专利名称：一种里氏木霉蛋白酶及其制备方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种蛋白酶，尤其涉及一种里氏木霉蛋白酶； 另外，本发明还涉及该里氏木霉蛋白酶的制备方法和应用。
背景技术：
世界上现发现的酶有2138种，其中有185种用于实际的生产中，每年销售额已达 30亿美元以上。工业用酶中蛋白酶占59%，淀粉酶类占观％，脂肪酶类占3%。蛋白酶是最重要的一种工业酶制剂，能催化蛋白质和多肽肽键水解。它广泛存在于动物内脏、植物茎叶、果实和微生物中。各种生物体都能合成它，微生物蛋白酶最具有生产价值。蛋白酶的商品生产始于20世纪初，30年代微生物蛋白酶开始用在食品和制革工业。20世纪50年代初，日本学者首先发现霉菌中存在几种类型的蛋白酶，特别是酸性蛋白酶。20世纪60年代初，荷兰开始生产添加碱性蛋白酶的洗涤剂。到目前为止，国际市场上商品蛋白酶80-100种以上。1蛋白酶的分类按蛋白酶水解蛋白质的方式可分为以下几种(1)切开蛋白质分子内部肽键，生成相对分子质量较小的多肽类，这类酶一般叫内肽酶；( 切开蛋白质或多肽分子氨基或羧基末端的肽键，而游离出氨基酸，这类酶叫外肽酶；作用于氨基末端的称为氨肽酶，作用于羧基末端的称为羧肽酶；C3)水解蛋白质或多肽的脂键；(4)水解蛋白质或多肽的酰氨键。按酶的来源可以分为动物蛋白酶、植物蛋白酶、微生物蛋白酶。微生物蛋白酶又可分为细菌蛋白酶、霉菌蛋白酶、酵母蛋白酶和放线菌蛋白酶。按蛋白酶作用的最适pH可以分为pH2. 5-5. 0的酸性蛋白酶、pH9. 5-10. 5的碱性蛋白酶、PH6-8的中性蛋白酶。2蛋白酶的用途2.1用于食品工业2. 1. 1发酵工业酱油的酿造就是利用蛋白酶分解原料中的蛋白质，使其降解为胨、多肽、氨基酸， 生成色、香、味于一体的产品。啤酒酿造中，当麦芽质量较差或麦芽用量减少辅料增加时，常需要补充蛋白酶，使蛋白质充分降解，提高麦汁中α-氨基氮的含量。酸性蛋白酶还可以作为啤酒澄清剂，降低啤酒冷浑浊，增加啤酒的稳定性。在鱼露的加工中添加蛋白酶可缩短发酵时间，提高风味。2. 1.2干酪的生产干酪是先将牛奶加乳酸菌发酵成酸奶，再加入蛋白酶，将牛奶蛋白质的特定肽键 Phel05-Metl06切开，生成k_酪担保与多肽，在Ca2+存在的情况下，而发生凝固，经切块、压榨及加盐进行发酵熟化而成。2. 1. 3蛋白质水解物的脱苦
蛋白质酶水解产物苦味是由其中的疏水性氨基酸残基和中间含脯氨酸残基的肽所引起的。酶水解蛋白质初期水解液苦味明显，这是由于蛋白质在酶的作用下，分解为氨基酸和肽类，其中短链的疏水性肽显苦味，而在蛋白质未水解时，疏水基被掩盖在分子中，水解过程中暴露出来而呈现苦味。使用富含肽酶的蛋白酶，通过作用于肽链的氨基酸疏水氨基酸，使其水解变成游离的氨基酸，使其释放出来，从而达到脱苦去苦的目的。2. 1. 4风味调味料的生产风味调料是一类含氨基酸、肽类、核苷酸和糖分等物质并具有鱼肉和蔬菜风味的调味料。其制法有分解型和抽提型两种，分解型是用鱼肉、明胶、面筋、大豆蛋白等动、植物蛋白通过蛋白酶的水解产物为原料来配成的。2. 1.5面粉加工对面筋蛋白有限的水解，降低面筋强度，改善面团的操作性能和机械性能，使面团柔软，面团揉捏时间缩短，提高面团的延伸性。2. 1.6肉类的嫩化水解肉类结缔组织，使肉类嫩化易煮。2. 1. 7果蔬汁加工同其它酶配合，加速植物细胞的崩解，解决由蛋白质引起的冷浑浊现象，延长产品的保质期，并可增加饮料的风味。2. 2用于洗涤剂全世界洗涤剂的产量已达1. 3亿吨，在欧洲加酶洗衣粉的比例达到80%以上，美国有45%以上，日本也达到60%左右，全世界碱性蛋白酶的销售额约占世界酶制剂市场的 25%。蛋白污渍(血渍，蛋渍和人体汗渍等难去除的污渍)都可以通过蛋白酶水解完成除垢目的，除垢的原理是利用酶的分解作用将不可溶的蛋、牛奶、血等蛋白渍变成水溶性的肽或氨基酸而从附着的纤维上除去。2. 