专利名称：蛋白HtpX-P3及应用其提高酶热稳定性的方法
技术领域：
本发明属于提高酶的热稳定性的技术领域，具体涉及一种融合蛋白HtpX-P3，及利用 该蛋白增强酶热稳定性的方法。该融合蛋白序列包含来源于嗜热古菌硫矿硫化叶菌 (6W/b7otos so /^aric"s)中的一种热激蛋白基因力tpJ-3所表达的蛋白序列。
背景技术：
随着工业生物技术和酶工程的不断发展，酶的应用越来越普遍，酶作为生物催化剂具有 催化效率高、催化专一性强、作用条件温和等显著特点,但是在酶作为蛋白，普遍存在热稳 定性差的特点。这使得一些工业生产不得不在反应器中增加冷却系统，增加了工业成本和 各种代谢物对产物的污染。另外，酶的低热稳定性使得商业酶在分离纯化和包装运输过程 中都容易失活。因此，酶的热稳定性是酶生产和工业催化中需要解决的一个关键问题。
目前，已经有很多方法应用于提高酶的热稳定性。包括酶分子的化学修饰、理性设计 以及定向进化等。应用最广泛的酶化学修饰技术是利用大分子或小分子修饰剂对酶分子的 侧链进行改造，以获得具有工业应用价值的蛋白。利用化学修饰技术已经成功地使一些酶 的热稳定性得到显著的提高，所用到的修饰剂包括大分子物质如糖类等以及一些小的化学 分子 (Davis BG, 2G03, Chemical modification of biocatalysts. Curr Opin Biotechnol， 14:379)。酶分子的理性设计是指在己知酶的结构与功能关系的基础上，有目 的地改变酶的某一活性基团或氨基酸残基，从而使酶产生新的性状。利用理性设计提高酶 的热稳定性，主要以目标酶蛋白的氨基酸序列与一些高温酶蛋白序列的同源性作为氨基酸 取代的标准，由于多数情况下对酶的结构、功能和作用机制没有完全了解，所以，并非所 有的理性设计都能取得预期的结果(Uwe T Bornscheuer等，2001， Improved biocatalysts by directed evolution and rational protein design. Current Opinion in Chemical Biology, 5:137 - 143)。酶的体外定向进化(简称定向进化)是近些年兴起的改造酶分子的 新策略，它是由两个相互独立的关键技术组成。 一个是随机基因文库的构建,另一个是特定 酶(特别是增加催化活性、增强选择性或稳定性)的筛选策略。目前，已经通过定向进化技
3术得到了一些热稳定性得到显著提高的酶(G. J.Williamsa等，2004， Directed evolution of enzymes for biocatalysis and the life sciences. Cellular and Molecular Life Sciences, 61:3034 - 3046)。
提高酶热稳定性的方法还包括固定化和添加保护剂。固定化以后的酶，其中一些作用 温度可以达到80'C以上(Cesar Mateo等，2007， Improvement of enzyme activity, stability and selectivity via immobilization techniques. Enzyme and Microbial Technology, 40:1451 - 1463)。由于方法简单、成本低下和易于操作等多方面原因，添加 保护剂是目前工业上提高酶稳定性的最重要手段(Manning MC等，1995， Approaches for increasing the solution stability of proteins. Biotechnology and Bioengineering， 48(5) :506-512)，大部分商业酶成品中都添加有一定的保护剂以延缓酶的失活。保护剂的 成分包括一些单糖、多糖类物质以及一些有机小分子物质等。
