一种角蛋白酶及其编码基因和应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于基因工程技术和酶工程技术领域，具体涉及一种角蛋白酶及其编码基 因和应用。
【背景技术】
[0002] 角蛋白是一种广泛存在于动物毛发、鳞片、羽毛、角等结构中的硬性纤维状蛋白， 主要分为a角蛋白和0角蛋白。角蛋白分子中富含半胱氨酸，形成了大量的二硫键， 加上分子中的氢键、疏水相互作用等分子作用，使角蛋白分子结构十分稳定，难以被胰蛋 白酶、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶等普通蛋白酶降解(Thysetal. ,2004;Riffeletal., 2007:Mazottoetal. .2011)〇截止2011年，全世界每年将产生四五百万吨羽毛废弃物， 仅我国就将产生近百万吨(Kornillowicz-Kowalska&Bohacz, 2011)。而自然消耗是个漫 长的过程，靠传统的物理化学方法处理羽毛，既破坏环境，又无法利用羽毛角蛋白中大量的 营养价值。因此迫切的需要一种环境友好又可回收利用角蛋白价值的转化手段。
[0003] 角蛋白酶是一种可以有效降解角蛋白的蛋白水解酶，广泛存在于真菌、细菌、古菌 中(Brandellietal. ,2010;Kornillowicz-Kowalska&Bohacz, 2011)〇
[0004] 然而，现有技术所得角蛋白酶对角蛋白的水解效果并不十分理想，同时，在利用微 生物水解角蛋白底物时，通常是联合包括某一角蛋白酶在内的多种因素才能获得水解角蛋 白的效果。因此，对具有高效角蛋白水解能力的角蛋白酶的氨基酸序列及其编码基因序列 的研究是本领域所亟待解决的，这不仅可以获得更优质的角蛋白酶，更为重要的是这更加 利于角蛋白酶的工业化生产。
【发明内容】
[0005] 针对现有技术的不足，本发明的第一个目的在于提供能高效降解角蛋白底物的角 蛋白酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO. 1所示，该角蛋白酶在广泛pH条件下可保持良好的蛋 白酶活性且热稳定性优秀。
[0006] 如本发明的实施例所示，本发明角蛋白酶的比活力为92. 55 KU/mg，在pH为 4. 0-11. 0时能保持很好的角蛋白酶活性，在温度为45-95°C时，仍具有较高的活性。
[0007] 本发明的第二个目的在于提供上述角蛋白酶的编码基因，该基因的核苷酸序列如 SEQ ID N0. 2 所示。
[0008] 本发明的第三个目的在于提供制备所述角蛋白酶的方法，该方法包括步骤： 1) 利用PCR获得SEQ ID N0. 2所示核苷酸序列； 2) 将SEQ ID N0. 2所示核苷酸序列克隆到原核表达载体上； 3) 将步骤2)所得物转化入基因工程菌上； 4) 将步骤3)所得物进行诱导培养，即得所述角蛋白酶粗液。
[0009] 优选的，步骤2)所述原核表达载体为pET28a。
[0010] 优选的，步骤3)所述基因工程菌为大肠杆菌(DE3)表达菌株。
[0011] 优选的，步骤4)所述诱导培养为：在含Kan抗生素的LB液体培养基中，37°C，225 rpm，震荡培养至 0D600 0.6~0.8,加入 0.5 mmol/L IPTG，37°C，225rpm，培养 6 小时。取 1 ml菌液12000 rmp离心2 min收集菌体，加入5 ml Lysis Buffer缓冲液充分混勾，超声波 破碎细菌，4°C 12000g离心30 min，取上清。
[0012] 本发明的目的还在于提供所述角蛋白酶在处理含角蛋白物质的处理上的应用，所 述含角蛋白物质包括羽毛。
[0013] 本发明的有益效果：本发明提供的角蛋白酶不仅具有非常有效的降解角蛋白底物 的能力，其比活力高达59. 5 KU/mg，且能在pH为4. 0-11. 0以及温度为45-95°C时保持良好 的活性，能很好的水解羽毛粉等角蛋白底物，具有良好的市场应用前景。
【附图说明】
