^，加水至1(^1^，16°(：过夜连接。
[0090] (6)取5yL连接产物转化大肠杆菌DH5a，涂布于LB固体培养基(含氨苄霉素），37°C 倒置培养16小时。
[0091] (7)挑取菌落至5mLLB液体培养基(含氨苄霉素）中，37°C、220rpm培养12小时。
[0092] (8)用碱裂解法提取质粒。
[0093] (9)将质粒进行酶切鉴定，l)pGADT7-Ecol反应体系为：反应缓冲液IyUBamHMP EcoRI各0.5yL，质粒3yL，加水至IOyL，37 °C酶切1小时，电泳检测大小。2 )pGADT7-Mms 1反应 体系为:反应缓冲液IyL，XmaI和Xho I各0.5yL，质粒3yL，加水至I OyL，37 °C酶切1小时，电泳 检测大小。
[0094] (10)将酶切正确的质粒送测序，得到正确的pGADT7-Ecol、pGADT7-Rttl01载体。构 建得到泛素连接酶RttlOrfcsl回补乙酰转移酶缺陷突变体ecol-Ι的相关载体pGADT7-Ecol、 pGADT7-Rttl01〇
[0095] 2、泛素连接酶复合物Rttiorfcl回补乙酰转移酶缺陷突变体ecol-1的菌株构建 [0096]利用酵母转化的方法将步骤1中得到的表达载体转入实施例1制得的乙酰转移酶 缺陷突变体ecol-Ι中即：BY4741 ecolA : :NATpRS313-ecol-l中，最后得到泛素连接酶复合 物亚基的过量表达回补菌株。
[0097] 1)以实施例1制得的乙酰转移酶缺陷突变体ecol-Ι中即：BY4741ecol Δ : :NAT pRS313-ecol-l作为背景菌株接入液体培养基中，30°C培养至2\107个细胞/111以00600 = 1.0)〇
[0098] 2)5mL的培养菌液以2500g，30s的离心条件将细胞收集至无菌1.5mL离心管中，去 掉上层液体培养基。
[0099] 3)将细胞悬浮于ImL无菌超纯水中，再以2500g，30s的离心条件将细胞收集于离心 管中，去掉上清。
[0100] 4)将细胞悬浮于ImL 0.1mol/L乙酸锂溶液中，再以2500g，30s的离心条件将细胞 收集于离心管中，去掉上清。
[0101] 5)将ImL单链载体DNA样品煮沸5min，快速在冰水中冷却。
[0102] 6)在离心后的细胞上层添加转化混合液，转化混合液由组成如下，按下列顺序添 加：PEG3350(50%W/V)240μL，lmol/LLi0Ac(乙酸锂）36μL，单链载体DNA(2mg/mL)50μL，需 转化的PGADT7，pGADT7-Eco 1，或pGADT7-Rtt 101 IyL，无菌超纯水32yL，总体积360yL。添加 完成后剧烈震荡至整个体系完全混匀，置于冰上3min。
[0103] 7)42。(：热激4〇11^11。
[0104] 8)以2500g，30s的离心条件将细胞收集于离心管中，去掉上清。
[0105] 9)将细胞悬浮于ImL无菌超纯水中，再以2500g，30s的离心条件将细胞收集于离心 管中，去掉上清。
[0106] 10)将细胞悬浮于IOOyL无菌超纯水中，均匀涂抹于SC-HIS-LEU固体培养基上，30 °(：倒置培养24-72h。
[0107] 11)挑取转化子单菌落，划线于新固体平板上。
[0108] 12)同时在乙酰转移酶Eco 1功能正常的细胞中（即背景菌株
[0109] 13)最后得到泛素连接酶复合物亚基的过量表达回补菌株。即
[0110] BY4741 ecolΔ ::NAT pRS313-ecol-l pGADT7;
[0111] BY4741 ecolΔ ::NAT pRS313-ecol-l pGADT7-EC01;
[0112] BY4741 ecolΔ ::NAT pRS313-ecol-l pGADT7-RTT101;
[0113] 3、通过免疫印迹实验检测泛素连接酶RttlOl对乙酰转移酶缺陷突变体ecol-1的 回补。
[0114] (I)TCA-丙酮法提取酵母细胞总蛋白收集50D的酵母细胞，用ImL 0.25mol/L NaOH，1 巯基乙醇重悬菌体，用移液器吹打均匀，冰上放置IOmin。加入160yL 50%TCA溶 液，振荡混勾后置冰上IOmin。以15000g转速、4°C离心10min，除尽上清。用ImL预冷丙酮重悬 沉淀，使用微量移液器吹打至沉淀至其充分分散，以15000g转速、4°C离心10min，除尽上清。 将沉淀在60°C烘箱中烘干，用I X SDS蛋白加样缓冲液悬浮沉淀，沸水浴5min。其中I X SDS蛋 白加样缓冲液组分:Tri s-Cl (pH6 · 8) 50mmo 1/L，SDS 2 %，溴酚0 · 1 %，甘油10 %，β-巯基乙醇 IOOmM0
[0115] (2)免疫印迹将上述样品进行8 %的SDS-PAGE凝胶分离。将完成电泳的SDS-PAGE凝 胶放置于转膜缓冲液中平衡。裁取与凝胶等大的PVDF膜，甲醇中浸泡Imin激活后，置于转膜 缓冲液中平衡。打开夹板，将黑色夹板一侧浸泡于转膜缓冲液中，从下到上分别放置已浸泡 过的海绵垫和两张合适大小的滤纸。整个部分浸没于转膜缓冲液中，防止气泡产生。在滤纸 上以从下到上的顺序放置，凝胶、PVDF膜和两张浸泡过的滤纸。整个动作浸没于转膜缓冲液 中以防止气泡产生。最后放置浸泡过的海绵垫于最上层，收紧闭合转膜夹板，对准电极，插 入转膜槽中。250mA，Ih，4°C转膜电泳。转膜完成后，取出PVDF膜，置于用PBST配制的5 %脱脂 牛奶中，室温封闭lh。去掉封闭液，将抗体用PBST配制的2%脱脂牛奶稀释至合适浓度，室温 孵育 Ih。（anti-ac_Smc3，anti_Smc3，ant i-Tubul in)去掉一抗液，室温下用PBST 洗 PVDF膜 3 次，每次lOmin。将相应二抗用PBST配制的2%脱脂牛奶稀释至合适浓度，室温孵育lh。去掉 二抗孵育液，室温下用I 3BST洗PVDF膜3次，每次lOmin。将ECL显色液A、B等量混合后，与PVDF 膜室温反应3min，去掉膜上多余显色液，将PVDF膜封好后固定在暗匣中，暗室曝光显影。结 果见图2。