热激蛋白(heat shock proteins,简称Hsps)广泛存在于包括真核生物、细菌和古菌 在内的各种生物体内，根据分子量的不同分为不同的类别，其中分子量为35kDa以下的一 类称为小分子量热激蛋白(small heat shock proteins, sHsps)。这类蛋白是最常见的分 子伴侣，广泛存在于所有生物体内。
sHsps具有广泛的功能，目前对它们的研究主要它们在细胞内的功能，以及它们的分 子伴侣功能上。例如，1999年，AlvaroSoto等的实验表明这种作用的机制是sHsp可以结 合到一些细胞质蛋白上，维持它们的活性结构，使其保持在可发挥生物活性的可溶性状态。 他们在大肠杆菌中表达来源于植物的CsHspl7.5蛋白，发现大肠杆菌细胞的抗热能力明显 提高。2007年，杨等在毕赤酵母中表达HsP20，发现可以提高其抗热胁迫的能力。另外， sHsps可以在体外发挥分子伴侣的功能，维持蛋白的生物活性。，其作用机制可能是在蛋白 失活温度下，sHsps结合到目标蛋白上，形成稳定的中间体，维持蛋白的活性结构。sHsps 可以阻止热胁迫以及其他逆境条件下蛋白的聚合作用，2006年，Szabolcs Bellyei等利用 大肠杆菌表达来源于人的Hspl6.2，得到的重组蛋白可以抑制醛縮酶以及3-磷酸甘油醛脱 氢酶的聚合。2007年，Denis I. Markov等发现Hsp27可以抑制热胁迫下肌球蛋白SI亚基 的聚合作用。在一些情况下，sHsp可以帮助解体后的蛋白重新折叠，获得有生物活性。2000 年，Zsolt Torok等研究了一种sHsp，该蛋白可以作为分子伴侣结合到热变性的猪心脏线 粒体苹果酸脱氢酶上，形成一种稳定的中间结构，利于其他的分子伴侣与酶作用，从而重 新折叠成活性结构。2001年，Keisuke Usui等研究了嗜热古菌r/ arawcocc"s印.strain KS-1的一种小热激蛋白，发现该蛋白可以形成同源多聚体，并对由热引起的猪心脏柠檬酸盐合成酶的聚合起抑制作用，同时对酸变性的绿色荧光蛋白的重折叠起轻微促进作用。另 夕卜，Pongpan Uks纖lamai等发现嗜热古菌尸， 的sHsp可以在体外抑
制由热胁迫引起的大肠杆菌蛋白以及牛谷氨酸脱氢酶的聚合作用。
sHsp具有一些细胞水平上的功能，以及分子伴侣的能力，但是它们在酶工业中的应用， 尤其是利用它们直接加入酶制剂中以提高酶的热稳定性尚未见报道报道。另外热激蛋白的 功能具有多样性，给定一个热激蛋白，并不能预知它的具体功能。在现有的文献中，也没
有3基因的具体功能研究报道，更没有利用该基因提高酶热稳定性的报道。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种可用于提高酶热稳定的含有HtpX-P3 融合蛋白表达载体pSEPHLKl的大肠杆菌菌株BL21 (DE3)，并提供由该菌株表达的蛋白 HtpX-P3。
本发明另一目的是提供应用蛋白HtpX-P3提高蛋白酶热稳定性的方法，以及应用蛋白 HtpX-P3提高限制性内切酶热稳定性的方法。
本发明用到的嗜热古菌硫矿硫化叶菌，其基因组序列已经测序，生长温度为85'C，用 于本发明的力*/-3基因的全序列可以在公共数据库中得到，它在Genbank核苷酸数据库中 为硫矿硫化叶菌基因组(NC—002754)的一部分，即从2369804到2370178碱基，它所编码 的蛋白序列在Genbank数据库中的编号为NP—343935， GI号为15899330。虽然硫矿硫化叶 菌的基因组序列已经测定并发表，3的全序列已经可以在Genbank数据库中得到，但 是，关于该基因功能的描述还是模糊的。
本发明的目的通过如下技术方案实现