[0014] 图1为本发明所得角蛋白酶的pH稳定性实验结果，其中，"1854"代表实施例2所 得角蛋白酶； 图2为本发明所得角蛋白酶的适应温度范围实验结果； 图3为本发明所得角蛋白酶对羽毛的降解效果图，其中，"1854"代表实施例2所得角 蛋白酶，" Con"代表对照组。
【具体实施方式】
[0015] 下面通过实施例对本发明进行具体描述，有必要在此指出的是以下实施例只是用 于对本发明进行进一步的说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，该领域的技术熟练 人员根据上述
【发明内容】
所做出的一些非本质的改进和调整，仍属于本发明的保护范围。
[0016] 实施例1 2. 1、载体、菌株及培养基 菌株：A coJi DH5 a、A coJi yPossete (DE3) 载体：pET28a 培养基：1) LB培养基液体培养基：1%蛋白胨，0. 5%酵母粉，l%NaCl。
[0017] 固体培养基：液体LB培养基中加入1. 5%琼脂粉。
[0018] 2. 2、实验方法(重组质粒构建） 引物合成 本实验所用引物由上海英俊合成。引物序列见表1。
[0019] PCR反应/酶切/连接
以DNA为模板，合成需要克隆的基因上游及下游引物1854-F和1854-R，进行PCR反应， 反应体系为30 yl (表2)。将PCR产物经1.5%琼脂糖电泳后，切下目的片断的胶块，按胶 回收试剂盒步骤进行纯化，回收DNA片断。将上述目的DNA与pMD19T Vector进行TA克隆 连接反应(表3)。目的基因DNA与载体的摩尔比优化至2:1-10:1即可，推荐3:1，DNA浓 度通过核酸定量仪测定。各反应物混匀后16°C连接过夜。
[0020] 2. 3连接产物转化 从-80°C中取出A coJi DH5 a感受态细胞(每管1〇〇 y 1)置于冰上融化，将连接产物 全量加入感受态中，再冰浴30min，42°C热激90 s，再冰浴2 min，加入890 yl S0C培养基， 37°C，180 r/min振荡培养60 min;取适量转化好的感受态细胞涂布于含Amp和IPTG的LB 平板，37°C培养14-18h。挑选阳性克隆提取质粒并对阳性克隆质粒进行PCR和双酶切鉴定 重组克隆子。
[0021] 2. 4阳性克隆筛选与鉴定 随机挑取阳性单菌落，分别接种于5 ml含有卡那霉素（100 mg/ml)的LB培养液中， 37°C摇床过夜培养。离心收集菌体，使用质粒提取试剂盒提取质粒。经双酶切和PCR鉴定 所得质粒是否携带插入片段将筛选出的重组质粒送金唯智公司测序以验证其正确性。
[0022] 2. 5序列分析 将测序结果去除载体序列后与GenBank中的序列进行Blast比对分析。判断扩增序列 正确性，利用〇RF finder工具进行酶基因完整0RF的预测。序列如SEQ ID N0. 2所示。
[0023] 2. 6表达质粒构建及表达宿主菌转化 将pET28a载体和上述阳性克隆子重组质粒进行EcoR I和Xhol I双酶切(表4)，琼脂 糖凝胶回收，再用T4DNA连接酶连接酶切后的载体和目的基因片段(表5)。目的基因DNA与 载体的摩尔比优化至2:1-10:1即可，推荐3:1，DNA浓度通过核酸定量仪测定。各反应物 混匀后16°C连接过夜。连接产物全量转化至100 y 1 A coJi Rosseta(DE3)，并涂布于含 Kan和Amp的LB平板，37°C培养(方法同2. 3)。
[0024] 37°C 水浴 4-5 h。
[0025] 2.7阳性克隆筛选及诱导表达 挑取单克隆接种至50 mL含Kan和Amp的液体LB培养基中，37°C180rpm/min恒温 摇床培养到0D600至0.5-0. 6左右。添加0.5 mM IPTG，37°C180rpm/min继续培养4-5h。 培养结束后，取适量收集菌体，加入Lysis Buffer缓冲液重悬菌体，超声波破碎菌体，4°C 12000g离心30min，取上清，即得所述角蛋白酶粗液。