[0116] 实施例3酵母中过表达RttlOU相当于人类的Cul4蛋白）能够抑制Ecol基因缺失 而引起的生长缺陷
[0117] 用实施例2中得到菌株进行梯度敏感实验。即：
[0118] BY4741 ecolΔ ::NAT pRS313-ecol-l pGADT7;
[0119] BY4741 ecolΔ ::NAT pRS313-ecol-l pGADT7-EC01;
[0120] BY4741 ecolΔ ::NAT pRS313-ecol-l pGADT7-RTT101;
[0121] 具体操作如下：
[0122] I)将上述菌株过夜培养，实验当天对细胞进行计数，并将所有实验菌株的细胞浓 度用水调至2 X IO6个细胞/mL。
[0123] 2)吸取250微升各实验菌株细胞，滴加到96孔板第一列，用多通道微量移液器在96 孔板第二列至第五列滴加200微升灭菌超纯水。
[0124] 3)从96孔板第一列至第六列共设五个稀释度，使用多通道微量移液器从第一列吸 取50微升的细胞至第二列充分混匀，再从第二列吸取50微升细胞至第三列，以此步骤进行5 倍的梯度稀释。
[0125] 4)使用多通道微量移液器吸取从各稀释度吸取5微升细胞滴加至-HIS-LEU平板 上，每个稀释度滴加的酵母斑点之间的距离为1.5復。温度梯度平板分别在25°(：，30°(：，34 1€ 和37 °C进行培养。
[0126] 5)在培养48小时后进行拍照记录实验结果，结果见图1。图1为过量表达泛素连接 酶复合物RttlOl fcsl的RttlOl亚基能抑制ecol-Ι突变体的高温生长缺陷示意图。用梯度稀 释实验观察各突变菌株
[0127] 因为染色单体粘连(SCC)的机制从酵母到人都是保守的，人乙酰化Smc3的乙酰化 酶ESC02和酵母中的Ecol也是高度保守的（图3)，所以该结果可以运用到由人类ESC02引起 的疾病治疗。
[0128]虽然，上文中已经用一般性说明、【具体实施方式】及试验，对本发明作了详尽的描 述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见 的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的 范围。
【主权项】
1. Cul4蛋白在制备治疗ESC02基因突变、缺失或ESC02蛋白功能缺失引起的疾病药物中 的应用，所述Cul4蛋白含有如SEQ ID NO. 1所示的氨基酸序列或含有如SEQ ID NO.2所示的 氨基酸序列。2. 如权利要求1所述的应用，所述的疾病为罗伯茨综合症。3. 编码Cul4蛋白的基因在制备治疗ESC02基因突变、缺失或ESC02蛋白功能缺失引起的 疾病药物中的应用，所述编码Cul4蛋白的基因含有如SEQ ID NO. 3所示的核苷酸序列或含 有如SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列。4. 如权利要求3所述的应用，所述的疾病为罗伯茨综合症。5. -种蛋白过表达促进剂在制备ESC02基因突变、缺失或ESC02蛋白功能缺失引起的疾 病治疗药物中的应用，所述蛋白含有Cul4A蛋白或Cul4B蛋白；所述Cul4A蛋白含有如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列;所述Cul4B蛋白含有如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列。6. 如权利要求5所述的应用，所述的疾病为罗伯茨综合症。7. 含有Cul4蛋白编码基因的生物材料在制备治疗ESC02基因突变、缺失或ESC02蛋白功 能缺失引起的疾病药物中的应用，所述Cul4蛋白编码基因含有如SEQ ID NO.3所示的核苷 酸序列或含有如SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列。8. 如权利要求7所述的应用，所述的生物材料为表达载体或宿主细胞。9. 如权利要求7所述的应用，所述的疾病为罗伯茨综合症。10. 含有Cul4蛋白或其编码基因的药物，所述Cul4蛋白含有如SEQ ID N0.1所示的氨基 酸序列或含有如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列;Cul4蛋白编码基因含有如SEQ ID NO.3所 示的核苷酸序列或含有如SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列。
【文档编号】A61K38/17GK106075396SQ201610547977
【公开日】2016年11月9日
【申请日】2016年7月12日
【发明人】楼慧强, 曹勤红, 张晶晶, 孙海涛
【申请人】中国农业大学