如图1所示，本发明利用来自嗜热古菌硫矿硫化叶菌的热激蛋白基因力tpiS ，构建融 合蛋白HtpX-P3载体，将该HtpX-P3载体转化大肠杆菌BL21 (DE3)，对其进行优化和纯化， 得到的蛋白可作为保护剂，以溶液状态加入酶中，提高酶在较高温度下的耐热性。具体步
骤如下
第一步，釆用PCR技术，从嗜热古菌硫矿硫化叶菌的基因组DNA中分离得到热激蛋白 基因力tpJJ，并对其序列进行测序分析。
第二步，构建融合蛋白HtpX-P3的表达载体pSEPHLKl。
第三步，将上一步得到的表达载体转化大肠杆菌BL21(DE3)，该菌株是一种含有 HtpX-P3融合蛋白表达载体pSEPHLKl的大肠杆菌菌株。转入该表达载体的大肠杆菌菌株已经于2008年6月23日保藏在CCTCC，保藏号为 CCTCCM 208093。
第四步，蛋白HtpX-P3表达条件的优化，通过对培养时间，诱导温度、时间等条件的 摸索和优化，基本上处于可溶状态。
第五步，蛋白HtpX-P3的纯化，表达产物的超声裂解液经镍柱(Ni2+ chelating s印harose)亲和层析后，得到纯度较高的蛋白，经过进一步的G50凝胶柱层析后，得到纯 度高达90%以上的目标蛋白。该蛋白HtpX-P3由含有表达载体pSEPHLKl的大肠杆菌菌株 BL21(DE3)表达出来。
第六步，以第五步得到的蛋白作为保护剂，以溶液状态加入菠萝蛋白酶或限制性内切 酶^boRI的酶液中，提高酶在较高温度下的耐热性。
具体是一种应用蛋白HtpX-P3提高蛋白酶热稳定性的方法，每1单位蛋白酶加入蛋白 HtpX-P3或其融合蛋白0.7-1.7ug。所述的酶优选为菠萝蛋白酶。
一种应用蛋白HtpX-P3提高限制性内切酶热稳定性的方法，每1单位限制性内切酶加 入蛋白HtpX-P3或其融合蛋白0. 5-1. 3ng。所述的酶优选为限制性内切酶fcoRI。
相对于现有技术，本发明的优点在于
本发明提供一种小分子量热激蛋白作为保护剂，添加到酶中提高酶的热稳定性。提供 的利用蛋白HtpX-P3作为保护剂添加到酶中，提高酶热稳定性的方法简单方便，所涉及的 热激蛋白基因是应用于提高蛋白热稳定性的一个新的基因，因此本方法是该领域的一个新 方法。利用本方法对菠萝蛋白酶和限制性内切酶5boRI进行改造，可以明显提高它们在60 t:下的热稳定性。由于菠萝蛋白酶和限制性内切酶^boRI属于性质完全不同的两种酶，热 激蛋白HtpX-P3对两者都能起到作用，说明它的作用不具有专一性，所以HtpX-P3有希望 作为一种酶的通用保护剂，这克服了利用理性设计，基因工程等方法中必须在对目标酶十 分了解的弊端，以及定向进化方法的工作量巨大的弊端。
图1是本发明提供的以重组蛋白HtpX-P3为保护剂提高酶热稳定性方法的流程图； 图2是含基因力tpJ-3的表达质粒pSEPHLKl的结构示意图；' — 图3是本发明通过纯化后最后得到的重组蛋白HtpX-P3的SDS-PAGE电泳图。 图4是本发明实施例5中重组蛋白HtpX-P3对菠萝蛋白酶6(TC下热稳定性的影响结果； 图5是本发明实施例6中重组蛋白HtpX-P3对限制性内切酶^boRI6(TC下热稳定性的影响结果图。
具体实施例方式
以下实施例将有助于本领域的普通技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制 本发明。
实施例1:从硫矿硫化叶菌的基因组DNA中PCR扩增得到Z^pJ-3基因及其序列的测定 和分析
根据对硫矿硫化叶菌基因组序列的预测，以及相关sHsp基因的比对结果，设计一对引
物