3用于制革生产制革的原料皮中纤维蛋白是皮革的有用成分，此外还有不少非纤维状的蛋白存在于纤维间隙和表皮中，这些蛋白含量虽少，若不去除，成品皮革僵硬而脆。蛋白酶不能分解纤维蛋白质胶原，而可以分解毛皮与表皮间连接的蛋白，使胶原纤维松散，鞣制后的皮革柔软。2. 4制造明胶和可溶性胶原纤维传统工艺是用石灰水浸去皮、骨等原料中的油脂与杂蛋白等，此工艺耗时长达数月，劳动强度大，出胶率低而且能耗大。用蛋白酶消化胶原之外的杂蛋白，然后将胶原洗净后加热抽胶，得到明胶纯度高，质量好，相对分子质量均勻，生产周期短，明胶收率高。2. 5丝绸脱胶生丝织物必须脱胶，丝胶是一种蛋白质，我国历来用碱皂法高温炼丝进行脱胶，缺点很多，碱质侵袭丝素，易引起发毛影响光泽，用蛋白酶脱胶后，成品手感润滑柔软，光泽鲜艳，而且脱胶时间短，操作温度低，劳动生产率提高。2. 6用于饲料工业在饲料配方加入蛋白酶或直接混合在饲料中，可以降解动、植物蛋白，提高蛋白质和能量的利用率，降低饲料成本。
2. 7用于医药行业酶疗法是用酶作为药品治疗疾病的方法。在治疗用酶中，蛋白酶占50%以上。蛋白酶在临床治疗上可以作为消化剂、消炎剂、外科的清创剂和溶解血栓剂等。里氏木霉是一种广泛用于酶制剂生产的菌丝体真菌，该真菌具有蛋白分泌能力强，适合大规模液态深层发酵的特点。
发明内容
本发明要解决的技术问题之一是提供一种里氏木霉蛋白酶。本发明要解决的技术问题之二是提供用于构建上述里氏木霉蛋白酶表达质粒的引物。本发明要解决的技术问题之三是提供该里氏木霉蛋白酶的制备方法。本发明要解决的技术问题之四是提供该里氏木霉蛋白酶的应用。为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案在本发明的一方面，提供一种里氏木霉蛋白酶，它的氨基酸序列如SEQ IDN0. 1所示，或者具有SEQ ID NO. 1所示序列80%同源性以上的氨基酸序列。在本发明的另一方面，提供一种用于构建上述里氏木霉蛋白酶表达质粒的引物， 其序列为上游5，-CAACCGCGGACTGCGCATCATGGCCAGCCTTCGCCT-3，(如SEQ ID NO 2 所示) 或其互补链；下游5，-ATGCTCGAGTTAAGCACTGTTCCCGTTGAAG-3，(如 SEQ ID NO 3 所示)或其
互补链。在本发明的另一方面，提供一种上述里氏木霉蛋白酶的制备方法，该方法包括如下步骤1)里氏木霉基因扩增；2)里氏木霉蛋白酶表达质粒的构建；3)里氏木霉的转化与蛋白酶高产菌株的筛选。步骤1)具体为设计SEQ ID NO 2和SEQ ID NO 3所示的核苷酸序列或其互补链为引物，以里氏木霉基因组DNA为模板进行PCR扩增。所述PCR扩增的反应条件为95°C 预变性5min ；94°C变性45s，59°C退火30s, 72°C延伸45s，30个循环；最后72°C延伸5min。步骤2)具体为将步骤1)所得的PCR产物由Mc II和)(h0 I限制性内切酶降解后，用琼脂糖凝胶分离，纯化回收连接，然后通过T4DNA连接酶连接，转化大肠杆菌DH5 α通透细胞，通过分析筛选提取质粒，完成里氏木霉蛋白酶表达质粒的构建。步骤3)具体为首先，用EcoRI降解步骤2)构建的质粒形成质粒片段，采用化学转化方法将该质粒片段转入里氏木霉RUT C-30宿主细胞；然后在含有潮霉素B的PDA培养基上培养，再将生长旺盛的菌落接种置PDA培养基上，通过生长和发芽，将绿色孢子再转移到新鲜PDA培养基上，以分离纯化转代稳定的转化子，将这些转化子的孢子接种在木霉纤维素酶诱导培养液(该木霉纤维素酶诱导培养液的PH值为4. 8，用乳糖作为诱导物)，在三角瓶中培养后，采样离心，取上清液进行SDS-PAGE电泳分析，同时上清液用偶氮酪蛋白作底物测定蛋白酶活力。
