腈水合酶及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种腈水合酶及其应用，该腈水合酶由α亚基和β亚基组成，所述α亚基的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示，β亚基的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示。本发明从博得特氏菌DSM 12804(Bordetella petrii DSM 12804)中克隆到腈水合酶基因，该基因表达后成功获得具有高表达量和高活性而且底物谱广、具手性选择性的腈水合酶。现有腈水合酶一般对脂肪族腈化合物有较高活力，对芳香族的腈化合物一般活力很低。本发明所述的腈水合酶对芳香族腈化合物，尤其是2-异丙基对氯苯乙腈，有较高的催化活力。
【专利说明】腈水合酶及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及基因工程领域，尤其涉及一种腈水合酶及其应用。
【背景技术】
[0002] 腈是一种重要的化合物，在自然界中广泛存在。腈水解的方法主要有化学水解法 和生物转化法，其中，生物转化法主要涉及腈水合酶、酰胺酶和腈水解酶。腈水合酶是以硫 原子和半胱氨酸亚磺酸残基为绝对中心的一类可催化腈水解的酶，可以催化腈水合生成酰 胺，酰胺酶进一步将酰胺催化水解成羧酸化合物，而腈水解酶可以直接催化腈生成羧酸化 合物。通过这些酶的酶促反应可以将腈类物质转化为酰胺、酸、氨基化合物、酯、醇、烯胺等 价值更高、应用范围更广的一些化合物。因此，腈的生物催化水解反应在精细化工产品、医 药中间体、手性化合物的合成以及环境治理等方面具有广泛的应用前景。
[0003] 微生物的腈水合酶作为生物催化剂来应用在有机合成工艺上拥有巨大的潜力，有 着化学方法无法替代的优越性，如：反应条件温和、环境友好、成本低、具有区域和立体选择 性，从而促进了腈水合酶在工业应用中的研制和开发。产腈水合酶微生物的分布是相当广 泛的，如红球菌、假单胞菌、诺卡氏菌、假诺卡氏菌、产碱杆菌、棒状杆菌等，不同来源的腈水 合酶往往有着不同的特性。其中，一些产腈水合酶的微生物已用于丙烯酰胺、烟酰胺、2-氨 基-2,3-二甲基丁酰胺等的生产中。如专利号为US007405064B2的专利文献公开了一种 睾丸酮丛毛单胞菌5-MGAM-4D ;专利号为ZL88106735的专利文献公开了一种玫瑰色红球 菌J-I ;专利号为ZL86100062的专利文献公开了一种红球菌S-6、氧化节杆菌和黄色微杆 菌；专利号为ZL99106291. 4的专利文献公开了一种嗜热假诺卡氏菌JCM3095 ;专利号为 ZL03115536. 7的专利文献公开了一种丙酸棒杆菌；专利号为ZL103834600的专利文献公开 了一株恶臭假单胞菌，这些野生菌株都用于丙烯酰胺的生产中。
[0004] 丙烯酰胺作为一种重要的基础化工原料，广泛应用于造纸，装璜以及石油开采等 方面。用生物法生产的丙烯酰胺年产量已经达到了 60万吨以上。在我国，用腈水合酶合成 丙烯酰胺的生物技术虽然起步较晚，但发展很快，2012年统计数据显示，我国生物法生产的 丙烯酰胺占整个丙烯酰胺产量的52%，且逐年增加。专利号为ZL01822031. 2的专利公开了 一系列微生物包括芽孢杆菌属、微球菌属、短杆菌属、假单胞菌属、假若卡氏菌属及红球菌 属微生物在反应温度为KTC条件下催化生产烟酰胺。烟酰胺属于B族维生素，在体内以辅 酶I及辅酶II的形式参与机体代谢，被广泛应用在医药，食品添加剂及饲料生产上。专利 号为ZL201210239547. 8的专利公开了一株野生菌株庆笙红球菌CCTCC No :M2010050用于 催化水合制备2-氨基-2, 3-二甲基丁酰胺，其是咪唑啉酮类超高效除草剂的中间体。
[0005] 虽然利用野生菌株工业化生产酰胺类化合物的工艺已得到了广泛的应用，但是， 上述工艺普遍存在野生菌株的腈水合酶的酶活稳定性差，对底物和产物的耐受性不高，以 及间歇化生产，产品质量不够稳定等问题。此外，在野生菌株中除腈水合酶外，还存在酰胺 酶和腈水解酶，其可以造成副产物羧酸类化合物的积累，从而降低了酰胺类化合物的产率 和纯度，同时也增加分离纯化的难度和生产成本。随着分子生物学的迅猛发展，利用基因重 组技术，构造具有腈水合酶活性的新型基因工程菌株并进行蛋白质工程改造，有望可以在 不同程度上解决实际生产问题，比如提高酶的表达水平、增强酶的热稳定性以及对底物和 产物的耐受性、阻断副反应的发生；另外，基因工程菌的适应性强、发酵周期短，有利于实现 大规模培养和工业化生产，也有助于与后续新工艺配合降低酶的生产和分离成本等。
【发明内容】