HtpX-31 5'TCTA GGATCC ATA GGTACC TGA CTGCAG ATGATGAATGTGATAATGAG HtpX-32 5' AAAA GAATTC ATA GGTACC TTA CTGCAG ATTATTCTATTCTGATTGAG 以基因组DNA为模板进行PCR扩增，扩增体系为模板2ul， dNTPs lul， primers 0. 5ul+0. 5ul, probest Taq 0. 5ul'buffer 5ul'ddH20 41. 5ul, total 50ul; PCR反应程序 为94°C 2min; 94。C变性45秒，53。C复性45秒，72。C延伸2分钟，循环30次；72。C延 伸5分钟；4'C终止反应。琼脂糖凝胶电泳检测，在预期大小432bp处得到一条带。将PCR 产物进行测序后，得到的序列(432bp)如SEQ.ID.NOl所示。
粗体部分为它的编码序列，编码的蛋白序列(124aa)如SEQ.ID.N02所示。 对该蛋白序列的分析表明，该蛋白属于小热激蛋白hsp20家族中的一员，定位于基因 组的2369804.. 2370178。将该蛋白序列与古菌中其他同源序列的比较发现，它具有小分子 量热激蛋白特有的一些保守的氨基酸位点。该蛋白的二级结构具有a-crystallin保守结 构域。
实施例2:融合蛋白htpX-P3的表达载体的构建
将实施例1中得到的PCR产物，进行琼脂糖凝胶回收后纯化的产物，克隆到载体pET-28a (来源于Novagen公司)上，构建成为表达载体pSEPHLKl。该表达载体用尸Wl酶切鉴定， 得到一条400bp左右的带和一条5. 3k大小的带，与预期结果一致。
表达载体pSEPHLKl的物理图谱如图2所示，其大小为5781bp，以T7为启动子，在目 标基因力^JJ的C端有编码6XHis标签的序列，使目标蛋白可'以通过镍柱亲和层析纯化。 表达载体pSEPHLKl经过尸"I完全酶切后，可得到381bp的片段，即为热激蛋白基因力^J-3 的编码序列。本发明的表达质粒的复制方法，CaCh法在ADH5 a或BL21 (DE3)菌株中转化质粒，用含有卡那霉素(25pg/ml)的LB培养基转化细菌，碱法提取质粒的方法，都 参照 Sambrook (Sambrook, et al., 1989, Molecular cloning. Cold Spring Harbor Labroratory Press. USA)。
实施例3:蛋白HtpX-P3的表达
将pSEPHLKl转化大肠杆菌BL21(DE3)，该大肠杆菌BL21(DE3)由Novagen公司提供。 BL21 (DE3)菌株中包含pSEPHLKl蛋白表达所需的T7 RNA聚合酶基因，可以用于外源基因在 大肠杆菌中的表达。基因工程菌超声裂解上清液经12%SDS-PAGE电泳分析表明，菌体诱导 后有明显的特异表达产物带，分子量与用软件Clone5预测的重组蛋白的分子量理论值16. 1 kD相符。
经过培养时间，诱导IPTG浓度，温度等条件的摸索以及菌体扩大培养不同时间后诱导 表达比较，基因工程菌的培养条件为接单菌落于50M加油0.2W葡萄糖的卡纳抗性LB培 养基中，37°C， 250rpm培养过夜，取过夜培养物5ml接种于100ral卡纳抗性LB培养基中， 37°C ， 250rpm培养至0D600=0. 6 (扩大培养约2h)，加入IPTG至终浓度为0. 5mM， 25°C ， 250rpm 诱导培养6h后，4'C， 12000rpm离心2min收获菌体。经SDS-PAGE电泳分析表明，在此条 件下，HtpX-P3蛋白的表达量最大，占菌体总蛋白的10%左右，大部分处于可溶状态。
实施例4:蛋白HtpX-P3的纯化及成熟蛋白的获得
将收获的总菌体用TE(8.0)洗涤，再用Tris-HC1 (20mM,pH8.0)悬浮，超声处理后， 裂解上清液中加入终浓度为500mM的NaCl和30mM咪唑，然后经镍亲和色谱层析一步纯化， 选用较简化的洗脱条件20mMTris， 500mMNaCl， 30raM咪唑，pH8.0 (A液)；20mMTris， 500mMNaCl， 100mM咪唑，pH8.0(B液)；20mMTris， 500mMNaCl， 300mM咪唑，pH8. O(C液)； 目标蛋白HtpX-P3在C液中被洗脱下来。从SDS-PAGE结果来判断，是分离效果最好的部分。 得到的蛋白经SDS-PAGE分析和薄层扫描分析表明融合蛋白的纯度达到80%。