[0026] 实施例2 1) 准备实施例2所得的序列SEQ ID N0. 2 ; 2)将SEQ ID NO. 2所示核苷酸序列克隆到pET28a载体上； 3) 将步骤2)所得物转化入A coB (DE3)工程菌上； 4)将步骤3)所得物，在含Kan抗生素的LB液体培养基中，37°C，225 rpm，震荡培养 至0D6。。0.6~0.8,加入0.5mmol/LIPTG，37°C，225 rpm，培养6小时。取 lml 菌液12000 rmp离心2min收集菌体，加入5ml Lysis Buffer缓冲液充分混勾，超声波破碎细菌，4°C 12000g离心30min，取上清，即得所述角蛋白酶粗液。
[0027] 实施例3 将实施例2所得角蛋白酶进行pH稳定性和适应温度范围检测，检测结果如图1和图2 所示。
[0028] 实施例4 将实施例2所得角蛋白酶用于羽毛粉的处理，处理后，羽毛降解效果图如图3所示。其 中对照组的处理方式为：对照组以50mM，pH 8. 5的Tris-HCl缓冲液代替酶液，与实验组在 相同条件下孵育羽毛。
【主权项】
1. 一种角蛋白酶，其特征在于，所述角蛋白酶的氨基酸序列如SEQ ID NO. 1所示或在 SEQ ID NO. 1的基础上进行缺失、突变、重组获得的具有角蛋白酶活性的氨基酸序列。2. 编码权利要求1所述角蛋白酶的基因，其特征在于，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO. 2所示或在SEQ ID NO. 2的基础上进行缺失、突变、重组而获得的能表达所述角蛋白 酶的核苷酸序列。3. 权利要求1所述角蛋白酶的制备方法，其特征在于，所述方法包括步骤： 1) 利用PCR获得SEQ ID NO. 2所示核苷酸序列； 2) 将SEQ ID NO. 2所示核苷酸序列克隆到原核表达载体上； 3) 将步骤2)所得物转化入基因工程菌上； 4) 将步骤3)所得物进行诱导培养，即得所述角蛋白酶粗液。4. 根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤2)所述原核表达载体为pET28a。5. 根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤3)所述基因工程菌为大肠杆菌 (a (DE3 )表达菌株。6. 根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤4)所述诱导培养为：在含Kan 抗生素的LB液体培养基中，37°C，225 rpm，震荡培养至0D600 0.6~0.8,加入0.5 mmol/L IPTG，37°C，225rpm，培养6小时；取I ml菌液12000 rmp离心2 min收集菌体，加入5 ml Lysis Buffer缓冲液充分混匀，超声波破碎细菌，4°C 12000g离心30 min，取上清。7. 权利要求1所述角蛋白酶在处理含角蛋白物质的处理上的应用，所述含角蛋白物质 包括羽毛。
【专利摘要】本发明提供了一种角蛋白酶，该角蛋白酶的氨基酸序列如SEQ？ID？NO.1所示或在SEQ？ID？NO.1的基础上进行缺失、突变、重组获得的具有角蛋白酶活性的氨基酸序列。本发明还提供了编码所述角蛋白酶的基因，该基因的核苷酸序列如SEQ？ID？NO.2所示或在SEQ？ID？NO.2的基础上进行缺失、突变、重组而获得的能表达所述角蛋白酶的核苷酸序列。本发明还提供了制备所述角蛋白酶的方法。本发明提供的角蛋白酶不仅具有非常有效的降解角蛋白底物的能力，其比活力高达92.55KU/mg，且能在pH为4.0-11.0以及温度为45-95℃时保持良好的活性，能很好的水解羽毛粉等角蛋白底物，具有良好的市场应用前景。
【IPC分类】C12P21/06, C12N15/70, C12N15/57, C12N9/52
【公开号】CN105132396
【申请号】CN201510575220
【发明人】黄艳, 邓宇, 马诗淳, 陈璐, 周正, 尹小波
【申请人】农业部沼气科学研究所
【公开日】2015年12月9日
【申请日】2015年9月11日