在本发明的另一方面，提供一种上述里氏木霉蛋白酶在啤酒糖化中的应用。本发明设计SEQ ID NO 2和SEQ ID NO 3所示的核苷酸序列或其互补链为引物， 以里氏木霉基因组DNA为模板进行PCR扩增，然后进行里氏木霉蛋白酶表达质粒的构建，再进行里氏木霉的转化与蛋白酶高产菌株的筛选，由此得到的里氏木霉蛋白酶经实验验证在啤酒糖化中效果明显。
图1是本发明实施例1中蛋白酶(ProB)高效表达质粒pTrProB的示意图。图2是本发明实施例1中SDS-PAGE分析蛋白质条带的示意图。图3是本发明实施例1中蛋白酶ftOB的PH特性分析示意图。
具体实施例方式以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆实验室手册(New York :Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例1里氏木霉蛋白酶ftOB的制备一 .微生物和质粒材料用于克隆的大肠杆菌DH5ci由^witrogen公司提供。用于提供蛋白酶基因资源和高效表达宿主为里氏木霉RUT C-30，WAmerican Type CultureCollection(ATCC)购买， 起始质粒批pBluescipt KS ( —)从Mratagene公司购买。二 .基因 proB 发现通过蛋白酶基因针对里氏木霉基因组序列进行同源性分析，发现由里氏木霉基因组编码的蛋白质121495可能为一蛋白酶。该蛋白质的序列如SEQ ID NO. 1所示(SEQ ID NO. 1表示里氏木霉蛋白酶的氨基酸序列)。三.里氏木霉蛋白酶基因表达质粒的构建用合成方法得到两种脱氧核糖核苷酸链TrAlpFl (CAACCGCGGACTGCGCATCATGGCCA GCCTTCGCCT，如 SEQ ID N0. 2 所示)和 TrAlpRl (ATGCTCGAGTTAA GCACTGTTCCCGTTGAAGjn SEQ ID N0. 3所示)，以上引物委托Sigma Chemical公司合成，然后以这两种脱氧核糖核苷酸链为引物，以里氏木霉RUT C-30基因组DNA为模板，PCR放大一条1. 4kb的DNA分子 (PCR扩增的反应条件为95°C预变性5min ；94°C变性45s，59°C退火30s，72°C延伸45s，30个循环；最后72°C延伸5min)，由于TrAlpFl有Sac II酶切位点，而TrAlpRl含XhoI酶切位点，此 DNA 和质粒批 pT3C (accession number, EF127523, Li etal. , 2007. Appl. Microbiol. Biotechnol. 74 :1264-1275)由Sac II和XhoI限制性内切酶降解后，用琼脂糖凝胶分离 PCR放大并降解的带及pT3C降解后的10. O和0. 7kb的两条带。10. Okb条带从胶中切割和提纯，然后和PCR 1.41Λ带通过T4DNA连接酶连接，转化大肠杆菌DH5ci通透细胞，通过分析八个转化子中的质粒，得到两个质粒具有所需的编码预测蛋白酶的基因，原始的PT3C 3’ 端I3StI位点，通过突变转换成BioI位点。构建的质粒命名为pTrfrobB，蛋白酶(ProB)高效表达质粒PTrProbB如图1所示。
四、里氏木霉的转化与蛋白酶高产菌株的筛选本发明使用了里氏木霉RUT C-30为宿主细胞，本发明采用化学转化的方法 (Penttila et al.，1987 Gene 61 :155-164)将用 EcoRI 降解 pTrProbB 后的质粒片段转入宿主细胞，然后在含有潮霉素B的PDA培养基上培养，5天后将生长旺盛的菌落接种置PDA 培养基上，通过6天生长和发芽，将绿色孢子再转移到新鲜PDA培养基上，以分离纯化转代稳定的转化子。通过此方法，得到15个转代稳定的转化子，将这些转化子的孢子接种在木霉纤维素酶诱导培养液，此培养液PH 4. 8，用乳糖作为诱导物。在三角瓶中培养6天后，采样离心后，取上清液，用聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)加考马斯蓝染色，通过此分析，看到15个转化子中第8和第10两个转化子生产了一条分子量大约为30kDa的蛋白带(见图 2)。同时上清液用偶氮酪蛋白作底物测定蛋白酶活力(见表1)。可见，第8和第10转化降解此底物的活力明显高于其他转化子或起始宿主。表1里氏木霉RUT C-30转化子上清液蛋白含量与蛋白酶活力