上述得到的融合蛋白，进一步经过G50凝胶柱层析进行纯化，以H20为洗脱液，得到 的蛋白经过SDS-PAGE分析，纯度达到90%以上。如图3所示，图中第1泳道为蛋白质低分 子量Marker;第2泳道为纯化后的目标蛋白条带，大小在14. 4 kD和20. 0 kD之间，与预 期的16. 1 kD—致。
实施例5: HtpX-P3作为保护剂提高菠萝蛋白酶的热稳定性菠萝蛋白酶是一种重要的水解酶，其失活温度为55t:。实验中菠萝蛋白酶活力的测定
方法为FIP法，其原理是菠萝蛋白酶水解酪蛋白产生酪氨酸，后者在275nm处有光吸收， 利用三氯醋酸溶液沉淀反应后剩余的酪蛋白，过滤后测滤液在275nm处的光吸收值。菠萝 蛋白酶的活力的定义是在37°C， pH值7.0的情况下，每分钟释放出的三氯乙酸可溶物在 275nm处的光吸收值相当于1 U g酪氨酸的吸光值，所需的酶量为1单位。
称取O. lg菠萝蛋白酶(购自上海生工生物科技有限公司，3-7单位/mg)，溶于100ml 水中，得到初始酶液。取3个三角瓶，各瓶中都加入10ml的初始菠萝蛋白酶酶液，然后分 别加入5ml酶稀释液(0.26g L半胱氨酸，0. 22g EDTA溶于100ral水，pH值为4.5)， 5ml 浓度为10"g/ml的BSA (牛血清蛋白)水溶液以及5ml浓度为10"g/ml的HtpX-P3蛋白 水溶液(每lmg酶加入蛋白HtpX-P3约5 y g,也相当于每单位菠萝蛋白酶加入蛋白HtpX-P3 约0.7-1.7iig)，将三个三角瓶分别放于55。C水浴中温育。取温育后O、 20、 40、 60、 80、 l(Xkin的不同处理的酶液，测酶活。温育Omin (热处理前)样品测得的酶活为初始酶活， 以后面不同时间取得的样品测得的酶活相对于各自的初始酶活的百分比为纵坐标，如图4 所示，得到不同样品的剩余酶活一时间曲线。结果显示加入酶稀释液的(图中为CK)或BSA 的在热处理40分钟时已经几乎完全失活，半衰期大约为20分钟，而加入HtpX-P3 (图中 PHLK1)的在热处理40分钟时仍然有约40%的相对活性，半衰期约为40分钟，这说明HtpX-P3 可以增加酶的热稳定性，使半衰期增加20分钟左右。
实施例6: HtpX-P3作为保护剂提高限制性内切酶fcoRI的热稳定性
取3支1. 5ml离心管，各管中加入限制性内切酶￡coRI (来源于TAKARA公司，8-20单 位/y 1) lOwl，然后在3支管中分别加入酶稀释液(0.26g L半胱氨酸，0.22g EDTA溶 于100ml水，pH值为4.5)、浓度为10ug/ml的BSA(牛血清蛋白)水溶液、浓度为10ug/ml 的HtpX-P3蛋白水溶液各10u 1 (相当于每U 1 ^boRI加入蛋白HtpX-P3约10 ng，也相当 于每单位y5boRI加入蛋白HtpX-P3约0. 5-1. 3ng)，将各离心管置于6(TC温育。分别从各管 中取温育后0、 10、 20、 30、 40、 50分钟后的酶2ul，冰浴中放置。待全部取完后，用取 得的各不同处理的酶进行酶切反应，底物为lug入DNA(购自上海生工生物科技有限公司)， 酶切体系为lug入DNA,酶2"1， 10Xbuffer (来源于TAKARA公司)2 u 1，加水至终体 积20u 1。 37°C， 2h，加入6XLoading buffer终止反应。取5u 1酶切反应产物，0. 8% 琼脂糖凝胶电泳检测酶切效果。如图5所示，图中l、 4、 7、 10、 13、 16泳道分别为5boRI 在60'C下温育0、 10、 20、 40、 50min后酶切入DNA的结果；2、 5、 8、 11、 14、 17泳道为加入BSA后的^coRI在60。