[0006] 本发明提供了一种具有R-异构体立体选择性的、活力高、底物谱广的腈水合酶。
[0007] 一种腈水合酶，由α亚基和β亚基组成，所述α亚基的氨基酸序列如SEQ ID NO. 6所不，β亚基的氣基酸序列如SEQ ID NO. 7所不。
[0008] 编码所述腈水合酶的基因包含碱基序列如SEQ ID NO. 1所示的编码α亚基的 基因和如SEQ ID NO. 2所示的编码β亚基的基因。该碱基序列来源于博得特氏菌DSM 12804(Bordetella petrii DSM 12804)，由 1429 个碱基组成，自 5'端第 1 位到 762 位碱基 编码腈水合酶α亚基；自5'端第773位到1429位碱基编码腈水合酶β亚基，碱基序列如 SEQ ID NO. 3 所示。
[0009] 所述的腈水合酶的基因还包含编码腈水合酶激活子的碱基序列。所述的腈水合酶 激活子的碱基序列如SEQ ID NO. 4所示，该激活子基因对于腈水合酶基因的高效表达至关 重要。
[0010] 为了提高表达活性，所述的腈水合酶基因 （SEQ ID NO. 3)经修饰后连接有激活子 基因 （SEQ ID NO. 4)，得到如SEQ ID NO. 5所示的碱基序列。
[0011] 本发明提供了一种腈水合酶激活子，氨基酸序列如SEQ ID NO. 8所示。
[0012] 本发明还提供了一种编码所述腈水合酶的基因的表达盒、重组载体和转化子。
[0013] 本发明所述的载体可以是 pET-30a(+)，pET-21a(+)，pET-22b(+)，pET-28a(+)， pETDuet-1，pACYQ)uet_l，pQ)FDuet_l和RSFDuet-1，但不仅限于所述的这些载体。较佳的 是将PCR扩增到的经修饰后的腈水合酶基因连接在表达载体pET-30a (+)上，形成重组表达 载体 pET_30a (+) -NHaseP。
[0014] 本发明所采用的宿主细胞为大肠杆菌，优选为E.coli BL21(DE3)菌株。将 上述重组表达载体pET-30a(+)-NHaseP转化E. coli BL21 (DE3)感受态细胞，其中 含有pET-30a(+)-NHaseP重组质粒的菌株，即为基因工程菌E. coli BL21 (DE3)/ pET-30a(+)-NHaseP。此菌株可在常规的IPTG诱导条件下高效表达腈水合酶蛋白。该基 因工程菌E. coli BL21 (DE3)/pET-30a(+)-NHaseP的液体培养基配方为：蛋白胨10g/L，酵 母提取物5g/L，NaCl 10g/L，pH为7. 0。培养工程菌的温度为35?40 °C，转速为180? 220rpm〇
[0015] 本发明又提供了一种所述的腈水合酶在催化腈化合物水合反应生成酰胺中的应 用。
[0016] 所述的腈化合物如式（I)或（II)所示：
[0017]
【权利要求】
1. 一种腈水合酶，由a亚基和e亚基组成，其特征在于，所述a亚基的氨基酸序列如 SEQ ID NO. 6所示，0亚基的氨基酸序列如SEQ ID NO. 7所示。
2. -种腈水合酶激活子，其特征在于，氨基酸序列如SEQ ID NO. 8所示。
3. 如权利要求1所述的腈水合酶在催化腈化合物水合反应生成酰胺中的应用。
4. 如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的腈化合物如式⑴或（II)所示：
式⑴中： X为OH，H，NH2或者烷基； R'为H或具有1-3个C原子的烷基； R为H或任选地H被NH2取代的具有1-12个C原子的烷基； 式（II)中： R"为单核或双核的不饱和环，其具有6-12个C原子，且其任选地H被1个或2个Cl、 Br或F取代。
5. 如权利要求4所述的应用，其特征在于， 式⑴中： X为OH，H，順2或者具有1-3个C原子烷基； R'为H或具有1-3个C原子的烷基； R为H或任选地H被NH2取代的具有1-6个C原子的烷基； 式（II)中： R"为单核或双核的不饱和环，其具有6-12个C原子，且其任选地H被1个或2个的 Cl、fo或F取代。
6. 如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的腈化合物为丙烯腈、3-氰基吡啶、 2-异丙基对氯苯乙腈和a -甲基苯乙腈中的一种。
7. 如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述的腈化合物为2-异丙基对氯苯乙腈。
【文档编号】C12N9/88GK104498466SQ201410758150
【公开日】2015年4月8日 申请日期:2014年12月11日 优先权日:2014年12月11日
【发明者】杨立荣, 郭法谋, 王丽燕, 吴坚平, 徐刚 申请人:浙江大学