权利要求
1.一种里氏木霉蛋白酶，其特征在于，它的氨基酸序列如SEQ ID NO. 1所示，或者具有 SEQ ID NO. 1所示序列80%同源性以上的氨基酸序列。
2.一种用于构建权利要求1所述里氏木霉蛋白酶表达质粒的引物，其特征在于，其序列为上游5，-CAACCGCGGACTGCGCATCATGGCCAGCCTTCGCCT-3，(如 SEQ ID NO 2 所示)或其互补链；下游5，-ATGCTCGAGTTAA GCACTGTTCCCGTTGAAG-3，(如 SEQ ID NO 3 所示)或其互补链。
3.—种如权利要求1所述的里氏木霉蛋白酶的制备方法，其特征在于，该方法包括如下步骤1)里氏木霉基因扩增；2)里氏木霉蛋白酶表达质粒的构建；3)里氏木霉的转化与蛋白酶高产菌株的筛选。
4.如权利要求3所述的里氏木霉蛋白酶的制备方法，其特征在于，步骤1)具体为设计SEQ ID NO :2和SEQ ID NO :3所示的核苷酸序列或其互补链为引物，以里氏木霉基因组 DNA为模板进行PCR扩增。
5.如权利要求4所述的里氏木霉蛋白酶的制备方法，其特征在于，所述PCR扩增的反应条件为95°C预变性5min ；94°C变性45s，59°C退火30s，72°C延伸45s，30个循环；最后72°C 延伸5min。
6.如权利要求3所述的里氏木霉蛋白酶的制备方法，其特征在于，步骤幻具体为将步骤1)所得的PCR产物由Mc II和B10I限制性内切酶降解后，用琼脂糖凝胶分离，纯化回收连接，然后通过T4 DNA连接酶连接，转化大肠杆菌DH5 α通透细胞，通过分析筛选提取质粒，完成里氏木霉蛋白酶表达质粒的构建。
7.如权利要求3所述的里氏木霉蛋白酶的制备方法，其特征在于，步骤3)具体为首先，用EcoRI降解步骤幻构建的质粒形成质粒片段，采用化学转化方法将该质粒片段转入里氏木霉RUT C-30宿主细胞；然后在含有潮霉素B的PDA培养基上培养，再将生长旺盛的菌落接种置PDA培养基上，通过生长和发芽，将绿色孢子再转移到新鲜PDA培养基上，以分离纯化转代稳定的转化子，将这些转化子的孢子接种在木霉纤维素酶诱导培养液，在三角瓶中培养后，采样离心，取上清液进行SDS-PAGE电泳分析，同时上清液用偶氮酪蛋白作底物测定蛋白酶活力。
8.如权利要求7所述的里氏木霉蛋白酶的制备方法，其特征在于，所述木霉纤维素酶诱导培养液的PH值为4. 8，用乳糖作为诱导物。
9.一种如权利要求1所述的里氏木霉蛋白酶在啤酒糖化中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种蛋白酶，它的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，或者具有SEQ ID NO.1所示序列80％同源性以上的氨基酸序列。此外，本发明还公开了用于构建上述蛋白酶表达质粒的引物，其序列如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示。此外，本发明还公开了该蛋白酶的制备方法，包括如下步骤1)里氏木霉基因扩增；2)里氏木霉蛋白酶表达质粒的构建；3)里氏木霉的转化与蛋白酶高产菌株的筛选。本发明还公开了上述蛋白酶在啤酒糖化中的应用。
文档编号C12N9/58GK102181419SQ20111002004
公开日2011年9月14日 申请日期2011年1月18日 优先权日2011年1月18日
发明者唐鹏, 张珊嘉, 李新良 申请人:上海尤特尔生化有限公司, 湖南尤特尔生化有限公司