C下温育0、 10、 20、 40、 50min后酶切入DNA的结果；3、 6、 9、 12、 15、 18泳道为加入重组蛋白htpX-P3后的i5boRI在6(TC下温育0、 10、 20、 40、 50min 后酶切入DNA的结果。结果表明60。C温育20min后，fcoRI基本全部失活；加入BSA对 酶的失活时间没有影响；而加入HtpX-P3后，可以明显看到，60'C温育40min时，还有一 定的活性，酶的失活可以延缓20min。所以，HtpX-P3能抑制^:oRI在高温下的失活作用， 对提高其热稳定性具有明显的作用。序列列表
SEQ,ID.NOl:〉鄉U
TCTAGGATCCATAGGTACCTGACTGCAGATGATGAATGTGATMTGAGAGAAATAGGTAAAAAATTAGATGMC TGTCTAGAGAATTTTATGMTCAGTTATTCCGCCCATAGATATGTATGAAGAAGGGGGAGAGTTAGTAGTGGTAGCA GATCTAGCGGGTTTTAAT嵐GATAAGATAAGTGTMGGTTATCTGCACAGMCGMCTGATMTTMCGCTGAAAG GG嵐TACAGTATATTGGTACT嵐TACGCTACTCAGAGACCTCTTMGATACATMGGTAATTCGTTTACCGGTM AGGTTAAGAGGGATTCTCMGTTACAGCGAAATATGAAAATGGTGTATTGACTATMGGATACCAGTGGAGGGTTCA GTCTCMTCAGAATAGMTAATCTGCAGTAAGGTACCTATGAATTCTTTT
SEQ.ID.N02:
MMNVIMREIGKKLDELSREFYESVIPPIDMYEEGGELWVADLAGFNKDKISVRLSA
SIRIE
权利要求
1、一种含有HtpX-P3融合蛋白表达载体pSEPHLK1的大肠杆菌菌株BL21(DE3)，其保藏号为CCTCC M 208093。
2、 一种蛋白HtpX-P3，其特征在于该蛋白HtpX-P3由权利要求l所述的含有表达载体 pSEPHLKl的大肠杆菌菌株BL21(DE3)表达出来。
3、 一种应用蛋白HtpX-P3提高蛋白酶热稳定性的方法，其特征在于每l单位蛋白酶加 入蛋白HtpX-P3或其融合蛋白0. 7-1. g。
4、 根据权利要求4所述的应用蛋白HtpX-P3提高蛋白酶热稳定性的方法，其特征在于 所述的酶为菠萝蛋白酶。
5、 一种应用蛋白HtpX-P3提高限制性内切酶热稳定性的方法，其特征在于每l单位限 制性内切酶加入蛋白HtpX-P3或其融合蛋白0. 5-1. 3ng。
6、 根据权利要求5所述的应用蛋白HtpX-P3提高限制性内切酶热稳定性的方法，其特 征在于所述的酶为限制性内切酶^boRI。
全文摘要
本发明公开了蛋白HtpX-P3及应用其提高酶热稳定性的方法，本发明以硫矿硫化叶菌的基因组DNA为模板，通过PCR的方法克隆得到htpX-3基因，得到含有该基因片段的重组载体；将此载体转到大肠杆菌中，并表达出蛋白。应用蛋白HtpX-P3提高蛋白酶热稳定性的方法是每1单位蛋白酶加入蛋白HtpX-P3或其融合蛋白0.7-1.7μg。应用蛋白HtpX-P3提高限制性内切酶热稳定性的方法是每1单位限制性内切酶加入蛋白HtpX-P3或其融合蛋白0.5-1.3ng。本发明的重组热激蛋白HtpX-P3可以降低高温下酶失活的速度，延长其半衰期，在提高酶的热稳定性方面优势。
文档编号C12N1/21GK101525588SQ20081021935
公开日2009年9月9日 申请日期2008年11月24日 优先权日2008年11月24日
发明者李文成, 博 杨, 王小宁, 王永华, 谢明权, 闻真珍 申请人:华南理工大学